专利摘要

本发明公开了一种米曲霉脂肪酶突变体及在拆分(R,S)‑2‑(4‑羟基苯氧基)丙酸酯制备(R)‑2‑(4‑羟基苯氧基)丙酸酯中的应用，所述突变体是将SEQIDNO.1所示氨基酸序列第38位或第230位进行定点饱和单突变或多突变获得的。本发明通过比较突变体酶AOL‑3F38N、AOL‑3F38N‑V230R和未突变酶AOL‑3的水解能力，结果发现突变体酶AOL‑3F38N、AOL‑3F38N‑V230R的水解活性是未突变脂肪酶的3.4倍和4.0倍，改造后的脂肪酶的热稳定性在50℃以后表现的更好，(R)‑2‑(4‑羟基苯氧基)丙酸酯产率提高，更加适合工业化生产。

权利要求

1.一种米曲霉脂肪酶突变体，其特征在于所述米曲霉脂肪酶突变体为下列之一：(1)SEQ ID NO.1所示氨基酸第38位的苯丙氨酸分别突变为亮氨酸、组氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸；(2)SEQ ID NO.1所示氨基酸第230位的颉氨酸突变为甘氨酸、异亮氨酸、精氨酸、脯氨酸、组氨酸；(3)SEQ ID NO.1所示氨基酸第38位的苯丙氨酸突变为天冬酰胺，第230位的颉氨酸分别突变为精氨酸、脯氨酸。

2.如权利要求1所述米曲霉脂肪酶突变体，其特征在于所述米曲霉脂肪酶突变体为下列之一：SEQ ID NO.1所示氨基酸第38位的苯丙氨酸分别突变为天冬酰胺；SEQ ID NO.1所示氨基酸第38位的苯丙氨酸突变为天冬酰胺同时第230位的颉氨酸突变为精氨酸。

3.一种权利要求1所述米曲霉脂肪酶突变体在拆分(R,S)-2-(4-羟基苯氧基)丙酸乙酯制备(R)-2-(4-羟基苯氧基)丙酸乙酯中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述应用的方法为：以含米曲霉脂肪酶突变体基因的工程菌经诱导培养获得的湿菌体超声破碎后的纯酶为催化剂，以(R,S)-2-(4-羟基苯氧基)丙酸乙酯为底物，以pH7.5-8.0的Tris-HCl缓冲液为反应介质构成反应体系，在30-40℃金属浴、800rpm条件下反应，反应结束后，转化液分离纯化，获得(R)-2-(4-羟基苯氧基)丙酸乙酯。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述反应体系中，纯酶用量以反应体系总体积计为50～250U/ml，所述底物体积用量以反应体系总体积计为1～10％。

6.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述催化剂制备方法为：将含有米曲霉脂肪酶突变体基因的工程菌接种到LB液体培养基中，37℃培养10h，将培养液以体积浓度1％的接种量转接到LB培养基，37℃培养至OD600为0.6-0.8时，加入终浓度0.1mM的IPTG，并将培养温度降到28℃，培养12h，收集湿菌体，超声破碎，离心，取上清进行镍离子亲和层析，得到米曲霉脂肪酶突变体纯酶。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述超声破碎条件为：功率100W、破2s，停6s，共破碎10min。

8.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述镍离子亲和层析方法为：取上清上样至预平衡的镍柱中，分别用含300mM NaCl的50mM pH8.0的Tris-HCl缓冲溶液配制成的5mM咪唑、40mM咪唑、100mM咪唑、250mM咪唑、500mM咪唑洗脱杂蛋白和目的蛋白，收集250mM咪唑的流出液，经10KDa的超滤膜浓缩20倍，浓缩液即为米曲霉脂肪酶突变体纯酶。

一种米曲霉脂肪酶突变体及其应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。