专利摘要

本发明提供了一种枯草芽孢杆菌(BacillussubtilisIFE122)及及其制备L‑薄荷醇的方法，所述枯草芽孢杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2019年06月06日，保藏编号为CGMCCNo.17904。枯草芽孢杆菌制备L‑薄荷醇的方法过程稳定，制备中ee值达到了99.49％，克服了极性溶剂转化会产生的副作用，如水解、外消旋化等，也降低了产品的提纯难度。

权利要求

1.一种枯草芽孢杆菌制备L-薄荷醇的方法，其特征在于：

所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis IFE122)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2019年06月06日，保藏编号为CGMCC No.17904

具体步骤如下：

(1)种子培养：取-80℃保存的枯草芽孢杆菌菌种，40℃水中融化；在种子培养基中进行种子培养，其中装液量20％，30℃下，150rpm培养过夜活化，得到培养液；

(2)发酵培养：取培养液加入发酵培养基中进行发酵培养，其中装液量为20％，30℃下，150rpm培养24h，得到发酵液；

(3)制备L-薄荷醇：用陶瓷膜过滤发酵液，随后连续加入水洗涤菌体，得到菌体悬浮液，转移至催化罐中，加入磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液；

将底物DL-薄荷乙酸酯溶于反应溶剂，随后将此混合溶液转移至催化罐中，添加水使反应液体积达到催化罐额定体积，温度控制于20-40℃，开始催化反应；

反应过程中，控制反应pH为6.5；反应20h后，转移至萃取罐，加入两倍体积的乙酸乙酯萃取，得到L-薄荷醇；

所述种子培养基的组成为：蛋白胨10.0，酵母粉5.0，NaCl 10.0，单位为g/L，pH 7.0，121℃，20min，高压蒸汽灭菌；

所述发酵培养基的组成为：蛋白胨5.0，酵母粉2.0，(NH4)2SO4 2.0，蔗糖3.0，无水K2HPO42.0，NaCl 1.0，无水MgSO4 0.2，橄榄油10，单位为g/L，其中橄榄油为分装后单独加；pH7.0，115℃，20min，高压蒸汽灭菌；

所述磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液的浓度为0.05-0.1mol/L，加入量为催化罐体积的20-40％；

所述底物的浓度为1000-2000ppm；

所述反应溶剂为甲醇，所述反应溶剂的添加量为使其终浓度为20wt％。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：加入反应溶剂的同时，加入活化离子，活化离子的添加量为使其终浓度为5mmol/L。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述活化离子为K+或者NH4+。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：控制反应pH为6.5的方法为添加KOH溶液。

说明书

技术领域

本发明涉及L-薄荷醇制备技术领域，尤其是涉及枯草芽孢杆菌及枯草芽孢杆菌制备L-薄荷醇的方法。

背景技术

薄荷醇(C₁₀H₂₀O，分子量156.4)，又名为薄荷脑，学名为5-甲基-2-异丙基环己醇，是薄荷精油发挥作用的主要成分，其存在的状态以游离状态和酯的形式为主。作为较重要的萜烯类手性香料，薄荷醇在精细化工、饮料食品和医药上具有广泛的应用。薄荷醇分子结构上存在着3个手性中心，因此化学合成后将存在8个立体异构体。在8个立体异构体中，L-薄荷醇拥有独特的薄荷型香气和强烈的清凉效果，味道新鲜轻快；在使用功效上，L-薄荷醇还具有抑菌止痒、镇痛醒脑、助消化、促渗透作用。

一般而言，工业化制备单一构型手性药物必须面对两个难题：一个是技术问题，生产手性药物的技术路线要合理可行，应有较高的拆分收率、好的产品光学纯度；二是成本问题，生产所需的原料和拆分催化剂要便宜、易获得，拆分工艺要简单、可行，并能够充分利用产品的对映异构体，减少损失。缺少二者之一，就无法实现工业大规模的生产。

近年来，微生物菌株制备手性药物成为研究热点。对底物具有选择性是微生物菌株最重要的特点之一，其选择性体现在三个方面：作用于菌株本身的选择性、催化区域的选择性以及底物立体结构的选择性。这些选择性由菌株、底物的分子结构以及影响二者结合的因素所决定。

作用菌株的选择性一般是指不同菌种会因各自性能不同，对同一底物的水解活性产生差异。催化区域的选择性是指微生物作用于底物分子结构的部位不同，其活性也不一样。例如，脂肪酶在对甘油三酯进行水解时，甘油三酯有三种不同的酯键：Sn-1、Sn-2、Sn-3；有两种水解类型的脂肪酶：一是识别和水解Sn-1位和Sn-3位酯键的脂肪酶，制得较不稳定的2-甘油单酯或1,2-甘油二酯或2,3-甘油二酯，因为酯上的酸会从Sn-2位转移到Sn-1或Sn-3位；另一种是仅能作用于Sn-2位酯键的脂肪酶。底物立体结构的选择性指微生物能够特异性地识别消旋混合物中的某一种异构体，并对其产生作用，从而达到手性拆分的目的。

微生物在有机溶剂中进行催化转化，是一用于生产各种工业产品研究的新兴领域。有机溶剂对活细胞非常苛刻，因为它们能够结合细胞膜并影响其完整性和稳定性。有机溶剂将破坏各种生物膜，并降低屏障的通透性，导致细胞代谢损伤，生长抑制，最后到细胞死亡。尽管存在一些更加不利的影响，但一些细菌具有有机溶剂耐受的能力，能够在这些有毒溶剂的存在下生长。

不同的微生物在不同的有机溶剂中表现不同，在不同的反应系统中具有不同的抵抗能力。值得注意的是，不仅单单只有log P，累积效应的各种其他参数，如介电常数，偶极矩，氢结合和极化率，都将影响有机溶剂系统中的微生物活性。除了log P值，溶剂极性、变性能力、疏水性、和极性指数也是决定生物催化剂在有机介质中的稳定性和催化潜力的主要因素。

同一微生物对不同的有机溶剂有着不同的敏感性，因此，筛选可在不同类型的有毒有机溶剂中以高活性有效工作的微生物也是实验的重点。一些细菌菌株能够在短链醇如丁醇和其它有毒溶剂如苯和甲苯的存在下存活。同时，微生物在有机相中进行催化，会有许多因素不利地影响催化功能。大多数微生物在有机溶剂的存在下，更容易变性和失活。

基于上述问题，需要寻求一种在有机溶剂中具有高生物活性、高稳定性、催化能力强的L-薄荷醇菌株。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本申请提供了枯草芽孢杆菌及枯草芽孢杆菌制备L-薄荷醇的方法，克服了极性溶剂转化会产生的副作用，如水解、外消旋化等，也降低了产品的提纯难度。

本发明的技术方案如下：

一种制备L-薄荷醇的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis IFE122)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2019年06月06日，保藏编号为CGMCC No.17904。

上述枯草芽孢杆菌制备L-薄荷醇的方法，其特征在于具体步骤如下：

(1)种子培养：取-80℃保存的枯草芽孢杆菌菌种，40℃水中融化；在种子培养基中进行种子培养，其中装液量20％，30℃下，150rpm培养过夜活化，得到培养液；

(2)发酵培养：取培养液加入发酵培养基中进行发酵培养，其中装液量为20％，30℃下，150rpm培养24h，得到发酵液；

(3)制备L-薄荷醇：用陶瓷膜过滤发酵液，随后连续加入水洗涤菌体，得到菌体悬浮液，转移至催化罐中，加入磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液；

将底物DL-薄荷乙酸酯溶于反应溶剂，随后将此溶液转移至催化罐中，添加水使反应液体积达到催化罐额定体积，温度控制于20-40℃，开始催化反应；

反应过程中，控制反应pH为6.5；反应20h后，转移至萃取罐，加入两倍体积的乙酸乙酯萃取，得到L-薄荷醇。

进一步的，所述种子培养基的组成为：蛋白胨10.0，酵母粉5.0，NaCl 10.0，单位为g/L，pH 7.0，121℃，20min，高压蒸汽灭菌；

所述发酵培养基的组成为：蛋白胨5.0，酵母粉2.0，(NH4)₂SO₄ 2.0，蔗糖3.0，无水K₂HPO₄ 2.0，NaCl 1.0，无水MgSO₄ 0.2，橄榄油10，单位为g/L，其中橄榄油为分装后单独加；pH 7.0，115℃，20min，高压蒸汽灭菌。

进一步的，所述磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液的浓度为0.05-0.1mol/L，加入量为催化罐体积的20-40％。

进一步的，所述底物的浓度为1000-2000ppm。

进一步的，所述反应溶剂为甲醇，所述反应溶剂的添加量为使其终浓度为20wt％。

进一步的，加入反应溶剂的同时，加入活化离子，活化离子的添加量为使其终浓度为5mmol/L。优选的，所述活化离子为K⁺或者NH₄⁺。

进一步的，控制反应pH为6.5的方法为添加KOH溶液。

本发明有益的技术效果在于：

1、本发明利用有机溶剂甲醇低沸点的特性，便于产物的回收，降低提纯成本；且增加了非极性底物DL-薄荷乙酸酯的溶解度，使反应转化率更快。本发明逆转了水解反应的热力学平衡，使反应更倾向于一方；抑制了需水参与的副反应，如活泼基团的水解、醌的聚合反应、或酰基转移反应；改变了底物特异性；对映选择性高，同时消除反应过程中，微生物污染。

2、在菌体催化水解的反应中，有机溶剂对反应的速率、选择性以及产率都有较大的影响。一方面，溶剂的存在，可能会夺取维持微生物分子构象所需的必须水，从而导致微生物活性降低或失活，最为关键的是，会对微生物的立体选择性产生较大的影响；另一方面，在本反应中，DL-薄荷乙酸酯水解后，会产生乙酸，如果所加溶剂能够与乙酸反应，会降低反应体系中的乙酸浓度，这样既可促进反应向着水解反应的方向进行，又可维持反应的pH；最后，DL-薄荷乙酸酯作为反应底物，在水相的溶解度不高，这将导致整个反应为一两相反应，这将大大降低反应的效率。

附图说明

图1为脂肪酶不对称水解DL-薄荷乙酸酯的过程示意图。

图2为菌种不对称水解DL-薄荷乙酸酯反应过程中的GC谱图。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明进行具体描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：枯草芽孢杆菌的筛选：

(1)初筛：筛自土壤的枯草芽孢杆菌菌株，保藏于-80℃冰箱。取-80℃冰箱保存的菌种，40℃水中融化；250mL摇瓶，20％装液量(种子培养基：(g/L)：蛋白胨10.0，酵母粉5.0，NaCl 10.0，pH 7.0，121℃，20min，高压蒸汽灭菌)，接种量50μL，30℃下，150rpm培养过夜活化；

取培养液100μL加入250mL摇瓶中，装液量为20％(发酵培养基：(g/L)：蛋白胨5.0，酵母粉2.0，(NH4)₂SO₄ 2.0，蔗糖3.0，无水K₂HPO₄ 2.0，NaCl 1.0，无水MgSO₄ 0.2，橄榄油10(分装后，单独加)，pH 7.0，115℃，20min，高压蒸汽灭菌)，30℃下，150rpm培养24h；

取发酵培养液25mL离心(8000rpm，5min)，去上清，所得菌体沉淀装入50mL锥形瓶中，加入20mL浓度为0.1mol/L的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，以及20μL的DL-薄荷乙酸酯，使得底物浓度为1000ppm，保鲜膜封口，30℃，150rpm进行水解。20h后，加入同等体积的乙酸乙酯萃取，取上清进行GC分析。图1为脂肪酶不对称水解DL-薄荷乙酸酯的过程示意图。

(2)复筛：从初筛中挑选出能够分解薄荷已酸酯的菌种，通过平板分离(平板培养基：同种子培养基，另加入18g/L的琼脂)，纯化菌种，保藏；气相色谱仪换上手性CP柱，与初筛实验过程相同，确定菌种的选择性以及转化率。

(3)DL-薄荷醇拆分体系的分析方法：

本发明的转化率、e.e.p等都是通过气相峰面积测定而得。其中萃取溶剂的确定方法为：

以消旋薄荷醇乙酸酯(乙醇为溶剂)为内标，通过添加回收实验，确定萃取溶剂为乙酸乙酯，进样量为1μL，下表1为添加回收实验的结果：

表1添加回收实验

A＝L-薄荷醇的峰面积/DL-薄荷已酸酯的峰面积，其中，A₁为加入菌体后，再分离、检测出的比值；A₂为500μL L-薄荷醇(100ppm)与500μL DL-薄荷乙酸酯(100ppm)混合后，检测的比值。

本发明采用FULI 9790气相色谱仪进行分析，检测器为FID，手性柱为CP-Cyclodextrin-B-2,3,6-M-19，50m 0.25mm 0.25μm P/N:CP7501。在进行分析之前，确定了气相分析的柱温、检测器温度、进样温度等，经优化，采用下述气相色谱条件：升温程序：90℃，5min；90℃-160℃，4℃/min；160℃，1min；160℃-170℃，1℃/min；170℃，1min；检测器的温度为250℃；进样温度为250℃；载气为氮气；进样量1μL。图2为微生物不对称水解DL-薄荷乙酸酯反应过程中的GC谱图。

本发明采用的CP色谱柱能够较好地将DL-薄荷醇峰以及DL-薄荷乙酸酯峰分离，因此可以通过测量DL-薄荷醇峰以及DL-薄荷乙酸酯峰的面积，从而计算转化率以及对映体过剩值(e.e._p)。

转化率计算公式：

转化率＝L-薄荷醇峰面积/(L-薄荷醇峰面积+L-薄荷乙酸酯峰面积)×100％

对映体过剩值(e.e._p)计算公式：

e.e._p＝∣A_L-A_D∣/(A_L+A_D)

式中，A_L、A_D分别是GC谱图中，L-薄荷醇、D-薄荷醇对应的峰面积。

通过对菌种的筛选，初步确定了六株具有催化水解薄荷已酸酯活性菌株；复筛后，确认其手性拆分能力，其中有两株菌对底物的作用效果较好，但在后续的重复实验中发现IFE122菌种在发酵培养基的生长较为稳定，故确定IFE122菌株进行后续的实验。

枯草芽孢杆菌的16S rDNA分子生物学鉴定：

PCR扩增产物，用SanPre柱式DNA胶回收试剂盒，纯化方式按照试剂盒说明书。纯化后送至上海生工生物工程股份有限公司进行序列测序，测序结果与枯草芽孢杆菌的序列相似性高于99％。

实施例2：催化水解制备L-薄荷醇的溶剂选择

将实施例1发酵培养液25mL离心(7000rpm，10min)，去上清，所得菌体置于50mL锥形瓶中，加入20ml浓度为0.1mol/L的缓冲液磷酸氢二钠-磷酸二氢钠与底物DL-薄荷乙酸酯，使得底物浓度为2000ppm，分别加入水、有机反应溶剂甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇、丙酮、或DMSO，使它们的终浓度为20wt％，封口膜封口，30℃，150rpm进行水解，反应过程中，用0.1mol/L的KOH溶液控制反应pH为6.5。20h后，加入两倍体积有机溶剂乙酸乙酯萃取，气相CP手性柱检测，测定酶活与e.e._p。结果如表2所示。

表2不同有机溶剂对酶催化的影响

其中酶活(Enzyme activity(U/L))是指酶催化一定化学反应的能力，1分钟内转化1微摩尔底物所需的酶量为一个活力单位(U)，酶催化的转化速率越快，酶的活力就越高；反之，速率越慢，酶的活力就越低。

由表2可知，枯草芽孢杆菌湿菌体在不同有机溶剂中的催化活性有很大的区别，其中以在甲醇为溶剂的体系中，酶的选择性和转化率最高，乙醇次之。

通过上述实验，确定甲醇为反应的最佳有机溶剂，之后，为进一步提高酶的选择性和产率，测试不同浓度甲醇对酶活的影响，测试质量浓度为：5％、10％、15％、20％、25％、30％，作为手性催化，首要考虑的因素应是酶催化的选择性，在选择性较高的基础上，再选择较高产率，故确定甲醇的添加量为20％。

以2000ppm DL-薄荷乙酸酯为底物，30℃全细胞催化20h，添加终浓度为20wt％的甲醇，转化率为74％，产物e.e.p达到了99.24％。

实施例3：加入活化离子的制备过程

将实施例1发酵培养液25mL离心(7000rpm，10min)，去上清，所得菌体置于50mL锥形瓶中，加入20ml浓度为0.1mol/L的缓冲液磷酸氢二钠-磷酸二氢钠与底物DL-薄荷乙酸酯，使得底物浓度为2000ppm，加入有机反应溶剂甲醇，使其浓度为20wt％，再分别加入活化离子K⁺、Na⁺、NH₄⁺等，活化离子的添加量为终浓度5mmol/L；封口膜封口，30℃，150rpm进行水解，反应过程中，用0.1mol/L的KOH溶液控制反应pH为6.5。20h后，加入两倍体积有机溶剂乙酸乙酯萃取，气相CP手性柱检测，测定酶活与e.e._p。结果如表3所示。

表3不同有离子添加对酶催化的影响

实施例4：扩大实验

将实施例1的种子培养和发酵培养的规模扩大1000倍，用陶瓷膜过滤除去大部分发酵液，随后连续加入水洗涤菌体，得到菌体悬浮液，转移至50-L催化罐中。加入20L浓度为0.1mol/L缓冲液磷酸氢二钾-磷酸二氢钾，将DL-薄荷乙酸酯溶于甲醇，随后将此溶液转移至催化罐中，用水将反应液体积定容至50L。其中DL-薄荷乙酸酯的浓度为2000ppm，甲醇的终浓度为20wt％。

催化罐温度控制于30℃，开始催化反应，反应过程中，用浓度为1M的KOH控制反应pH保持在6.5。反应20h后，转移至萃取罐，加入两倍体积有机溶剂乙酸乙酯萃取。气相CP手性柱检测，测定转化率与e.e._p。转化率为80％，ee值为99.17％。

实施例5：扩大实验

在实施例4的制备过程中，将DL-薄荷乙酸酯溶于甲醇的同时添加终浓度为5mmol/L的K⁺；其余的过程与实施例4相同。最后得到转化率为85％，ee值为99.35％。

上述制备方法能够达到的优点是：(1)缓冲液的选择K⁺对提升酶活效果较大；(2)将DL-薄荷乙酸酯先溶解于甲醇，再进行催化反应，优于分别加入甲醇和薄荷醇；(3)用KOH调节pH优于NaOH；(4)假设不用陶瓷膜过滤，直接催化，容易造成底物自发水解，因此要进行陶瓷膜过滤并洗涤。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，对于本领域的普通技术人员而言，在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。

一种枯草芽孢杆菌及其制备L-薄荷醇的方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。