专利摘要

本发明涉及纯化包含L－半胱氨酸的发酵液的方法，所述发酵液包含在pH＜5时能氧化L－半胱氨酸的氧化剂，其中将所述包含L－半胱氨酸的发酵液在pH为5－9时与离子交换剂接触，发酵液的pH＜5，优选pH＜2，所述L－半胱氨酸与所述离子交换剂结合，并使用洗脱剂将结合的L－半胱氨酸从离子交换剂上去除。

权利要求

1.纯化包含L-半胱氨酸的发酵液的方法，所述发酵液包含在pH＜5时能氧化L-半胱氨酸的氧化剂，其中将所述包含L-半胱氨酸的发酵液在pH为5至9时与离子交换剂接触，发酵液的pH为pH＜5，优选为pH＜2，所述L-半胱氨酸与所述离子交换剂结合，并使用洗脱剂将结合的L-半胱氨酸从离子交换剂上去除。

2.如权利要求1所述的方法，其中所使用的离子交换剂是酸性或者碱性离子交换剂。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中所使用的离子交换剂是酸性或者强酸性离子交换剂。

4.如权利要求3所述的方法，其中所使用的离子交换剂是H⁺型强酸性离子交换剂。

5.如权利要求4所述的方法，其中所使用的洗脱剂是盐酸水溶液、盐的水溶液、胺、碱或强碱。

6.如权利要求1至5之一所述的方法，其中所使用的洗脱剂首先是1N HCl，其用于洗脱L-半胱氨酸，然后是2N HCl，其用于洗脱L-胱氨酸。

7.如权利要求1至6之一所述的方法，其中首先将得到的溶液浓缩，然后将L-半胱氨酸盐酸盐一水合物自所述的浓缩的溶液中结晶。

8.如权利要求1至7之一所述的方法，其中所述氧化剂是硫-氧化合物。

9.如权利要求8所述的方法，其中所述硫化合物是硫代硫酸盐。

说明书

技术领域

本发明涉及从包含L-半胱氨酸的发酵液中纯化L-半胱氨酸的方法。

背景技术

由于具有极好的水溶性及SH基对许多试剂(例如对氧化剂)的高度敏感性，L-半胱氨酸是仅能非常困难并且成本高昂地纯化和分离的氨基酸。相比之下，即使从复杂的物质的混合物，如蛋白质水解产物或者包含L-胱氨酸的发酵液中氨基酸L-胱氨酸也可以容易地纯化和分离，而且具有极高的纯度，这是由于L-胱氨酸极低的水溶性和对如氧化剂的较高稳定性。例如，DE10040176A1描述了从包含细胞的悬浮液或者发酵液中分离L-胱氨酸的非常简单的方法。

因此，L-半胱氨酸在工业上是由复杂的物质的混合物例如蛋白质水解产物(例如来源于人类的毛发或者动物来源(如羽毛或鬃毛))或者适当的发酵液通过首先分离出纯化态的微溶的L-胱氨酸而生产的。可能存在于这种复杂的物质的混合物中的L-半胱氨酸或者其他L-半胱氨酸衍生物特别地并且尽可能完全地通过例如氧化的方法转变成L-胱氨酸。然后L-胱氨酸通过后续的还原(如通过电解)得到L-半胱氨酸。然而，因为L-半胱氨酸必须通过中间体L-胱氨酸通过复杂的两步方法制备，因此这个方法存在弊端。

EP0250987B1描述了从包含L-半胱氨酸、L-胱氨酸、L-丝氨酸和无机盐的溶液中直接分离L-半胱氨酸的方法。首先，L-胱氨酸和无机盐在至少20℃下通过加入氯化氢结晶并通过过滤去除。然后从剩下的仍然包含L-半胱氨酸和L-丝氨酸的溶液中将L-半胱氨酸盐酸盐一水合物在不高于10℃下以高纯度结晶并分离。然而该方法仅限于包含L-半胱氨酸、L-胱氨酸、L-丝氨酸和无机盐的溶液，而不能从复杂的物质的混合物如蛋白质水解产物或者发酵液中得到高产率和高纯度的L-半胱氨酸。

EP1645623A1、EP1298200B1、US20050221453A1、EP1234874A1和EP1571223A2描述了通过离子交换、结晶以及其他公知方法的组合从发酵液中分离L-半胱氨酸。然而没有给出关于具体步骤以及得到的产率和纯度的信息。

EP1650296A1描述了通过离心或者膜过滤分离去除固体，而后通过离子交换、浓缩和结晶分离和纯化L-半胱氨酸而从发酵液分离L-半胱氨酸的方法。此处同样没有给出关于具体步骤以及得到的产率和纯度的信息。

因此，如何直接并经济地从复杂的物质的混合物例如包含L-半胱氨酸的微生物发酵液中纯化和生产L-半胱氨酸的问题仍没有得到解决。目前仍没有公开适用于工业规模、并且可以从包含L-半胱氨酸的发酵液中以经济、直接并无需衍生化(例如通过氧化得到L-胱氨酸，随后还原得到L-半胱氨酸)的方式而得到高纯度和/或高产率的L-半胱氨酸的方法。

EP0885962B1、EP0858510B1和EP1220940B1描述了用于L-半胱氨酸的发酵生产的方法。这些方法能以经济的方式获得包含大量L-半胱氨酸的发酵液。这种包含L-半胱氨酸的发酵液是极复杂的物质的混合物。除了L-半胱氨酸以外，该发酵液通常还包含容易在发酵的条件下，特别是由于有效氧的氧化作用由L-半胱氨酸形成的L-胱氨酸。此外，如例如EP0885962B1所述，在醛类或者酮类的存在下，可能存在L-半胱氨酸的相应的半酮缩硫醇(hemithioketal)和/或噻唑烷衍生物。发酵液也可能包含少量其他的氨基酸及其衍生物。它们还通常包含碳水化合物、有机和无机的阳离子和阴离子的盐类，例如碱金属盐和碱土金属盐，痕量的重金属盐(如Fe、Cu、Mn、Zn等)，染料和其他杂质和添加剂，如发酵中使用的微生物的不合需要的代谢产物。如例如EP0885962B1、EP0858510B1和EP1220940B1所述，发酵液还可以包含发酵中所使用的原料和成分，例如常用的碳源，如葡萄糖、乳糖、淀粉等，氮源，如氨/铵或蛋白质或蛋白质水解产物等，以及硫源，例如硫化物、亚硫酸盐、硫酸盐、硫代硫酸盐或连二亚硫酸盐等。由于L-半胱氨酸是含硫氨基酸，因此硫源，例如硫化物、亚硫酸盐、硫酸盐、硫代硫酸盐或连二亚硫酸盐，经常在发酵过程中饲入，以提供形成L-半胱氨酸所需的足量的硫。由于在发酵过程中引进了氧气，因此该发酵液还包含溶解氧。如例如EP0885962B1所述，所述发酵液的pH通常为7。

在发酵液或其他液体中，L-半胱氨酸能被任何能够氧化SH基的氧化剂氧化为例如L-胱氨酸。除了作为L-半胱氨酸氧化的主要产物的L-胱氨酸以外，也可能产生更多的L-半胱氨酸和/或L-胱氨酸的更高级的氧化化合物。因此，在包含L-半胱氨酸的发酵液或者包含L-半胱氨酸的溶液中，这种氧化剂的存在的结果是L-半胱氨酸产率的立即降低。

在pH＜5下能氧化SH基(并因此能氧化L-半胱氨酸)的氧化剂的实例是氧气和硫-氧化合物。这些氧化剂通常以可变的量存在于包含L-半胱氨酸的发酵液中。例如如EP0885962B1所述，硫-氧化合物例如硫代硫酸盐在发酵过程中作为硫源直接加入，或者可以产自发酵过程中加入的其他硫源，例如硫化物、亚硫酸盐、硫酸盐、硫代硫酸盐或者连二亚硫酸盐等。因而，例如尤其是硫化物或者硫氢化物有可能被发酵过程中引入的氧气容易地氧化为硫代硫酸盐。硫-氧化合物及其形成的复杂化学过程也已在例如Hollemann-Wiberg，Lehrbuch der AnorganischenChemie，第91至第100版，Walter de Gruyter，Berlin-New York，1985，pp.485-523中详细描述。

L-半胱氨酸尤其容易被作为氧化剂的氧气氧化，优选在高pH情况下。可以通过降低L-半胱氨酸溶液的pH值使该溶液对氧气的氧化作用稳定。例如，已知L-半胱氨酸盐酸盐的水溶液，优选在盐酸中，与例如pH值为7或者更高的L-半胱氨酸水溶液相比对氧气的氧化作用稳定得多。

相比之下，许多硫-氧化合物对SH基以及因此对L-半胱氨酸的氧化力随着pH的降低而增加，在一些情况下特别明显。这些氧化剂可以存在于包含L-半胱氨酸的发酵液或者由其纯化而得到的包含L-半胱氨酸的溶液中，并且例如在发酵过程中出现的pH值下即使氧化也仅以极低程度氧化L-半胱氨酸，但是在一些情况下能随着pH的降低，特别是在pH＜5时，非常好地氧化L-半胱氨酸。

能氧化SH基并因此氧化L-半胱氨酸的硫-氧化合物的实例是例如二氧化硫或三氧化硫。二氧化硫也在亚硫酸盐溶液时释放并从而能氧化SH基。硫代硫酸盐是在L-半胱氨酸的发酵中优选的硫源，而且在pH＞5时、优选在pH＝7时实际上不氧化L-半胱氨酸，当硫代硫酸盐存在于发酵过程中时，在pH＜5时氧化L-半胱氨酸，其氧化能力和氧化速率随着pH的降低而升高。

许多其他的硫-氧化合物及它们(优选在酸性介质中)氧化SH基的能力还在Hollemann-Wiberg，Lehrbuch der Anorganischen Chemie，第91-100版，Walter de Gruyter，Berlin-New York，1985，pp.485-523中描述。

此外，存在许多能催化SH基氧化的化合物。因此，例如已知重金属盐能有效地催化从半胱氨酸到胱氨酸的氧化反应。重金属盐，例如铁盐或者锌盐也经常是发酵中必须的添加剂，因而也通常少量地存在于相应的发酵液中。

如果包含L-半胱氨酸的溶液或者发酵液包含在pH＜5时能将L-半胱氨酸氧化成为例如L-胱氨酸的氧化剂，则若将这样的溶液或者发酵液酸化至pH＜5，会导致产率的立即损失。由于优选的最终产物L-半胱氨酸盐酸盐一水合物由强酸性溶液中结晶，因此取决于与L-半胱氨酸相关的氧化剂的含量，可能损失所存在的L-半胱氨酸的高达100％的产率。

发明内容

本发明的目的是提供简单、经济而且可工业实施的方法，所述方法用于从包含L-半胱氨酸的发酵液制备包含纯化的L-半胱氨酸的溶液。如果需要，有可能随后例如通过结晶从这些溶液中得到固体L-半胱氨酸、L-半胱氨酸盐酸盐或L-半胱氨酸盐酸盐一水合物。

此目的通过以下方法实现：在pH为5到9时，将包含L-半胱氨酸的发酵液与离子交换剂接触，所述发酵液包含在pH＜5时能氧化L-半胱氨酸的氧化剂，发酵液的pH＜5，优选pH＜2，所述L-半胱氨酸结合在所述离子交换剂上，而后通过洗脱剂将结合的L-半胱氨酸从离子交换剂上去除。

可以如上所述得到包含L-半胱氨酸的发酵液。该发酵液借助于离子交换剂纯化，优选是在去除细胞和固体之后。可以使用的离子交换剂是酸性或碱性的离子交换剂。由于L-半胱氨酸是两性化合物，因此用酸性和碱性的离子交换剂来结合和纯化都是可能的。酸性和碱性的离子交换剂是已知并可商购的。Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry，Vol.A14，p.451列举了精选的各种合适的材料。它们包括例如羧酸基团(弱酸性离子交换剂)、磺酸和膦酸基团(强酸性离子交换剂)、季铵基团(强碱性离子交换剂)或者胺基(弱碱性离子交换剂)作为活性离子交换基团。阳离子或者阴离子可以作为活性离子交换基团的相反离子与离子交换剂结合。酸性离子交换剂经常以质子化H⁺型使用，但例如铵离子、碱金属和/或碱土金属离子也是此外的常用的相反离子。碱性离子交换剂，特别是强碱性离子交换剂经常以OH^-型使用，但是例如在现有技术中描述的氯离子和其他阴离子也是此外的常用的相反离子。

优选使用酸性和强酸性离子交换剂，特别优选使用强酸性离子交换剂。为此，将包含L-半胱氨酸的发酵液与强酸性阳离子交换剂接触。这可以通过例如将发酵液泵送过装填有强酸性阳离子交换剂的柱来实现。这里使用的阳离子交换剂优选为H⁺型。然而，原则上也可以使用具有其他相反离子的离子交换剂。

此处所应用的发酵液为pH5-9，优选为pH＝5-7，因为若不是如此，则取决于氧化剂的量，产率可能会由于L-半胱氨酸的氧化而大大减少。

相比而言，仅包含极少量(如果有的话)相应氧化剂的包含L-半胱氨酸的溶液或者发酵液，原则上可以在1-14的任何pH下使用。如果使用强酸性阳离子交换剂，则溶液甚至可以优选在pH 1-5下使用，这是因为在这些pH下，L-半胱氨酸尤其有效地结合离子交换剂，并且在没有干扰性的氧化剂时，不发生氧化作用，因此也不发生L-半胱氨酸损失。

如果包含L-半胱氨酸的溶液或者发酵液与阳离子交换剂，优选为H⁺型强酸性阳离子交换剂接触，L-半胱氨酸在此过程中几乎与阳离子交换剂定量结合。其他氨基酸，例如L-胱氨酸和/或其他可能存在于发酵液中的阳离子也可能与此树脂结合。然而在一些情况下，选择合适的吸附条件(流速、担载量、浓度、温度、树脂等)能显著将这些杂质的结合减到最小。许多其他的杂质，例如中性化合物或者阴离子或者其相应的酸不与树脂结合并存在于洗出液中。另外，阴离子氧化剂或其相应的酸，以及这些氧化剂的降解产物不与阳离子交换剂结合。因此该方法步骤能实现对这些杂质的有效去除。

如果使用H⁺型的强酸性阳离子交换剂，则直接在树脂中的离子交换法导致流经树脂的溶液的pH的强烈变化。因此，参与离子交换过程的包含L-半胱氨酸的溶液或者发酵液的pH以及脱离阳离子交换剂的洗出液的pH通常为pH＜2并甚至常常为pH＜1(参见实施例)。

然后用普通的酸或碱或盐溶液将结合于酸性或者碱性离子交换剂的L-半胱氨酸从树脂上洗脱出来。所使用的酸优选为强酸，特别优选为盐酸。所使用的碱优选为胺类，特别优选为氨。特别适合的是盐酸水溶液、盐的水溶液、胺、碱或者强碱。

当用氨洗脱时，将不同当量浓度的氨水，优选0.1-12N的氨水，特别优选1-2N的氨水，泵过载有L-半胱氨酸的离子交换剂。然后，所得的氨纯化后的L-半胱氨酸溶液可以例如任选地用活性炭脱色并浓缩。而后，L-半胱氨酸可以例如从浓缩的溶液中以高纯度和产率结晶或者用合适的沉淀剂沉淀。

当用盐酸洗脱时，将不同当量浓度的盐酸水溶液，优选0.1-12N HCl，特别优选1-2N的HCl，泵过载有L-半胱氨酸的离子交换剂。

包含L-半胱氨酸的酸性洗出液不再包含任何能在pH＜5时氧化L-半胱氨酸的氧化剂。因此，如现有技术所述，这些溶液也是对L-半胱氨酸的氧化(例如被氧气氧化)稳定的。在pH＜5时能氧化L-半胱氨酸的氧化剂在离子交换剂吸附L-半胱氨酸时被去除或消除，或者在用酸洗脱L-半胱氨酸的过程中以不同的方式被去除或消除。

用盐酸洗脱L-半胱氨酸产生纯化的L-半胱氨酸的HCl溶液。可以任选地将此溶液浓缩和脱色，例如通过活性炭。如果适当，在加入HCl后，结晶出在工业上特别重要的产品——L-半胱氨酸盐酸盐一水合物。

通过分馏洗出液和/或施加梯度，可以获得与原先使用的发酵液中相比显著更高纯度的L-半胱氨酸。例如选择合适的洗脱条件能使得L-半胱氨酸(优选用1N HCl洗脱)和L-胱氨酸(优选用2N HCl洗脱)在柱上彼此分离(同样见实施例7和9)。由于用其他方法例如在L-半胱氨酸盐酸盐一水合物结晶过程中将L-胱氨酸从L-半胱氨酸盐酸盐一水合物中除去极其困难，因此该步骤尤其具有优势。

出人意料地，目前已显示L-半胱氨酸能够从包含在pH＜5时能氧化L-半胱氨酸的氧化剂的溶液中被吸附于离子交换剂，优选阳离子交换剂，特别优选H⁺型强酸性阳离子交换剂，并能被再次洗脱下来而没有明显的氧化，即使在这些方法步骤中包含L-半胱氨酸的发酵液的pH值为pH＜5，优选＜2也是如此。

尤其出人意料地的是，因为当用普通酸(例如盐酸或硫酸)将包含在pH＜5时能氧化L-半胱氨酸的氧化剂的包含L-半胱氨酸的发酵液酸化至pH＜5，优选pH＜2时，观察到L-半胱氨酸向L-胱氨酸的明显氧化，正如所预期的，所述氧化与产率的立即损失相关(见实施例3和5)。这对该方法的经济可行性有着决定性的不良影响。

由本发明方法得到的包含L-半胱氨酸的溶液可以通过蒸馏浓缩或者通过活性炭脱色。也可以将L-半胱氨酸或L-半胱氨酸盐酸盐一水合物从这些溶液中结晶并因此达到另外的纯化的效果。

优选从根据本发明所得的L-半胱氨酸溶液中结晶出L-半胱氨酸盐酸盐一水合物。这包括浓缩根据本发明所述得到的溶液。任选地，在加入盐酸后，及任选地，在冷却至-20℃之后将L-半胱氨酸盐酸盐一水合物优选从这些浓缩液中结晶。如果L-半胱氨酸溶液除L-半胱氨酸以外还包含金属盐和/或铵盐或例如L-胱氨酸，那么有可能通过例如分级结晶(fractionated crystallization)的方法去除这些化合物。这可以按照例如EP0250987B1中所述的那样进行：通过加入盐酸使相应的金属氯化物和/或氯化铵和L-胱氨酸在至少20℃下结晶，过滤去除结晶的化合物，然后通过冷却至-20℃从所得的L-半胱氨酸的HCl溶液中结晶L-半胱氨酸盐酸盐一水合物并分离和干燥后者。

所述方法能有效、高产率、经济地从包含L-半胱氨酸的发酵液中纯化L-半胱氨酸。如果需要的话，可能存在的例如L-半胱氨酸衍生物，例如L-胱氨酸或者噻唑烷衍生物，也可以在特定的工艺条件下转变成L-半胱氨酸，以提高所得的产率。因此，例如EP1059288B1中公开并描述了半胱氨酸的噻唑烷衍生物在强酸性阳离子交换剂上的裂解。通过加入合适的还原剂使L-胱氨酸裂解以得到L-半胱氨酸同样是可能的。

所述方法能将外源氨基酸的含量降低至＜5％，优选＜1％(基于L-半胱氨酸)。此外，也可将盐含量降低至＜10％，优选＜1％(基于L-半胱氨酸)。而且，所述方法使从包含L-半胱氨酸的发酵液制备的L-半胱氨酸或L-半胱氨酸盐酸盐或L-半胱氨酸盐酸盐一水合物的纯度＞98％，并且光学纯度＞99％。

在实施本发明方法前，优选在第一步中从包含L-半胱氨酸的发酵液中去除微生物细胞和不溶成分。这包括例如离心、过滤、滗析、膜过滤或技术人员熟知的从发酵液中去除细胞/固体的其他方法。所述去除方法包括，任选地，加入辅助过滤介质，如Celite^、活性炭或硅藻土。此步骤优选包括从发酵液中除去除细胞外的其他不溶成分，例如从溶液中析出的胱氨酸，或者可能微生物发酵过程中产生的其他微溶成分的沉淀。另外，例如大分子例如蛋白质有可能被去除，或者被吸附于任选地使用的辅助过滤介质或者活性炭等，并由此在此步骤中去除。根据本发明，由该预处理得到的包含L-半胱氨酸的溶液也属于“发酵液”这个术语的范畴。

下列实施例用以进一步举例说明本发明。

实施例

实施例1：包含O₂的L-半胱氨酸溶液的稳定性(pH 1)

通过滴加20％HCl，将100ml L-半胱氨酸在含氧水中的溶液(c＝18g/L)酸化至pH＝1。室温下搅拌5min后，溶液包含18g/L的L-半胱氨酸和＜0.1g/L的溶解的L-胱氨酸。溶液的L-半胱氨酸含量可以稳定24h以上。

实施例2：包含O₂的L-半胱氨酸酸性溶液的稳定性(pH 5)

通过滴加20％HCl，将100ml L-半胱氨酸在含氧水中的溶液(c＝18g/L)酸化至pH＝5。室温下搅拌5min后，溶液包含18g/L的L-半胱氨酸和＜0.1g/L的溶解的L-胱氨酸。室温下搅拌24h后，溶液包含17.6g/L的L-半胱氨酸和0.4g/L的L-胱氨酸。

实施例3：包含硫代硫酸盐的L-半胱氨酸的酸性溶液的稳定性(pH1)

通过滴加20％HCl，将100ml L-半胱氨酸(c＝18g/L)和硫代硫酸铵(c＝2.5g/L硫代硫酸盐)的水溶液酸化至pH＝1。室温下搅拌5min后，该混浊溶液包含12g/L的L-半胱氨酸、＜0.2g/L的硫代硫酸盐和6g/L的溶解的L-胱氨酸。室温下搅拌24h后，L-半胱氨酸的含量降低至＜5g/L。

实施例4：包含硫代硫酸盐的L-半胱氨酸酸性溶液的稳定性(pH 5)

通过滴加20％HCl，将100ml L-半胱氨酸(c＝18g/L)和硫代硫酸铵(c＝2.5g/L硫代硫酸盐)的水溶液酸化至pH＝5。室温下搅拌5min后，溶液包含17.5g/L的L-半胱氨酸、2.4g/L硫代硫酸盐和＜0.5g/L溶解的L-胱氨酸。室温下搅拌24h后，L-半胱氨酸的含量降至16.0g/L。

实施例5：包含硫代硫酸盐的L-半胱氨酸的酸性发酵液的稳定性(pH 1)

通过滴加20％盐酸，将100ml包含微生物，pH为7，并包含18g/L的L-半胱氨酸、2.5g/L硫代硫酸盐和1.1g/L溶解的L-胱氨酸的发酵液酸化至pH＝1，并离心20min(8000rpm/min)去除生物质和固体。所得澄清溶液包含12g/L的L-半胱氨酸、＜0.2g/L的硫代硫酸盐和7g/L的溶解的L-胱氨酸。

实施例6：包含硫代硫酸盐的L-半胱氨酸的酸性发酵液的稳定性(pH 5)

通过滴加20％盐酸，将100ml包含微生物，pH为7，并包含18g/L的L-半胱氨酸、2.5g/L硫代硫酸盐和1.1g/L溶解的L-胱氨酸的发酵液酸化至pH＝5，并离心20min(8000rpm/min)去除生物质和固体。所得澄清溶液包含17.3g/L的L-半胱氨酸、＜2.3g/L的硫代硫酸盐和1.1g/L的溶解的L-胱氨酸。

实施例7：通过本发明的方法纯化包含硫代硫酸盐的发酵液

通过滴加20％盐酸，将1000ml包含微生物，pH为7，并包含18g/L的L-半胱氨酸、2.5g/L的硫代硫酸盐和1.1g/L的溶解的L-胱氨酸的发酵液酸化至pH＝5，并以离心20min(8000rpm/min)去除生物质和固体。将所得澄清溶液泵送过阳离子交换柱(200ml H⁺型强酸性Amberlite IR120H)。在此过程中，L-半胱氨酸和L-胱氨酸几乎定量结合在树脂上并取代质子。任选地，存在于溶液中的其他氨基酸和阳离子也结合在树脂上。在取代过程中，流经树脂的溶液的pH由高至低剧烈变化。洗出液的pH范围为pH＝0-1。洗出液还包含大量未与树脂结合的杂质(如中性化合物、阴离子及其相应的酸等)，但仅有少量氨基酸(如果有的话)。由于强酸性介质，硫代硫酸盐完全分解并不能从洗出液中检出。由于硫代硫酸盐在酸性介质中的分解，混浊的洗出液可能尤其包含胶体硫。用400ml水洗涤离子交换柱，然后用1000ml 1N的HCl洗脱结合在树脂上的L-半胱氨酸。产物部分包含存在于所应用的发酵液中多于90％的L-半胱氨酸和仅极少量(0.3g；＜2％，基于L-半胱氨酸)的L-胱氨酸。其余的结合在离子交换柱上的L-胱氨酸(＜2g)可以用2N HCl洗脱。

实施例8(比较例)：包含硫代硫酸盐的发酵液的纯化/pH＝1时吸附

通过滴加20％盐酸，将1000ml包含微生物，pH为7并包含18g/L的L-半胱氨酸、2.5g/L的硫代硫酸盐和1.1g/L的溶解的L-胱氨酸的发酵液酸化至pH＝1，并离心20min(8000rpm/min)去除生物质和固体。将所得溶液泵送过阳离子交换柱(200ml H⁺型强酸性Amberlite IR120H)。在此过程中，L-半胱氨酸和L-胱氨酸几乎定量结合在树脂上并取代质子。任选地，存在于溶液中的其他氨基酸和阳离子也结合在树脂上。在此取代过程中，流经树脂的溶液的pH由高至低进一步变化。洗出液的pH范围为pH＝0-1。该洗出液还包含大量未与树脂结合的杂质(如中性化合物、阴离子及其相应的酸等)，但仅有少量氨基酸(如果有的话)。洗出液中不再能检测到硫代硫酸盐。由于酸性介质中硫代硫酸盐的分解，该混浊的洗出液可能尤其包含胶体硫。用400ml水洗涤离子交换柱，再用1000ml 1N的HCl洗脱结合在树脂上的L-半胱氨酸。产物部分包含存在于发酵液中少于60％的L-半胱氨酸。

实施例9(比较例)：含少量/不含硫代硫酸盐的发酵液的纯化

通过滴加20％盐酸，将1000ml包含微生物、pH为7并包含18g/L的L-半胱氨酸、＜0.1g/L，优选0g/L的硫代硫酸盐和1.1g/L的溶解的L-胱氨酸的发酵液酸化至pH＝1-5，优选pH＝3，并离心20min(8000rpm/min)去除生物质和固体。将所得澄清溶液(半胱氨酸含量17.8g/L)泵送过阳离子交换柱(200ml H⁺型强酸性Amberlite IR 120H)。在此过程中，L-半胱氨酸、L-胱氨酸，和任选的存在于该溶液中的其他氨基酸和阳离子几乎定量结合在树脂上并取代质子。在此取代过程中，流经该树脂的溶液的pH由高至低剧烈变化。洗出液的pH范围为pH＝0-1。洗出液还包含大量未与树脂结合的杂质(如中性化合物、阴离子及其相应的酸等)，但仅有少量氨基酸(如果有的话)。由于在所用发酵液中硫代硫酸盐的量极少或者根本不存在，因此该澄清的洗出液不含任何胶体硫。

用400ml水洗涤离子交换柱，然后用1000ml 1N的HCl洗脱结合在树脂上的L-半胱氨酸。或者也可以用氨水洗脱L-半胱氨酸。产物部分包含存在于所应用的发酵液中多余90％的L-半胱氨酸，以及仅极少量的L-胱氨酸(0.3g；＜2％，基于L-半胱氨酸)。其余的结合在离子交换柱的L-胱氨酸可以用2N HCl洗脱。

实施例10：纯化实施例7和9中的HCl洗出液以得到L-半胱氨酸盐酸盐一水合物

将500ml实施例7或9中纯化的包含L-半胱氨酸(L-半胱氨酸含量＝17g/L)的溶液(用1N HCl洗脱)浓缩至25ml。在加入浓HCl或者通入HCl气体后，无机碱金属和碱土金属离子的氯化物以及氯化铵可以优选在20-60℃下结晶。过滤后，将包含L-半胱氨酸的母液冷却至-10℃，结晶出L-半胱氨酸盐酸盐一水合物。取决于所用的包含L-半胱氨酸的溶液的纯度，由这些溶液可以得到产率大于80％、纯度高于90％的晶体形态的L-半胱氨酸盐酸盐一水合物。通过合适地控制结晶条件、分级结晶和/或重结晶，可能获得高至＞98％的纯度。

纯化L-半胱氨酸的方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。