专利摘要

本发明提供一种蛋白质定量标记试剂及其制备方法与应用。本发明提供的蛋白质定量标记试剂利用邻苯二甲醛基团及其衍生基团与氨基的高反应活性，可以实现对赖氨酸特异性识别，利用其对赖氨酸的高反应活性和不水解的特性，可以有效提高标记效率，再通过比较报告离子的相对丰度，可将其应用于对多组含有赖氨酸的蛋白质组的定量分析中，该蛋白质定量标记试剂在水溶液中稳定，可长期保存，是新一代稳定、高效、经济的等量异位标记试剂。

权利要求

1.蛋白质定量标记试剂，其特征在于，所述标记试剂为如下结构通式的化合物或其药用盐：

其中，R1为n为1～3之间的整数；

R2为

2.根据权利要求1所述的标记试剂，其特征在于，所述标记试剂选自如下式1～式26所示的化合物或其药用盐：

3.含有权利要求1或2所述标记试剂的试剂盒。

4.根据权利要求2所述标记试剂的制备方法，其特征在于，

式1～式13所示化合物的制备方法包括以下步骤：

(1)将4-硝基邻苯二甲酸二甲酯与1/20～1/5质量的钯碳置于无水甲醇中，在1-10个大气压氢气氛围中室温反应3-24小时；过滤掉固体，滤液旋干，使用硅胶色谱柱，以石油醚与乙酸乙酯的混合物，或者二氯甲烷与甲醇的混合物作为流动相进行纯化，得到二甲酯化合物；

(2)室温条件下，向二甲酯化合物的无水四氢呋喃混合溶液中加入2-3倍当量的四氢铝锂，并转移至冰浴中，氩气气氛下由0℃升至室温搅拌1-16小时；然后，将反应混合物用十水合硫酸钠固体淬灭，过滤，用乙酸乙酯洗涤滤渣；收集有机相，用盐水洗涤；洗涤后的有机相用无水硫酸钠干燥之后，旋蒸去除溶剂，使用硅胶色谱柱，以石油醚与乙酸乙酯的混合物，或者二氯甲烷与甲醇的混合物作为流动相进行纯化出二羟甲基化合物；

(3)将亮氨酸、1,2-13C2亮氨酸或15N-2-13C亮氨酸加入到1M盐酸的18O水溶液中，20-80℃下反应1-16小时后，旋蒸去除溶剂，即得18O取代的亮氨酸、1,2-13C2亮氨酸或15N-2-13C亮氨酸；

(4)冰浴下将2-4倍当量的氰基硼氢化钠或氘代氰基硼氢化钠加入到水或氘水中，反应搅拌15分钟-3小时之后，向水溶液中加入1倍当量的亮氨酸、1,2-13C2亮氨酸或15N-2-13C亮氨酸，最后加入3-6倍当量的甲醛、氘代甲醛或13C取代的甲醛，在室温下反应搅拌1-12小时，旋蒸去除溶剂，得到二甲基亮氨酸或同位素衍生物，利用阳离子交换柱对二甲基亮氨酸或同位素衍生物进行分离；

(5)将二甲基亮氨酸或同位素衍生物与1.1-2倍当量的HATU溶解于DMF溶剂中，室温下搅拌1-12小时后，加入1.1-2倍当量的步骤(2)所得二羟甲基化合物的DMF溶液，再向溶液中加入2-4倍当量三乙胺；室温下搅拌反应1-16小时，旋蒸去除溶剂，使用硅胶色谱柱，以二氯甲烷与甲醇的混合物作为流动相进行纯化，得到二醇化合物；

(6)将步骤(5)所得二醇化合物溶于DCM与DMF的混合溶液中，室温下加入2-5倍当量的戴斯马丁氧化剂，反应1-16小时后，加入饱和碳酸氢钠和/或硫代硫酸钠水溶液淬灭反应，室温下搅拌10分钟到3小时；用异丙醇与CHCl3的混合液萃取；收集有机相，用饱和食盐水洗涤；洗涤后的有机相用无水硫酸钠干燥之后，旋蒸去除溶剂，使用硅胶色谱柱，以二氯甲烷与甲醇的混合物作为流动相进行纯化。

5.根据权利要求2所述标记试剂的制备方法，其特征在于，

式14～式26所示化合物的制备方法包括以下步骤：

(1)将6-硝苯酞酯溶于四氢呋喃中，冷却至-78℃，随后逐滴加入1-2倍当量的1.6M甲基锂乙醚溶液或3M甲基溴化镁的二乙醚溶液，-78℃反应1-16小时后，加入水淬灭过量甲基锂试剂，旋蒸去除四氢呋喃，然后用乙酸乙酯萃取水相，收集有机相，用盐水洗涤；洗涤后的有机相用无水硫酸钠干燥之后，旋蒸去除溶剂，得到粗产物；

(2)将上述粗产物溶于无水乙醇中，-78℃下加入2-5倍当量硼氢化钠固体，恢复到室温下搅拌1-8小时，旋蒸去除溶剂，使用硅胶色谱柱，以二氯甲烷与甲醇的混合物作为流动相进行纯化；

(3)将步骤(2)所得产物与钯碳置于无水甲醇中，在1-10个大气压的氢气氛围中室温反应1-16小时；过滤掉固体，滤液旋干，使用硅胶色谱柱，以石油醚与乙酸乙酯的混合物，或者二氯甲烷与甲醇的混合物作为流动相进行纯化，得到二羟甲基化合物；

(4)将亮氨酸、1,2-13C2亮氨酸或15N-2-13C亮氨酸加入到1M盐酸的18O水溶液中，20-80℃下反应1-16小时后，旋蒸去除溶剂，即得18O取代的亮氨酸、1,2-13C2亮氨酸或15N-2-13C亮氨酸；

(5)冰浴下将2-4倍当量的氰基硼氢化钠或氘代氰基硼氢化钠加入到水或氘水中，反应搅拌15分钟-3小时之后，向水溶液中加入1倍当量的亮氨酸、1,2-13C2亮氨酸或15N-2-13C亮氨酸，最后加入3-6倍当量的甲醛、氘代甲醛或13C取代的甲醛，在室温下反应搅拌1-12小时，旋蒸去除溶剂，得到二甲基亮氨酸或同位素衍生物，利用阳离子交换柱对二甲基亮氨酸或同位素衍生物进行分离；

(6)将二甲基亮氨酸或同位素衍生物与1.1-2倍当量的HATU溶解于DMF溶剂中，室温下搅1-6小时后，加入步骤(3)得到的1.1-2倍当量二羟甲基化合物的DMF溶液，再向溶液中加入2-4倍当量的三乙胺；室温下搅拌反应1-16小时，旋蒸去除溶剂，使用硅胶色谱柱，以二氯甲烷与甲醇的混合物作为流动相进行纯化，得到二醇化合物；

(7)将二醇化合物溶于DCM与DMF的混合溶液中，室温下加入2-5倍当量的戴斯马丁氧化剂，反应1-16小时后，加入饱和碳酸氢钠和/或硫代硫酸钠水溶液淬灭反应，室温下搅拌1-6小时；用异丙醇与CHCl3的混合液萃取；收集有机相，用盐水洗涤；洗涤后的有机相用无水硫酸钠干燥之后，旋蒸去除溶剂，使用硅胶色谱柱，以二氯甲烷与甲醇的混合物作为流动相进行纯化。

6.权利要求1或2所述标记试剂或权利要求3所述试剂盒在蛋白质组学分析中非疾病诊断目的的应用。

7.权利要求1或2所述标记试剂或权利要求3所述试剂盒在蛋白质定性及定量检测中非疾病诊断目的的应用。

8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于，所述蛋白质为含有赖氨酸的蛋白质。

蛋白质定量标记试剂及其制备方法与应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。