IPC分类号 : G01N33/68I,G01N33/58I,G01N33/574I,G01N21/65I
专利摘要
本发明公开了一种构建SERS光谱探针检测乳腺癌标志物EGFR磷酸化酪氨酸的方法：利用金板作为基板，采用核壳结构纳米粒子作为SERS检测的基底，发展高选择性和高灵敏性的“三明治”构型探针分子来检测乳腺癌标志物EGFR酪氨酸的磷酸化。利用4‑MB拉曼光谱中位于生物分子拉曼静默区峰位为2221cm‑1的SERS光谱强度作为内标对标记分子4‑MBA光谱信号进行强度归一化处理，能够避免生物分子指纹区拉曼信号对定量检测的影响，使得EGFR磷酸化酪氨酸溶液浓度与SERS强度的线性关系得到大大地提升，进一步提高该SERS光谱探针的检测灵敏度。4‑MB和4‑MBA位于金核与银壳的中间层，保证了其性质、空间结构和数量等不变，进而确保数据的可靠性。本发明方法在癌症标志物超灵敏检测方面展现出巨大的潜力。
权利要求
1.SERS光谱探针在制备检测乳腺癌标志物EGFR磷酸化酪氨酸的试剂中的应用，其特征在于：包括如下步骤：
1）合成金银核壳纳米结构
1-1）制备金纳米胶体Au NPs：以柠檬酸钠溶液为还原剂，将氯金酸溶液还原，从而获得金纳米胶体Au NPs；
1-2）Au@
量取金纳米胶体Au NPs于锥形瓶中，滴加4-MB，保持搅拌，从而在金纳米胶体Au NPs表面修饰了标记分子4-MB，得到Au@
1-3）制备金银核壳纳米粒子Au@
在离心清洗后的Au@
2）修饰DNA单链
2-1）制备S1-Au plate：首先用水和PBS缓冲液洗涤金板，干燥后，将其浸泡在DNA单链S1溶液中，取出并用PBS缓冲溶液再次清洗，然后再干燥，从而在金板上修饰上DNA单链S1，得到S1-Au plate；
2-2）制备S2-Au@
3）修饰抗EGFR磷酸化酪氨酸抗体
在离心清洗后的S2-Au@
在离心清洗后的Au@
最后，全部修饰结束后在两种核壳纳米胶体中分别加入牛血清白蛋白封闭；
4）组装
4-1) S1-Au plate与S2-Au@
4-2) 组装完成后，将基板浸泡在不同浓度的EGFR磷酸化酪氨酸的溶液中，反应一段时间，然后用PBS缓冲溶液清洗，接着再将其浸泡在表面修饰有抗体的Au@
2.根据权利要求1所述的SERS光谱探针在制备检测乳腺癌标志物EGFR磷酸化酪氨酸的试剂中的应用，其特征在于：步骤2）中的DNA单链S1和DNA单链S2序列分别为：AAAATGTCCAAGGCT-SH和 TTTTACAGGTTCCGA-SH。
3.根据权利要求1所述的SERS光谱探针在制备检测乳腺癌标志物EGFR磷酸化酪氨酸的试剂中的应用，其特征在于：步骤1-1）具体如下：将氯金酸溶液转入锥形瓶中，将其放置在磁力搅拌加热器上搅动和加热，当溶液沸腾后滴加1%柠檬酸钠溶液，观察颜色逐渐变成酒红色，保持搅拌沸腾一段时间后停止，从而获得金纳米胶体Au NPs。
说明书
技术领域
本发明属于生物医学癌症标志物磷酸化检测领域，具体涉及一种构建SERS光谱探针检测乳腺癌标志物EGFR磷酸化酪氨酸的方法。
背景技术
乳腺癌是世界上第二常见的癌症，占所有癌症的25%，而乳腺癌也是世界上妇女最普遍患的恶性肿瘤，其发病率在时间的推动下呈现一个上升的趋向，并且主要发生在45岁以上的女性。表皮生长因子受体（EGFR）是乳腺癌特异性蛋白生物标志物之一，是位于细胞表面的一种跨膜糖蛋白，酪氨酸激酶与表皮生长因子和转化生长因子(TGFa)等复合物结合后，激活并诱导细胞增殖和分化。EGFR 在许多上皮源性肿瘤中会出现过表达的现象(>75.3µg·L-1)，如乳腺癌、胃癌、食管癌、前列腺癌等。
乳腺癌病人体内的磷酸化蛋白与其病症密切相关,蛋白磷酸化是控制细胞功能几乎所有方面的最重要、最广泛的分子调控机制之一，蛋白质进行翻译的过程中，通过某种方式的修饰，某些固定的修饰可以成为癌症的生物标志或治疗的靶向，异常的蛋白质磷酸化通常与癌症有关。因此,磷酸化事件的状态可以为疾病状态提供线索。增添或去除磷酸基团成为很多反应的生物“开/关”，通过蛋白质磷酸化激发多种生物现象是极有必要的，例如细胞的增殖、发育、分化的蛋白降解等过程。尤其酪氨酸磷酸化是细胞信息传递和调节控制酶活性的重要形式之一，一般经激发蛋白间的互相影响，继而通过某种媒介转导生长因子、细胞因子等调节细胞膜上受体的信息。在多种磷酸化修饰中酪氨酸磷酸化所占的比例较低，然而也正因为其在细胞中的含量程度较低，因此能确保生物分子在前后信号的刺激下产生敏锐的应，在探究生物信息的调节及各类关键生化过程中酪氨酸的磷酸化有着显著的研究意义和发展潜力。癌症发展的早期具有较大的治疗干预潜力。因此，发现仍局限于器官内的癌前或转移前恶性肿瘤是有效治疗和提高生存率的关键。乳腺癌确诊的常用方式有临床和辅助检查，如影像学和活检。在活检中，对采集的样本进行雌荷尔蒙受体和孕激素受体分析，以确定乳腺癌的类型。这种技术信息丰富，是目前的标准选择。然而，它是侵入性的，对病人存在风险并且价格相对昂贵。因此，一个无创的、简便的诊断方法对人们来说变得越来越重要。这表明需要新的诊断方法来评估癌症生物标志物的表达，分子生物学的最新进展表明，肿瘤生物标志物在肿瘤的诊断、预后和病因学研究中展现出及其重大的作用，对其进行高选择性和敏感性检测，是早期肿瘤检测、分期监测和耐药性评估最有价值的工具之一。
表面增强拉曼光谱(SERS)技术是一项具有高灵敏性、高准确性的检测工具，在具备常规拉曼所具有的大部分优点外，还克服了其原本的缺点。所以极大地引起广大科学工作者对SERS的研究兴趣。相较于常规拉曼光谱，SERS光谱信号增强了10-14个数量级，灵敏度得到很大的提高，正是由于SERS特有的无损性和灵敏度、稳定性高的优势，促使它在生物医学应用中表现出广泛的发展前景，为医学排查、顽固病症的病理检查提出了新型快速无创的方法和有效的手段。
发明内容
为了降低目前乳腺癌早期检测存在的费用高、预处理复杂、耗时长以及精确度等问题，本发明的目的是提供一种构建SERS光谱探针检测乳腺癌标志物EGFR磷酸化酪氨酸的方法，具有易于操作，灵敏度高，特异性强，能节省大量时间与经济成本的优点。
本发明是基于上述的研究背景，针对蛋白磷酸化与乳腺癌标志物表皮生长因子受体（EGFR）相联系进行探究。众所周知，氨基酸利用“脱水缩合”的方式形成多肽链，然后通过弯曲折叠构成具备一定空间构型的物质蛋白质，由于其空间结构和构造较为复杂，所以我们将研究对象定位在多肽的磷酸化，加之酪氨酸的磷酸化所起到的主要作用，故通过构建抗原-抗体“三明治”结构探针的方法，对EGFR的多肽链上的酪氨酸进行磷酸化位点的特异性识别研究，从而能够进一步开展乳腺癌无损检测研究。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种构建SERS光谱探针检测乳腺癌标志物EGFR磷酸化酪氨酸的方法，包括如下步骤：
1）合成金银核壳纳米结构
1-1）制备金纳米胶体（Au NPs）：将氯金酸溶液转入锥形瓶中，将其放置在磁力搅拌加热器上搅动和加热，当溶液沸腾后滴加1%柠檬酸钠溶液，观察颜色逐渐变成酒红色，保持搅拌沸腾一段时间后停止，置于室温环境下降温，待用；
1-2）Au@4-MBA和Au@4-MB的合成：量取金纳米胶体于锥形瓶中，在磁力搅拌子的不断搅动下逐滴滴加对巯基苯甲酸(4-MBA)，保持搅拌1小时，从而在Au NPs表面修饰了拉曼标记分子4-MBA（Au@4-MBA）；类似地，在金纳米粒子表面修饰有标记分子对巯基苯甲腈4-MB（Au@4-MB）；
1-3）制备金银核壳纳米粒子Au@4-MBA@Ag 和Au@4-MB@Ag：将Au@4-MBA胶体转移至离心管中离心，离心清洗2次，目的是将多余的标记分子4-MBA移除，然后，移除上层清液，将剩余胶体转入锥形瓶中，重悬于蒸馏水中。在磁子搅拌下，逐滴加入抗坏血酸溶液，接着，逐滴滴加AgNO3溶液，观察液体颜色由酒红色逐步变成橙色，反应时间为 1h，形成标记分子为 4-MBA的金银核壳结构（Au@4-MBA@Ag）纳米粒子胶体。同样的操作，我们可以得到内标分子为 4-MB 的金银核壳结构（Au@4-MB@Ag）纳米粒子胶体。
2）.修饰 DNA 单链
2-1）制备 S1-Au plate：首先用超纯水洗涤金板5次，接着用PBS缓冲液再次洗涤3-4回，然后在温和的氮气流中干燥后，将其浸泡在DAN单链（S1）溶液中，浸泡16h，取出并用PBS缓冲溶液再次清洗3次，然后在温和的氮气中干燥，从而在金板上修饰上DNA单链（S1），得到S1-Au plate。
2-2）制备S2-Au@4-MB@Ag：将Au@4-MB@Ag纳米胶体转移至离心管中，离心清洗2次后，将其重新悬浮于的PBS缓冲液中，加入DNA单链（S2）溶液，在搅拌下反应16h，从而在Au@4-MB@Ag的核壳结构上修饰上DNA单链S2，得到 S2-Au@4-MB@Ag；
其中，DNA单链S1的序列为AAAATGTCCAAGGCT-SH，DNA单链S2的序列为TTTTACAGGTTCCGA-SH。
3）.修饰抗 EGFR 磷酸化酪氨酸抗体
在S2-Au@4-MB@Ag纳米胶体表面修饰EGFR磷酸化酪氨酸抗体，首先将修饰有S2-Au@4-MB@Ag胶体离心清洗2次，再将其重悬于PBS 缓冲溶液中，在磁力搅拌下，逐滴加入抗酪氨酸磷酸化抗体，反应时间为2h。同样的操作，在合成的Au@4-MBA@Ag胶体中也加入抗酪氨酸磷酸化抗体，从而在标记分子4-MBA的核壳结构表面修饰有抗体。
最后，全部修饰结束后在两种核壳纳米胶体中分别加入牛血清白蛋白（BSA）封闭。
4）.组装
S1-Au plate与S2-Au@4-MB@Ag 的组装：将修饰有抗体的S2-Au@4-MB@Ag 胶体离心清洗2次后，再将修饰S1的金板浸泡在其中，反应时间为12h，S1和 S2的碱基通过互补配对，从而实现S1-Au plate与S2-Au@4-MB@Ag的自组装。接下来，用PBS缓冲溶液清洗3次，并在温和的氮气流中干燥，为接下来连接抗原做准备。
组装完成后，将基板浸泡在不同浓度的EGFR磷酸化酪氨酸的溶液中，反应时间为2h，然后用PBS缓冲溶液清洗3次。接着再将其浸泡在表面修饰有抗体的Au@4-MBA@Ag核壳纳米胶体中，反应时间为2h。用PBS缓冲液洗涤3遍，并在温和的氮气流中干燥，为接下来的SERS测量做准备。
本发明中，步骤1-2）将拉曼标记分子对巯基苯甲酸（4-MBA）和内标分子对巯基苯甲腈（4-MB）修饰在金银核壳结构的中间层，可以避免接下来的实验步骤对其性质、空间结构及连接数量的影响，有利于检测时得到可靠的测量结果。
步骤2）中通过在金板和Au@4-MB@Ag纳米粒子表面修饰DNA单链，可以通过碱基互补配对相连接，将Au@4-MB@Ag核壳结构组装在金板上。
步骤3）中在S2-Au@4-MB@Ag和Au@4-MBA@Ag核壳纳米粒子表面修饰上抗体，当样品溶液中含有相应的抗原时，就可通过抗原-抗体的特异性识别来将两种核壳结构纳米粒子连接起来，形成“三明治”结构，从而实现对乳腺癌标志EGFR磷酸化酪氨酸的检测。
本发明采用以上技术方案，利用金板作为基板，采用核壳结构纳米粒子作为表面增强拉曼散射(SERS)检测的基底，发展一种高选择性和高灵敏性的“三明治”构型探针分子来检测乳腺癌标志物表皮生长因子受体（EGFR）酪氨酸的磷酸化。利用4-MB拉曼光谱中位于生物分子拉曼静默区峰位为2221cm-1的SERS光谱强度作为内标对标记分子4-MBA光谱信号进行强度归一化处理，能够避免生物分子指纹区拉曼信号对定量检测的影响，使得EGFR磷酸化酪氨酸溶液浓度与SERS强度的线性关系得到大大地提升，进一步提高该SERS光谱探针的检测灵敏度。内标分子对巯基苯甲腈（4-MB）和拉曼标记分子对巯基苯甲酸（4-MBA）位于金核与银壳的中间层，从而保证了其性质、空间结构和数量等不变，进而确保所得数据的可靠性。因此，实验中所构建的“三明治”结构SERS探针在癌症标志物超灵敏检测方面展现出巨大的潜力。
附图说明
图1.（a）为实施例中合成的金银核壳结构纳米粒子（Au@4-MB@Ag）的透射电镜图（TEM），（b）为Au NPs、Au@4-MB和Au@4-MB@Ag纳米溶胶的紫外-可见吸收光谱图。
图2.（a）为金板衬底及修饰单链DNA（S1）后分别在固态和液态下检测获得的光谱，（b）为实验中对每一步的组装进行SERS表征所得的光谱。
图3.（a）为EGFR磷酸化酪氨酸的浓度为1.0到100µg/L范围内的SERS光谱，（b）为从1.0到100µg/L的EGFR磷酸化酪氨酸的浓度与520cm-1峰位处的拉曼强度的标准曲线，（c）为以内标分子4-MB光谱中位于2221cm-1处的峰值强度对SERS光谱进行归一化处理后与浓度在1.0到100µg/L范围内的EGFR磷酸化酪氨酸的标准曲线。
图4为在普通空气环境下暴露0天和3天后，“三明治”结构的SERS信号。
具体实施方式
以下将结合具体实施例与附图对本发明做进一步说明。
1.试剂 氯金酸溶液（HAuCl4）、柠檬酸钠（Na3C6H5O7）、对巯基苯甲酸（4-MBA）、对巯基苯甲腈(4-MB)、抗坏血酸、硝酸银（AgNO3）、磷酸盐缓冲液(PBS,PH=7)、磷酸化丝氨酸二肽（PS-S）、磷酸化苏氨酸二肽（PT-T）、单链DNA（S1：AAAATGTCCAAGGCT-SH，S2：TTTTACAGGTTCCGA-SH）、牛血清白蛋白（BSA）、抗EGFR磷酸化酪氨酸抗体（Anti-EGFR(Phospho-Tyr1172) antibody）、抗原EGFR磷酸化酪氨酸多肽（DNPDY(P)QQDFFP）、EGFR无磷酸化酪氨酸多肽（DNPDYQQDFFP）。 2. 溶液的配制
1%氯金酸溶液的配制，具体步骤如下：首先，用超纯水将氯金酸固体粉末溶解于烧杯里，然后将其倒入100mL容量瓶中，清洗烧杯、玻璃棒2-3回，将洗涤液一起转入容量瓶中，再用超纯水定容到容量瓶的刻度线处，摇匀后，放置在黑暗处，待用。同理，采用类似的步骤来配制 AgNO3和抗坏血酸溶液。
制备1mM的4-MBA和4-MB溶液：在托盘天平上分别称量质量为0.0077g和0.00676g的对巯基苯甲酸和对巯基苯甲腈固体粉末，将其分别倒入50mL的容量瓶中，都使用甲醇作为溶剂进行溶解并定容，摇匀后，放于避光处。
配制DNA单链（S1和S2）溶液：以S1为例简要说明，在每OD的DNA链中加入PBS缓冲液66µL获得的初始浓度为100µM，然后将其稀释至50nM即可。
EGFR磷酸化酪氨酸多肽标准溶液的配制：简短地来说，用PBS缓冲液稀释初始浓度为1mg/mL 的原液来配制一系列浓度从1到100µg/L的标准溶液，然后将溶液完全摇匀，形成高度分散的溶液。 3. 合成金银核壳纳米结构
1) 制备金纳米胶体（Au NPs）：将1mL氯金酸溶液转入锥形瓶中，然后再缓慢倒入99mL去离子水，将其放置在磁力搅拌加热器上搅动和加热，当溶液沸腾后滴加1%柠檬酸钠溶液（2mL），观察颜色逐渐变成酒红色，保持搅拌沸腾15分钟停止，置于室温环境下降温，待用。
2) Au@4-MBA和Au@4-MB的合成：量取12mL的金纳米溶胶于锥形瓶中，在磁力搅拌子的不断搅动下逐滴滴加10µL浓度为1mM的对巯基苯甲酸(4-MBA)，保持搅拌1小时，从而在AuNPs表面修饰了拉曼标记分子4-MBA（Au@4-MBA）。类似地，依然在锥形瓶中加入12mL的金纳米溶胶，在磁子的不断搅动下，逐滴加入浓度为10-3M的对巯基苯甲腈10µL，保持搅拌60min，在金纳米粒子表面修饰有标记分子4-MB（Au@4-MB）。
3)制备金银核壳纳米粒子Au@4-MBA@Ag和Au@4-MB@Ag：将Au@4-MBA胶体转移至离心管中离心，调节转速为10000rpm，时间为10min，离心清洗2次，目的是将多余的标记分子4-MBA移除。然后，移除上层清液，将剩余胶体转入锥形瓶中，重悬于10mL蒸馏水中。在磁子搅拌下，逐滴加入0.1M的抗坏血酸溶液2mL,接着，逐滴滴加2.5mL AgNO3溶液（10-3M），观察液体颜色由酒红色逐步变成橙色，反应时间为 1h，形成标记分子为4-MBA的金银核壳结构（Au@4-MBA@Ag）纳米粒子胶体。同样的操作，我们可以得到内标分子为4-MB的金银核壳结构（Au@4-MB@Ag）纳米粒子胶体。 4. 修饰 DNA 单链
1) 制备 S1-Au plate：首先用超纯水洗涤金板5次，接着用PBS缓冲液再次洗涤3-4回，然后在温和的氮气流中干燥后，将其浸泡在浓度为50nM的DNA单链（S1）溶液中，浸泡16h，取出并用PBS缓冲溶液再次清洗3次，然后在温和的氮气中干燥，从而在金板上修饰上DNA单链（S1），得到S1-Au plate。
2)制备S2-Au@4-MB@Ag：将Au@4-MB@Ag纳米胶体转移至离心管中，离心清洗2次后，将其重新悬浮于1mL的PBS缓冲液中，加入1nM DNA单链S2溶液，在搅拌下反应16h，从而在Au@4-MB@Ag的核壳结构上修饰上DNA单链S2，得到S2-Au@4-MB@Ag。 5 修饰抗 EGFR 磷酸化酪氨酸抗体
在S2-Au@4-MB@Ag纳米胶体表面修饰EGFR磷酸化酪氨酸抗体，首先将修饰有S2-Au@4-MB@Ag胶体离心清洗2次，再将其重悬于1mL 的PBS 缓冲溶液中，在磁力搅拌下，逐滴加入浓度为100µg/mL的抗酪氨酸磷酸化抗体（100µL）， 反应时间为2h。同样的操作，在合成的Au@4-MBA@Ag胶体中也加入1µg抗酪氨酸磷酸化抗体，从而在标记分子4-MBA的核壳结构表面修饰有抗体。最后，全部修饰结束后在两种核壳纳米胶体中分别加入5%牛血清白蛋白封闭（BSA）。
6 组装
S1-Au plate与S2-Au@4-MB@Ag的组装：将修饰有抗体的S2-Au@4-MB@Ag胶体离心清洗2次后，再将修饰S1的金板(S1-Au plate)浸泡在其中，反应时间为12h，S1和S2的碱基通过互补配对，从而实现S1-Au plate与S2-Au@4-MB@Ag的自组装。接下来，用PBS缓冲溶液清洗3次，并在温和的氮气流中干燥，为接下来连接抗原做准备。
组装完成后，将基板浸泡在不同浓度的EGFR磷酸化酪氨酸的溶液中，反应时间为2h，然后用PBS缓冲溶液清洗3次。接着再将其浸泡在表面修饰有抗体的Au@4-MBA@Ag核壳纳米胶体中，反应时间为2h。用PBS缓冲液洗涤3遍，并在温和的氮气流中干燥，为接下来的 SERS测量做准备。
本发明通过抗坏血酸还原银壳，包裹在金核外层形成金银纳米核壳结构，通过透射电镜（TEM）清晰的观察到其结构，如图1（a）所示，TEM图显示Au@4-MB@Ag核壳纳米胶体颗粒较均匀统一，粒径约为40±5nm。另外，将合成的Au@4-MB@Ag胶体通过紫外-可见吸收光谱表征，如图1（b）展现的黑色谱线表示Au NPs的最大吸收峰位于521cm-1左右，在Au NPs表面修饰内标分子4-MB后，如图红色线所展示的那样，最大吸收峰依旧位于521cm-1，说明4-MB的修饰并没有对金纳米粒子产生影响。蓝线表示的是包裹银壳合成Au@4-MB@Ag核壳胶体，此时展现出两个峰包，其中Au NPs的最大吸收峰由521 cm-1移到495cm-1处，而在400cm-1处的峰包是银的吸收峰，进一步证明核壳结构的形成。
为了表征金板及修饰单链DNA（S1）后，对拉曼染料分子的光谱信号是否会产生影响，实验中运用SERS技术对金板进行检测，如图2（a）所示，黑线是金板的拉曼峰，可以观察到并无信号产生。为了进一步证明，我们在金板上滴加了PBS缓冲液，并在溶液和固态的状态下分别进行拉曼检测，如图中红色和蓝色谱线所示，依然没有任何拉曼峰出现，由此可以说明金板的拉曼背景并不会对后面实验测得的光谱产生干扰。接着在液态和固态下，对DNA单链自组装的金板(S1-Au plate)进行拉曼检测，如图中的绿色和粉色谱线所展示，依然未有拉曼峰出现，该结果表明金板上连接了DNA单链后，没有产生任何明显的光谱信号，表明对后续实验染料分子4-MBA的信号并无干扰。接下来，我们对每一步实验过程中的修饰和组装进行追踪检测，如图2（b）所示，红线是对通过S1和S2互补配对将内标分子为4-MB的核壳纳米粒子（Au@4-MB@Ag）连接在金板上进行的SERS检测，可以观察到4-MB的SERS光谱。然后，对浸泡EGFR-Phospho-Tyr抗原溶液后的金板基底进行检测，如图中的蓝色谱线所示，与红色谱线相比，4-MB的光谱信号强度相差无几，表明浸泡完抗原溶液后，对金板上的组装的Au@4-MB@Ag核壳纳米粒子的数量没有产生明显地干扰，从而保证了测量数据的可靠性。绿线表示将合成带有标记分子4-MBA的核壳纳米颗粒（Au@4-MBA@Ag）连接在基底上检测的SERS光谱，图中明显展示出除了4-MB的信号外，同时还检测到了4-MBA的SERS信号，表明修饰有EGFR酪氨酸磷酸化抗体的Au@4-MBA@Ag核壳纳米粒子通过识别溶液中的EGFR酪氨酸的磷酸化抗原连接在组装有Au@4-MB@Ag的金板上。
本发明中，利用所设计的“三明治”结构，通过抗原-抗体进行特异性识别，在标准溶液中检测不同浓度的EGFR酪氨酸的磷酸化，可以得到EGFR酪氨酸磷酸化浓度从1.0到100µg/L的一系列SERS光谱。如图3（a）所示，在能检测到内标分子4-MB的SERS谱峰的同时，也可以检测到标记分子4-MBA的光谱信号，4-MBA的SERS光谱特征峰是在520cm-1处，而峰位589和2221cm-1是4-MB所特有的拉曼峰，峰位1074、1578cm-1等是两种染料分子共同作用的结果。为了准确证明EGFR磷酸化酪氨酸的浓度对SERS强度的影响，我们监测了位于520cm-1处的SERS峰位的强度。如图3（b）所示，随着抗原浓度从1.0µg/L增加到100µg/L，4-MBA光谱中520cm-1峰位处的SERS强度由1021.04逐渐增加到了6737.14(a.u.)，所得的标准曲线是y =57.04x+1658.6，应该注意的是，计算所得的相关系数R2= 0.849。为了能得到更好的相关系数，我们利用内标分子归一化处理的方法。实验中，我们选择4-MB作为内标分子，由于4-MB具有位于生物静默区的谱峰（2221cm-1），利用此峰位进行计算可以避免“指纹区”以内的谱峰产生的干扰。如图3（c）所示，利用4-MB位于生物静默区的拉曼峰位为2221cm-1处的峰值强度对拉曼标记分子对巯基苯甲酸（4-MBA）的光谱进行强度归一化，将4-MBA光谱中520cm-1峰位的SERS强度与4-MB光谱中2221cm-1峰位的SERS强度相比，所得的比值作为纵坐标，可以观察到抗原浓度从1.0增加到100µg/L，比值（I520/I2221）的变化，重要地是计算所得的相关系数是R2 =0.990，相比较于直接利用SERS强度代入计算所得的R2，此时的R2具有显著的提高，也表明了EGFR磷酸化酪氨酸的浓度与SERS强度呈现一个良好的线性关系。
为了验证构建的“三明治”结构探针的稳定性，我们把组装好的基板与浓度为100µg/L的EGFR磷酸化酪氨酸标准溶液相互作用后，再连接Au@4-MBA@Ag纳米颗粒，将其放于空气环境中三天。图4所展示的是将完全组装好的基板暴露在共同的空气环境中零天和三天的情况下，所检测到的SERS信号，可以清楚地观察到，拉曼信号没有显著减弱。因此，我们可以得出结论，短期暴露在空气中的SERS传感器不会导致SERS信号的明显衰减。
一种构建SERS光谱探针检测乳腺癌标志物EGFR磷酸化酪氨酸的方法专利购买费用说明
Q：办理专利转让的流程及所需资料
A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。
1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。
2：按规定缴纳著录项目变更手续费。
3：同时提交相关证明文件原件。
4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。
Q:专利著录项目变更费用如何缴交
A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式
Q：专利转让变更，多久能出结果
A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。
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