专利摘要

本发明涉及一种肌肉PET成像分子探针及其制备方法与应用，所述肌肉PET成像分子探针是在缬氨酸的基础上用‑BF3‑替换了‑COO‑，其可在肌肉中特异性富集，且富集度与肌肉的萎缩程度具有高度相关性，经放射性18F标记的分子探针可对活体肌肉进行成像，不需要提前对肌肉进行任何人工改造操作，即可在活体内对肌肉进行非创伤性PET成像。

权利要求

1.一种肌肉PET成像分子探针在制备肌肉PET成像剂中的应用；

所述分子探针是在缬氨酸基础上用-BF3-替换了-COO-，其具有以下结构式

所述分子探针中的一个、两个、或三个F为18F。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述缬氨酸为D-型缬氨酸或L-型缬氨酸。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述缬氨酸为L-型缬氨酸。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述成像剂的使用方法包括以下步骤：

1)将分子探针和生理盐水混合，制成分子探针注射液；

2)将注射液静脉注射入活体；

3)一段时间后对活体进行PET-CT成像；

4)通过放射性信号重建获得探针后的体内分布图像，并从图像中获取肌肉部位的标准平均摄取剂量。

5.一种肌肉PET成像分子探针在制备诊断肌萎缩疾病的药物中的应用；

所述分子探针是在缬氨酸基础上用-BF3-替换了-COO-，其具有以下结构式

所述分子探针中的一个、两个、或三个F为18F。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述缬氨酸为D-型缬氨酸或L-型缬氨酸。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述缬氨酸为L-型缬氨酸。

8.如权利要求5所述的应用，其中所述肌萎缩性疾病为神经源性肌萎缩或肌肉源性肌萎缩。

说明书

技术领域

本发明涉及核医疗诊断领域，具体涉及一种肌肉PET成像分子探针及其制备方法与应用。

背景技术

肌萎缩是临床查体的常见体征，由各种原因导致的肌萎缩最直接的后果是瘫痪，甚至危及生命，给个人、家庭、社会造成极大的负担。肌萎缩这类疾病在临床上可分为神经源性和肌源性两种类型，导致全身弥漫性或局部的肌萎缩。例如著名物理学家霍金患有的肌萎缩侧索硬化就是神经源性肌萎缩疾病中的一种，该病使他在21岁就出现了瘫痪。Duchenne肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy，DMD)是较常见的肌源性肌萎缩疾病，发病率为1/5000～1/3500活产男婴，通常起病于儿童时期，卒于青少年。

目前在肌萎缩疾病诊断中，临床表现、肌电图、血生化和免疫检查、肌肉MRI、致病基因检测以及肌肉活检病理是最主要的诊断依据。其中肌肉病理(包括组织病理+免疫病理)，一直被视为诊断的金标准，然而有创性限制了其应用范围，只有少数肌肉可以在不影响外观和功能的前提下被取材，且取材量为全身肌肉量的十万分之一，似于管中窥豹，因此在临床应用上受到很大局限。同样因为缺乏有效、客观的治疗评价手段，该病的新药临床试验中仍以治疗后的有创肌肉病理检查作为效果的评价手段，不但给患者带来二次检查创伤，且很难反应全身情况。因此肌萎缩这类疾病急需无创且客观的肌肉损伤和再生的评价手段来代替病理的有创检查。

正电子发射断层扫描成像(Positron Emission Tomography，PET)是一种依托于放射性分子探针的分子影像学技术。PET有精准、敏感、无创、快速、活体、动态等多方面优势，可应用于目标受体分子、蛋白功能、基因表达等分子显像，已经在肿瘤、神经和心脏病学临床中发挥了重要的作用。近年来，PET技术带来的颠覆性进展正引领着分子影像领域跨入新的时代。

本领域一直致力于寻找可以用于肌肉PET成像的分子探针，以实现对活体肌肉的无创检测。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种肌肉PET成像分子探针及其制备方法和应用。本发明提供的分子探针可在肌肉中特异性富集，且富集度与肌肉的萎缩程度具有高度相关性，有着良好的临床应用前景。

为此，第一方面，本发明提供了一种肌肉PET成像分子探针，所述分子探针是在缬氨酸基础上用-BF3-替换了-COO-，其具有以下结构式

进一步，所述缬氨酸为D-型缬氨酸或L-型缬氨酸，优选L-型缬氨酸。

进一步，其中一个、两个、或三个F经过18F-19F同位素交换。

第二方面，本发明提供了所述肌肉PET成像分子探针的制备方法，包括：

(1)2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺和异丁醛反应制备相应的亚胺；

(2)将步骤(1)制备得到的亚胺和双(频哪醇合)二硼的甲苯溶液混合，制备相应的硼酯；

(3)裂解步骤(2)制备的硼酯获得缬氨酸三氟化硼。

进一步，所述制备方法还包括：

(4)将步骤(3)制备得到的缬氨酸三氟化硼在18F-氟化物水溶液中进行同位素交换。

进一步，所述步骤(3)是将步骤(2)制备的硼酯在盐酸和氟氢化钾的作用下裂解生成缬氨酸三氟化硼。

进一步，所述制备方法的反应路线如下：

包括：

(1)向(S)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺的四氢呋喃溶液中加入钛酸四异丙酯和异丁醛，反应制备化合物1；

(2)向三环己基膦四氟硼酸盐溶液的圆底烧瓶中依次加入甲苯，硫酸铜水溶液和苄胺，加盖搅拌混合后加入甲苯，化合物1和双(频哪醇合)二硼，反应制备化合物2；

(3)化合物2中加入氟氢化钾、氯化氢和乙腈，制备得到式I化合物缬氨酸三氟化硼；

(4)在水相溶剂中，通过18F-19F同位素交换反应得到式II化合物。

第三方面，本发明提供了所述肌肉PET成像分子探针在制备肌肉PET成像剂中的应用。

进一步，所述成像剂的使用方法包括以下步骤：

1)将分子探针和生理盐水混合，制成分子探针注射液；

2)将注射液静脉注射入活体；

3)一段时间后对活体进行PET-CT成像；

4)通过放射性信号重建获得探针后的体内分布图像，并从图像中获取肌肉部位的标准平均摄取剂量。

第四方面，本发明提供了所述肌肉PET成像分子探针在制备诊断和/或治疗肌萎缩疾病的药物中的应用。

进一步，所述肌萎缩性疾病包括神经源性肌萎缩和肌肉源性肌萎缩，所述肌肉源性肌萎缩包括Duchenne肌营养不良。

本发明在研究过程中发现，缬氨酸及其类似物在肌肉中有非常特异性的富集。结合发明人在前期研究中的发现：三氟化硼基团与羧基在化学性质及体内性质上具有相似性。利用三氟化硼基团替代分子结构中的羧基，可以得到原分子的三氟化硼类似物，并且经实验证明，二者在生物体内具有非常相似的性质。(Liu Z,et al.ScienceAdvances.2015.DOI:10.1126/sciadv.1500694.)。

因此，本发明以三氟化硼基团替代缬氨酸及其类似物中的羧基，制备得到全新的放射性分子探针，在活体内对肌肉进行成像。利用三氟化硼与羧基在体内的化学相似性，缬氨酸三氟化硼及其类似物与天然分子在体内的性质相似，因此同样在肌肉中有特异性富集。本项发明弥补了有创性肌肉病理检查，可为DMD疾病治疗提供指导。

与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下优点：

(1)本发明的分子探针能够在肌肉中特异性富集，经放射性18F标记的分子探针可对活体肌肉进行成像，不需要提前对肌肉进行任何人工改造操作，即可在活体内对肌肉进行非创伤性PET成像。

(2)本发明的分子探针的肌肉摄取量与肌肉萎缩程度具有良好的相关性，可用于活体内肌萎缩程度评估、及肌肉萎缩后恢复情况评估，可为DMD疾病的治疗提供指导。

(3)本发明的分子探针可以在肌肉损伤早期检测出肌肉的损伤，相比于传统的肌肉病理检测更为灵敏。

(4)本发明的分子探针制备方法简单，生产效率高，通过同位素置换即可高效率标记18F。

附图说明

通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。在附图中：

图1为化合物1的1H NMR谱图；

图2为缬氨酸三氟化硼的质谱图；

图3为缬氨酸三氟化硼的19F NMR谱图；

图4为小鼠PET-CT成像图，左图为仅注射式II化合物分子探针，右图为共注射L-缬氨酸与式II化合物分子探针。

图5为式II化合物分子探针在小鼠中的肌肉摄取量，纵坐标表示18F-缬氨酸三氟化硼在小鼠的肌肉中的累积占比，ID/g是指每克组织的累计剂量相对于总注射计量的百分比。数据是平均值±标准偏差(n＝6)。****p<0.0001。

图6为随着Dmd KO小鼠周龄的增加，式II化合物分子探针的肌肉摄取量变化。**p<0.01。

具体实施方式

下面将参照附图更详细地描述本公开的示例性实施方式。虽然附图中显示了本公开的示例性实施方式，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。实施例中所用小鼠为SPF级实验小鼠，购于南京大学-南京生物医药研究院。

实施例1

本实施例提供了式II化合物(18F-缬氨酸三氟化硼，18F-FBV)的制备方法，其反应线路如下所示：

具体合成步骤为：

第1步、化合物1的合成

向(S)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺(2.91g，24mmol)的四氢呋喃(20mL)溶液中加入钛酸四异丙酯(12mL，40mmol)和20mmol异丁醛，反应在室温下进行。通过TLC监测反应，然后在搅拌下用过量的水和乙酸乙酯淬灭，最后用硫酸钠和硅藻土过滤。将固相用乙酸乙酯洗涤数次，同时通过硅胶柱色谱法用石油醚/乙酸乙酯(10：1)纯化混合相，用无水Na2SO4干燥，得到化合物1。如图1所示，NMR光谱结果：1H NMR(400MHz,CDCl3,20℃,δ,ppm):δ7.99(d，J＝4.4Hz，1H),2.72(pd，J＝6.9,4.4Hz,1H),1.19(s,9H),1.18(d，J＝2.1Hz，3H),1.16(d，J＝2.1Hz,3H)。

第2步、化合物2的合成

向三环己基膦四氟硼酸盐(51.6mg，0.14mmol，2.4mol％)溶液的圆底烧瓶中依次加入甲苯(5mL)，硫酸铜水溶液(9.5mL，60mM，0.57mmol，1.0mol％)和苄胺(62μL，0.57mmol，1.0mol％)，加盖搅拌混合物10min，之后加入甲苯(45mL)，第1步产物(5.7mmol，1.0当量)和双(频哪醇合)二硼(2.9mg，11.4mmol，2.0当量)。重新盖上小瓶，将反应混合物快速搅拌24h。将所得溶液真空浓缩，得到化合物2。

第3步、式I化合物的合成

向第2步的产物(1.73mg，5.7mmol)中加入氟氢化钾(3M，水溶液，23mL)，氯化氢(4M，水溶液，1.4mL)和乙腈(MeCN，25mL)。反应在室温下于50ml Eppendorf管中反应2h，然后通过硅胶柱色谱法用二氯甲烷/甲醇(20：1至10：1)纯化，得到缬氨酸三氟化硼，即式I化合物。如图2、图3所示LC-MS(m/z)：C5H14BF3N的计算值，[M-H]-140.10。实测值：140.02.NMR光谱：19F NMR(500MHz,,CD3CN,20℃,δ,ppm):-147.57。

第4步、式II化合物的合成

将第3步产物(250nmol)重悬于5μL哒嗪-HCl缓冲液(pH 2.0至2.5，哒嗪1M,N,N'-二甲基甲酰胺6M)中。通过添加30μL 18F-氟化物水溶液(～20mCi)开始放射性标记反应。将反应在85℃下反应15min，然后用0.5ml生理盐水淬灭。通过中性氧化铝柱除去剩余的游离18F-，得到18F-缬氨酸三氟化硼，即式II化合物。其放射化学产率为55±5.0％，放射化学纯度超过98％，且比活度为1.73±0.17GBq/μmol(n＝15)。

实施例2小鼠活体肌肉PET成像

本实施例以小鼠为实验对象，进行活体肌肉PET成像检测。检测方法如下：

取实施例1制备得到的式II化合物，用生理盐水稀释，即制备得到分子探针注射液，将其由静脉注射入小鼠体内，注射液的注射体积为150μL，随后使其自由活动，注射结束0.5h后，使用异氟烷麻醉小鼠，进行PET-CT成像。

(1)分别向不同的健康小鼠注射式II化合物分子探针和L-缬氨酸，进行PET-CT成像。如图4所示，左图为仅注射式II化合物分子探针，右图为向小鼠共注射L-缬氨酸与式II化合物分子探针，可见在右图中，健康小鼠中分子探针的肌肉摄取被明显抑制。

如图5所示，仅注射式II化合物分子探针的健康小鼠肌肉摄取为1.73±0.09％ID/g，而共注射过量的天然L-缬氨酸导致分子探针的肌肉摄取显著减少至0.85±0.11％ID/g，即导致式II化合物分子探针的摄取量被抑制了51％。

综上可知，本发明提供的分子探针可以在肌肉中很好的富集，并且在该部分的摄取可以被天然的缬氨酸有效抑制。

(2)以敲除Dmd基因(Dmd KO)的小鼠为实验对象，检测式II化合物分子探针的肌肉摄取量。如图6所示，图中SUV值(标准化摄取量)表示探针在肌肉中的摄取量，该数值随着Dmd KO小鼠周龄的增加(即肌肉萎缩程度增加)而逐渐减少，二者之间有着很好的相关性，并且具有高度灵敏性。因此，本发明提供的分子探针可以很好的在活体内对肌肉进行成像，并对肌肉的萎缩程度及功能进行评估。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

一种肌肉PET成像分子探针及其制备方法与应用专利购买费用说明

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A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。