专利摘要

本发明公开了一种利用甘油保护纳米铂颗粒催化活性的方法，将纳米铂颗粒分散于0.1～100％的甘油水溶液中，或将含有纳米铂颗粒的溶液的溶剂置换为0.1～100％的甘油水溶液，可有效保护纳米铂的催化双氧水分解的活性，避免该活性在储存过程中降低甚至丧失。本发明获得的纳米铂颗粒可在表面修饰功能性分子，具有良好的生物相容性，因此可被应用于生物分析或生物医学等领域。

权利要求

1.一种利用甘油保护纳米铂颗粒催化活性的方法，其特征在于：将纳米铂颗粒分散于5～55％的甘油水溶液中，或将含有纳米铂颗粒的溶液的溶剂置换为5～55％的甘油水溶液；所述纳米铂颗粒为新合成的纳米铂颗粒；所述纳米铂颗粒表面修饰有生物素；所述纳米铂颗粒具有晶体簇结构；所述纳米铂颗粒在所述甘油水溶液中的浓度不低于1mmol/L。

2.根据权利要求1所述的利用甘油保护纳米铂颗粒催化活性的方法，其特征在于：所述置换的方法为将含有纳米铂颗粒的溶液在10000～15000rpm离心5～15min，去除上清液，沉淀以所述5～55％的甘油水溶液重悬并混匀。

3.根据权利要求1所述的利用甘油保护纳米铂颗粒催化活性的方法，其特征在于：所述纳米铂颗粒的合成方法包括：在煮沸同时搅拌的条件下，采用抗坏血酸还原氯铂酸，以合成所述纳米铂颗粒。

4.根据权利要求3所述的利用甘油保护纳米铂颗粒催化活性的方法，其特征在于：采用抗坏血酸还原氯铂酸合成纳米铂颗粒后，10000～15000rpm离心5～15min，去除上清液，沉淀以所述5～55％的甘油水溶液重悬并混匀。

说明书

技术领域

本发明属于纳米铂颗粒制备技术领域，具体涉及一种利用甘油保护纳米铂颗粒催化活性的方法，能够得到高度稳定且生物相容性良好的纳米铂颗粒。

背景技术

纳米粒颗粒具有较高的比表面积、多样化的形态，因此具有较强的催化双氧水分解产生氧气等催化活性，已经成为近年来的研究热点之一。尤其是表面修饰有多种功能性分子的纳米铂颗粒，在电催化、生物分析、化学/生物传感、燃料电池等领域应用广泛。然而，纳米铂的催化活性的稳定性较差。由于纳米颗粒团聚等原因，其在保存过程中往往会出现催化活性不规律性降低的现象。实验发现，纳米铂在无特殊保护时，其催化活性只能维持7天左右，给基于纳米铂催化活性的应用带来较大的困难。目前，解决该问题的方法之一，是寻找一种合适的载体，如炭黑、介孔碳、金属氧化物纳米材料、石墨烯纳米片等。而这些固相载体，会在一定程度上影响纳米铂颗粒的催化活性，且其在生物体系中的应用受到较大的限制。此外，由于纳米铂与载体(如炭黑)之间的相互作用力较弱，载体上附着的纳米铂颗粒较易从载体上掉落。研究表明，在燃料电池应用中，纳米铂颗粒从载体掉落并发生团聚，是燃料电池效能降低的主要原因。因此，纳米铂催化活性降低的的问题限制了纳米铂的应用，亟待解决。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供了一种利用甘油保护纳米铂颗粒催化活性的方法，简单合理，可操作性强，纳米铂颗粒高度稳定且生物相容性好。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案之一是：

一种利用甘油保护纳米铂颗粒催化活性的方法，将纳米铂颗粒分散于0.1～100％(体积百分比，下同)的甘油水溶液中，或将含有纳米铂颗粒的溶液的溶剂置换为0.1～100％的甘油水溶液。

一实施例中：所述置换的方法为将含有纳米铂颗粒的溶液在10000～15000rpm离心5～15 min，去除上清液，沉淀以所述0.1～100％的甘油水溶液重悬并混匀。

一实施例中：所述纳米铂颗粒为新合成的纳米铂颗粒。

一实施例中：所述纳米铂颗粒具有晶体簇结构。

一实施例中：所述纳米铂颗粒表面修饰有功能性分子，所述功能性分子例如为生物素。

一实施例中：所述纳米铂颗粒的合成方法包括：在煮沸同时搅拌的条件下，采用抗坏血酸还原氯铂酸，以合成所述纳米铂颗粒。这种方法合成的纳米铂颗粒催化双氧水分解产生氧气的活性较高。

一实施例中：采用抗坏血酸还原氯铂酸合成纳米铂颗粒后，10000～15000rpm离心5～15 min，去除上清液，沉淀以所述0.1～100％的甘油水溶液重悬并混匀。

一实施例中：所述甘油水溶液的浓度为5～55％。

一实施例中：所述纳米铂颗粒在所述甘油水溶液中的浓度不低于1mmol/L。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案之二是：

一种保护于甘油中的纳米铂颗粒，所述纳米铂颗粒可以具有晶体簇结构；所述纳米铂颗粒表面还可以修饰有功能性分子，所述功能性分子例如为生物素。

本技术方案与背景技术相比，它具有如下优点：

本发明中采用生物相容性能优良的甘油作为保护剂，可保护纳米铂颗粒的催化活性在较长时间内保持稳定。甘油作为食品添加剂，可用做食品的水分保护剂和乳化剂，其具有良好的生物相容性，因此甘油保护的纳米铂颗粒可较好地应用于生物体系，在生物分析/生物传感等领域具有较好的应用前景。且甘油保护的纳米铂颗粒为胶体状态，纳米铂颗粒不会从保护剂中脱离而失去保护，较好地解决了固相载体所遇到的纳米颗粒脱落的问题。从而获得了一种催化活性稳定、生物相容性好、应用范围较广的纳米铂颗粒。

甘油保存其他种类的纳米粒子目前已有报道，甘油可以改善其他种类的纳米粒子的分散性。但甘油保存纳米铂并无报道，这是因为甘油在空气中会自发氧化，而纳米铂颗粒会极大地加速这一氧化过程，因此传统意义上认为无法用甘油来保存纳米铂颗粒。但本发明在合成纳米铂之后再将纳米铂颗粒分散于甘油水溶液中或者将纳米铂颗粒的溶剂置换为甘油水溶液，不仅没有影响纳米铂颗粒的合成，还显著延长了纳米铂颗粒的保存时间并保留了催化活性。据分析，可能存在如下机制：

纳米铂颗粒的催化活性主要受到两方面因素的影响，一是团聚，另一个是毒化，毒化是指纳米铂表面的催化活性位点被空气中的氧气、二氧化碳、一氧化碳等氧化性的小分子占据，导致真正的底物无法接近。但本发明将纳米铂颗粒保存于甘油中后，甘油分子比其他氧化性小分子更易被纳米铂颗粒氧化，因此纳米铂颗粒会优先氧化甘油分子，纳米铂颗粒与甘油分子之间形成铂氧键，从而在纳米铂颗粒的表面形成一层具有疏松网状结构的保护层，甘油分子的多氢键能够扩大这一保护层：氧化性小分子在穿过保护层的过程中接触到甘油即被还原，接近纳米铂的机会大大减少，从而防止纳米铂颗粒被氧化性小分子毒化。本发明发现，通过将特定浓度的纳米铂颗粒充分分散混匀于特定浓度的甘油中，使得纳米铂颗粒对甘油产生适度氧化，形成铂氧键和保护层，能够避免其他氧化性小分子对甘油的毒化效应，并且甘油可以改善纳米铂颗粒的团聚。同时，催化的底物分子小于网孔，能够穿过保护层与纳米铂接触，到达纳米铂颗粒的催化活性位点，因此甘油保护不会影响纳米铂颗粒的催化活性。实验结果也显示，在甘油中长时间保存后纳米铂颗粒的催化活性仍然保持稳定，没有任何降低，与上述推测理论相符。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

图1为本发明中合成的纳米铂颗粒形态及采用甘油保护其催化活性稳定性的结果，其中a 为新合成的纳米铂颗粒透射电镜图，其中内嵌小图左图为纳米铂颗粒粒径分布分析图，内嵌右图为纳米颗粒透射电镜放大图；b为甘油保护纳米铂颗粒催化活性稳定性可行性实验结果。

图2为甘油对修饰有生物素的纳米铂颗粒的催化活性的保护作用示意图，其中a为在纳米铂颗粒表面修饰生物素的拟合线性结果；b为修饰生物素的纳米铂颗粒采用甘油或PBST保存条件下，其催化活性稳定性实验结果。

图3为甘油或PBST保存的纳米铂颗粒细胞毒性测试结果。

图4为不同条件下的甘油保存纳米铂颗粒的结果，其中a为不同甘油浓度的保存结果；b 为不同纳米铂颗粒浓度的保存结果。

图5为甘油保护纳米铂颗粒催化活性机理分析示意图，其中a为甘油、PBST和超纯水重悬后，纳米铂颗粒表面带电量测试结果；b为甘油、PBST和超纯水重悬后，纳米铂颗粒水合动力半径测试结果；c为各组纳米铂颗粒的UV-Vis吸收光谱，d为高倍显微镜观察甘油重悬后纳米铂颗粒形态。

具体实施方式

下面通过实施例具体说明本发明的内容：

实施例1：合成纳米铂颗粒及不同溶剂重悬的纳米铂颗粒催化活性的稳定性研究

取圆底烧瓶，王水浸泡过夜后以去离子水洗净。吸取去离子水45mL于圆底烧瓶内，并加入100mmol/L的氯铂酸水溶液0.5mL，搅拌并加热。煮沸后，迅速加入0.4mol/L的抗坏血酸水溶液5mL，继续搅拌。待溶液变为黑色后，继续加热并搅拌30min，以促进纳米铂颗粒稳定。随后在搅拌下冷却至室温，即得纳米铂颗粒溶液，该纳米铂颗粒溶液中铂单质浓度为1mmol/L。取纳米铂颗粒溶液1μL，滴于支持铜网拍摄透射电镜图，结果如图1a所示，可见本发明所得的纳米铂颗粒其实为超小纳米铂颗粒组成的纳米铂颗粒簇(图1a内嵌右图，下称为纳米铂颗粒)。该纳米铂颗粒尺寸较均一，为33.9±3.1nm，其粒径基本呈正态分布(图1a内嵌左图)。

取新合成的纳米铂颗粒溶液三份，各2mL，分别标记为PtNPs-甘油组、PtNPs-PBST组和 PtNPs-水组，14000rpm离心5min后去除上清液，沉淀分别以2mL 50％甘油、PBST(pH7.4，含1％Tween 20和0.5％BSA)和超纯水重悬并混匀，置于37℃保存，以研究三种溶液保存纳米铂催化活性的稳定性。取上述三份纳米铂颗粒溶液各5μL于96孔板内，再加入2.5mol/L 的双氧水95μL，立即塞上密封塞，于37℃反应5min，以便携式气压计测定各孔内气压值，其中对照组以超纯水取代纳米铂颗粒溶液，其余操作相同。以表征纳米铂颗粒的催化活性，结果如图1b所示。三组纳米铂颗粒的最初催化活性基本一致，但至第8天时PtNPs-水组的纳米铂即完全团聚，无法继续测定催化活性，表明超纯水保存的纳米铂颗粒稳定性差。至第16天时，PtNPs-PBST组纳米铂颗粒的催化活性开始降低，第32天时，其催化活性仅剩第一次表征时的约1/22。而50％甘油保存的纳米铂颗粒，及至本组实验结束，催化活性基本保持不变，证明甘油可有效保护纳米铂颗粒催化活性的稳定性。

实施例2：甘油对表面修饰生物素的纳米铂颗粒催化活性的保护作用

为进一步将甘油保护的纳米铂应用于生物检测和生物分析领域，需要在纳米铂颗粒表面修饰功能性分子，如生物素。修饰生物素的步骤如下：

按照实施例1方法新合成纳米铂颗粒。向6mL新合成的纳米铂颗粒溶液中加入1％的Tween 20水溶液60μL，100μmol/L的巯基甲氧基聚乙二醇(mercapto-methoxypolyethylene glycol， mPEG-SH)30μL，混匀后再加入120μmol/L的生物素化巯基聚乙二醇(biotin-PEG-SH)60μL 和0.2mol/L的磷酸水溶液(H3PO4)300μL，混匀后于37℃孵育1h。孵育完成后14000rpm 离心5min，去除上清液，沉淀即为修饰生物素的纳米铂(Biotin-PtNPs)，以6mL PBS重悬后，均分为三份，各2mL。取其中一份验证纳米铂颗粒修饰生物素是否成功，具体步骤如下：取链霉亲和素偶联磁珠(SA-MB)，依次以PBS稀释为100、50、25、12.5、6.25、3.125μg/mL，每份50μL，并设置3个平行样品，再各加入Biotin-PtNPs 50μL，于37℃孵育30min。磁分离后去除上清液，沉淀以100μL PBS重悬并混匀，每组取50μL于96孔板内，再加入100μL 2.5mol/L双氧水，37℃孵育10min后测定气压值。结果如图2a所示，可见随SA-MB浓度增加，气压值呈线性增大，表明在纳米铂表面修饰生物素成功，该Biotin-PtNPs可应用于生物分析/检测等领域。

取另两份分别以14000rpm离心5min，去除上清液，其中一份以2mL 50％甘油水溶液重悬，得Biotin-PtNPs-甘油；另一份以2mL PBST重悬，得Biotin-PtNPs-PBST。置于37℃保存，以研究两种溶液保存生物素化的纳米铂颗粒催化活性的稳定性。定期按照实施例1中方法测定该两组纳米铂催化活性，结果如图2b所示。其中对照组以超纯水取代纳米铂颗粒溶液，其余操作相同。可见修饰生物素后，以PBST保存的纳米铂颗粒催化活性降低了一半左右(与图1b 对比)，在保存过程中，其催化活性波动较大，且随保存时间延长逐渐丧失。而采用50％甘油保存的纳米铂颗粒，修饰生物素后其活性未见降低(与图1b对比)，尽管保存过程中其催化活性有轻微波动，但总体保持稳定且催化活性较高。证明本发明采用的甘油保护法可有效地保护修饰有生物素的纳米铂颗粒的催化活性。

实施例3：MTS法测定甘油保护的纳米铂的细胞毒性

以人结直肠癌细胞SW480为模型细胞，采用MTS[3-(4,5-diethylthiazol-2-yl) -5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-etrazolium,inner salt]法测定不同溶剂保护的纳米铂共同孵育后的SW480细胞的活力，以检验甘油保护的纳米铂的细胞毒性。

按照实施例1中方法新合成纳米铂颗粒。取新合成的纳米铂颗粒溶液2份，各50mL，14000 rpm离心5min后去除上清液，沉淀分别以1mL PBST或50％甘油重悬并混匀，得50mmol/L 的PtNPs-PBST和PtNPs-甘油，备用。

SW480细胞消化后分散于DMEM培养基(含10％胎牛血清，1％双抗)，轻柔混匀后分别加入96孔板内，95μL/孔，设置3组实验，分别为对照组、PtNPs-PBST组和PtNPs-甘油组，每组设置8个纳米铂浓度，分别为：3.00、2.50、2.00、1.50、1.00、0.50、0.25、0.125mmol/L，每个浓度3个平行孔。于37℃，5％CO2条件下培养48h后，分别加入上述50mmol/L的 PtNPs-PBST和PtNPs-甘油至设定的纳米铂浓度，并以DMEM培养基补足至100μL/孔，其中对照组每孔加入5μL DMEM培养基。混匀后于37℃，5％CO2条件下继续培养48h。加入 MTS溶液(10μL/孔)，与37℃，5％CO2条件下继续培养4h，酶标仪测定A490。结果如图3所示，以对照组细胞活力为100％，其他各组与对照组比较。可见各实验组的纳米铂对SW480 的细胞活力无显著影响。且可见PtNPs-甘油组的细胞活力稍高于PtNPs-PBST组，证明本发明所得的甘油保存的纳米铂颗粒无细胞毒性，可应用于生物分析/检测领域。

实施例4：不同保存条件的结果

不同甘油浓度的保存结果。按照实施例1中方法合成纳米铂颗粒。取新合成的纳米铂颗粒溶液6份，各2mL，分别标记为10％组、30％组、50％组、66.7％组、80％组和90％组。14000 rpm离心5min后，去除上清液。沉淀分别以2mL对应浓度的甘油水溶液重悬并混匀。取各组纳米铂颗粒，按照实施例1所述方法测定不同浓度甘油水溶液重悬后的纳米铂颗粒的催化活性，随后置于37℃保存，定期测定纳米铂颗粒的催化活性，以研究不同甘油浓度对纳米铂颗粒催化活性的保护作用，结果如图4a所示。由图4a内嵌图可知，不同浓度甘油保存的纳米铂催化活性较稳定，37℃保存至第77天，其催化活性依然稳定。但由于甘油浓度太高时，其溶液粘性太大，不利于其在生物分析/检测中的应用。且从图4a大图可知，10％，30％和50％甘油的保存效果稍优于高浓度组，因此，可选择较低浓度甘油保存纳米铂。

不同纳米铂浓度的保存结果。取新合成的纳米铂颗粒溶液50mL，14000rpm离心5min 后，去除上清液，沉淀以1mL 50％甘油重悬，得50mmol/L的PtNPs-甘油溶液。随后依次以 50％甘油稀释至3.125、1.5625、0.78125、0.390625、0.195和0.0976mmol/L后，置于37℃保存，并定期按照实施例1中方法测定各组纳米铂颗粒的催化活性，以研究纳米铂浓度对其储存过程中稳定性的影响，结果如图4b所示。发现纳米铂浓度高时，其催化活性保持得更好。低浓度保存时，其催化活性波动较大，且更易丧失部分催化活性。因此，浓缩后保存该纳米铂颗粒更合适。

实施例5：甘油保护纳米铂颗粒催化活性作用机理的研究

按照实施例1中方法合成纳米铂颗粒。取新和成的纳米铂颗粒3份，各2mL，分别标记为超纯水组、PBST组、甘油组。14000rpm离心5min后，去除上清液。沉淀分别以2mL的超纯水、PBST和50％甘油重悬并混匀。取各组纳米铂颗粒，测定其Zeta-电位(如图5a)和水合动力半径(如图5b)。由于采用抗坏血酸还原氯铂酸生成纳米铂，无特殊处理时，该纳米铂颗粒表面呈电负性，约-30mV。以PBST或甘油重悬后，其表面负电荷被部分中和，从而呈现电负性减小的趋势。甘油重悬后基本呈电中性。水合动力半径测试结果显示，无特殊处理时，纳米铂的水合动力半径约为34.45nm，以PBST或甘油重悬后，其水合动力半径显著增加，且PtNPs-甘油的水合动力半径高达2062.67nm。另取新合成的纳米铂颗粒，均分为7组，分别标记为PtNPs-超纯水组、PtNPs-10％甘油组、PtNPs-30％甘油组、PtNPs-50％甘油组、PtNPs-66.70％甘油组、PtNPs-80％甘油组和PtNPs-90％甘油组，14000rpm离心5min后，去除上清液，沉淀分别以相应溶剂重悬。混匀后测定各组纳米铂颗粒的UV-Vis吸收光谱(分别以相应溶剂为空白对照)，结果如图5c所示。仅以超纯水重悬的纳米铂，其无明显紫外可见吸收峰，仅在250nm 处和307nm处有一微弱吸收包。而当采用甘油保护后，其在250nm波长处有一最大吸收峰，且该吸收峰随甘油浓度增大而更加尖锐，同时其在307nm吸收峰降低。该UV-Vis吸收趋势表明纳米铂与甘油之间形成了Pt-O键，从而在纳米铂表面形成一层甘油保护层。此后，甘油分子之间的氢键作用可显著扩增该保护层，一方面可有效防止纳米铂颗粒团聚，另一方面，由于甘油分子含有多个羟基，其具有较好的还原活性，从而可有效防止溶剂或空气中的氧化性分子对纳米铂表面的催化活性位点产生毒化，从而防止纳米铂催化活性降低。进一步地，取50％甘油重悬的纳米铂颗粒溶液于高倍显微镜下观察，如图5d所示。其中内嵌小图为局部放大显微图。可较明显地看见甘油分子在纳米铂颗粒表面形成的一层较厚的保护网，并因此形成更大的纳米铂颗粒簇。尽管纳米铂颗粒簇的尺寸分布较大，但对其催化活性没有影响。

综上所述，可以推测甘油保护纳米铂催化活性的机理为：甘油在纳米铂颗粒表面形成一层较厚的保护层，从而避免纳米铂颗粒发生团聚，保护纳米铂颗粒的催化活性。

以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

一种利用甘油保护纳米铂颗粒催化活性的方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。