专利摘要

本发明的目的在于提供表达多种人抗体的禽B细胞。本发明将以下的禽B细胞作为解决手段，所述禽B细胞是在抗体轻链基因座中，插入来源于人抗体轻链可变区和人抗体轻链恒定区的DNA序列的全部或一部分，或用来源于人抗体轻链可变区和人抗体轻链恒定区的DNA序列的全部或一部分取代，以及在抗体重链基因座中，插入来源于人抗体重链可变区和人抗体重链恒定区的DNA序列的全部或一部分，或用来源于人抗体重链可变区和人抗体重链恒定区的DNA序列的全部或一部分取代，以及在抗体轻链假基因座中，插入2个以上来源于人抗体轻链可变区的DNA序列，或用2个以上来源于人抗体轻链可变区的DNA序列取代，和/或在抗体重链假基因座中，插入2个以上来源于人抗体重链可变区的DNA序列，或用2个以上来源于人抗体重链可变区的DNA序列取代。

权利要求

1.一种禽B细胞，其特征在于，在禽抗体轻链基因座中，用来源于人抗体轻链可变区和人抗体轻链恒定区的DNA序列取代，在禽抗体重链基因座中，插入来源于人抗体重链可变区和人抗体重链恒定区的DNA序列，在禽抗体轻链假基因座中，用25个以上来源于人抗体轻链可变区的DNA序列取代，和在禽抗体重链假基因座中，插入30个以上来源于人抗体重链可变区的DNA序列，具有在细胞膜表面表达人抗体且在培养液中分泌人抗体的能力。

2.根据权利要求1所述的禽B细胞，其特征在于，在抗体轻链基因座中插入的来源于人抗体轻链可变区的DNA序列的位置位于来源于人抗体轻链恒定区的DNA序列所存在的位置的上游，以及在抗体重链基因座中插入的来源于人抗体重链可变区的DNA序列的位置位于来源于人抗体重链恒定区的DNA序列所存在的位置的上游。

3.根据权利要求1或2所述的禽B细胞，其特征在于，所述人抗体重链是γ链。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的禽B细胞，其特征在于，所述人抗体轻链是λ链或κ链。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的禽B细胞，其特征在于，禽B细胞是DT40细胞。

6.根据权利要求1～5中任一项所述的禽B细胞，其中，进行使染色质松弛的处理。

7.根据权利要求6所述的禽B细胞，其中，所述使染色质松弛的处理是使该禽B细胞中的组蛋白去乙酰化酶的功能降低或丧失。

8.根据权利要求7所述的禽B细胞，其中，所述使组蛋白去乙酰化酶的功能降低或丧失的方法是使该禽B细胞中的组蛋白去乙酰化酶基因的表达降低或丧失。

9.根据权利要求8所述的禽B细胞，其特征在于，所述组蛋白去乙酰化酶是HDAC2。

10.根据权利要求7所述的禽B细胞，其特征在于，所述使组蛋白去乙酰化酶的功能降低或丧失的方法是利用HDAC抑制剂处理。

11.一种由权利要求6～10中任一项所述的禽B细胞构成的产生抗体的细胞文库。

12.一种由权利要求1～10中任一项所述的禽B细胞制造人抗体或人型抗体的方法，包括：为了产生人抗体或人型抗体而将该B细胞在适于禽B细胞的培养条件下进行培养，产生该抗体。

13.根据权利要求12所述的的方法，其特征在于，所述抗体被用于医药品。

14.一种通过权利要求12所述的方法取得的抗体，与各种抗原反应，由权利要求11所述的细胞文库产生。

15.一种用于制造权利要求1～10中任一项所述的禽B细胞的试剂盒。

16.一种用于通过权利要求12所述的方法产生抗体的试剂盒。

说明书

技术领域

本发明涉及产生人抗体的细胞。更具体而言，涉及产生人抗体的禽B细胞。

背景技术

抗体在进行生物物质的确定、功能解析等方面是有用的，此外，在疾病的治疗中抗体发挥的作用也大。抗体在生物体内与特定的抗原结合，引起各种生物体内防御反应，例如抗体依赖性细胞伤害(ADCC)活性、补体依赖性细胞伤害(CDC)活性，识别对于生物体而言的“异物”，进行除去。着眼于这样的抗体的能力，抗体医药的开发近年来已经积极地进行。在进行多种多样的疾病的治疗时，需要迅速、简便提供识别各种靶抗原的抗体。

目前为止，作为制备具有期望的物理学、生理学特征的抗体组的方法，已使用单克隆抗体的制造技术。制造单克隆抗体时，通常采用使利用生物体内免疫产生的B细胞与骨髓瘤融合的杂交瘤法。但是，该方法除了由于生物体内免疫的利用而产生的免疫耐受之外，还存在取得最终期望的抗体之前花费时间和劳动等大量问题。

作为克服免疫耐受的问题的技术，开发了不利用生物体内免疫的方法。该方法是在噬菌体粒子中埋入由各种抗体的可变区构成的单链抗体(single chain valuable fragment:scFv)基因，使单链抗体基因产物在噬菌体上展示，从利用该噬菌体所得到的单链抗体文库取得与目的抗原具有亲和性的克隆的方法，被称为噬菌体展示法。该技术在避免免疫耐受方面是优异的，但是由于从噬菌体文库得到的克隆是单链的，因此需要通过重组DNA技术等制备由双链构成的完全型的抗体。此外，在将单链抗体制成完全型抗体的过程中亲和性也会产生变化，需要调整可变区序列的情况也不少。因此，在时间和劳动方面，与利用生物体内免疫的方法相比，很难说特别地有进展。

作为克服上述已知的单克隆抗体制造技术的课题的方法，报告了ADLib系统(专利文献1和非专利文献1)和对ADLib系统进一步进行改良的方法(专利文献2)。ADLib系统是，能够简便制备对所有类型的抗原具有期望的结合特性的多种抗体的技术。该方法是从利用自主进行抗体基因的多样化的来源于鸡B细胞的细胞株DT40构建的抗体文库选择性取得期望的抗体的技术。ADLib系统在体外系统抗体制造技术的优点即能够回避免疫耐受的方面，在迅速得到IgM型的完全抗体方面，与现有技术相比是优异的。

通常，将抗体作为医药品对动物、人给药时，考虑到将体内的免疫原性最小化，要求与其动物种的类型匹配。因此，利用DNA重组技术制造将由小鼠等制造的单克隆抗体的恒定区取代为人型的嵌合抗体、将抗体的抗原识别部位(complementarity determining region:CDR)移植入人抗体的人化抗体。但是，在嵌合化·人化的过程中亲和性、功能也产生变化，能够制造保持功能的人化抗体的概率并非很高。此外，由于这些嵌合抗体或人化抗体来源于其他动物种的区域少，虽然与原单克隆抗体相比免疫原性低，但是由于抗原识别部位具有免疫原性，因此也存在出现抗抗体的问题。

因此，尝试对小鼠基因导入人抗体基因来制造产生人抗体的动物。专利文献3中，将含有人抗体基因的染色体片段的微细胞移植入小鼠ES细胞，由该ES细胞制造嵌合小鼠，由此制造表达人抗体的嵌合小鼠。此外，非专利文献2中，通过将小鼠抗体基因座的基因组DNA取代为对应的人抗体基因座的基因组DNA，制造表达人抗体的嵌合小鼠。在任意的方法中，虽然均能够取得具有完全来源于人抗体基因的抗原识别部位的抗体，但是由于仍然利用了生物体内免疫，因此，在取得最终期望的抗体之前仍存在需要时间和劳动的问题。

以上这类状况中，即使是使用ADLib系统的情形，为了制备抗体医药，需要由禽B细胞产生具有来源于人的氨基酸序列的抗体的方法。此外，为了进行各种疾病的治疗，需要简便产生具有多种抗原识别特性的抗体组的技术。

但是，与将人抗体基因导入至小鼠进行“人化”的情形不同，将禽B细胞“人化”时，抗体的多样化系统的不同成为问题。因为在禽、兔子、牛、羊等动物的情形中，在抗体可变区的上游，存在与可变区类似的序列且其自身不作为抗体基因表达的被称为假基因的序列集中的区域，通过被称为基因转变的现象可变区序列的全部或一部分被假基因序列改写，从而产生多种序列。在人、小鼠等动物中，通过V(D)J重组引起抗体的多样化，而在禽、兔子、牛、羊等动物中，通过基因转变这一完全不同的机理引起抗体的多样化。此外，假基因区域有时成为含有非常大量的重复序列的结构，该区域的序列解析非常困难，即使在2015年3月的时间点也不能解码禽抗体重链假基因区域。由于这样的机理的不同、抗体基因座的结构上的问题，因此认为由禽B细胞构建产生期望的人抗体的系统是非常困难的。

在这样的背景下，报告了制造将存在于DT40细胞的抗体基因座的可变区和假基因区域取代为来源于人的序列的细胞株(非专利文献3)。该文献中，将禽抗体可变区取代为含有属于荧光蛋白质的绿色荧光蛋白质(GFP)和青色荧光蛋白质(CFP)以及属于重组酶识别部位的attP序列的基因序列后，利用重组酶制造插入人抗体可变区和后述的假基因序列的DT40细胞，确认发生基因转变(非专利文献3、4)。但是，由于恒定区直接利用来源于禽的序列，因此表达的抗体分子是人-禽的嵌合抗体，抗体的免疫原性非常高。此外，由于轻链成为来源于人的κ链与来源于禽的λ链的融合蛋白，因此该抗体分子与天然的人抗体大大不同。因此，在制造人的治疗用抗体中需要进一步的嵌合化的操作，在嵌合化·人化的过程中仍然存在亲和性、功能产生变化的可能性。此外，此处使用的假基因区域的序列，关于轻链，利用了将插入的人抗体可变区的各个CDR序列每个CDR为1个氨基酸地取代为Tyr或Trp的人工序列的集合体即minimalist library、对天然存在的人抗体可变区的变体在框架区实施变异的序列，关于重链，由将插入的人抗体可变区的各个CDR序列每个CDR为1个氨基酸地取代为Tyr或Trp的人工序列和其变异序列构成。这些序列是以利用少的假基因应对多种抗原作为目的而设计的序列，但是关于该细胞中的抗原特异性的抗体的取得没有报告。

现有技术文献

专利文献

专利文献1:日本特许第4214234号

专利文献2:WO2008/047480

专利文献3:WO97/07671

非专利文献

非专利文献1:Seo et al,Nature Biotech,Volume 23,pp731-735,2005

非专利文献2:Recombinant Antibodies for Immunotherapy,pp100-108,2009,Cambridge Press

非专利文献3:Schusser et al,PLOS ONE,Volume 8issue 11e80108,2013

非专利文献4:Leighton et al,Frontiers in Immunology,Volume 6Article 126,2015

发明内容

鉴于上述事实，本发明的目的在于提供产生多种人抗体的禽B细胞。

此外，本发明的目的在于提供从该禽B细胞产生抗体的方法。

发明人等对产生多种人抗体的细胞的制造进行深入研究，最终在禽B细胞的抗体轻链和重链基因座中，插入或取代人抗体的轻链和重链的可变区和恒定区的基因后，成功取得表达人抗体的转化细胞。此外，发明人等进一步制造了在轻链·重链中插入多个来源于人的抗体可变区序列作为假基因的转化细胞，并将该细胞进行HDAC抑制剂处理后，确认与原来的禽B细胞同样地引起基因转变。此外，发明人等成功实现从该细胞产生抗原特异性的人抗体。

即，发明人等确认通过制备上述细胞，从该细胞能够取得可变区进行各种改变的抗体，成功产生人抗体且多种抗体，从而完成本发明。

即，本发明是以下的(1)～(21)。

(1)一种禽B细胞，在抗体轻链基因座中，插入来源于人抗体轻链可变区和人抗体轻链恒定区的DNA序列的全部或一部分，或用来源于人抗体轻链可变区和人抗体轻链恒定区的DNA序列的全部或一部分取代，以及，在抗体重链基因座中，插入来源于人抗体重链可变区和人抗体重链恒定区的DNA序列的全部或一部分，或用来源于人抗体重链可变区和人抗体重链恒定区DNA序列的全部或一部分取代，以及，在抗体轻链假基因座中，插入2个以上来源于人抗体轻链可变区的DNA序列，或用2个以上来源于人抗体轻链可变区的DNA序列取代，和/或，在抗体重链假基因座中，插入2个以上来源于人抗体重链可变区的DNA序列，或用2个以上来源于人抗体重链可变区的DNA序列取代。

(2)根据上述(1)记载的禽B细胞，其特征在于，在抗体轻链假基因座中插入的或者取代该抗体轻链假基因座的序列的、来源于人抗体轻链可变区的DNA序列的数量是5个以上。

(3)根据上述(1)记载的禽B细胞，其特征在于，在抗体重链假基因座中插入的或取代该抗体重链假基因座的序列的、来源于人抗体重链可变区的DNA序列数量是5个以上。

(4)根据上述(1)记载的禽B细胞，其特征在于，在抗体轻链假基因座中插入的或取代该抗体轻链假基因座的序列的、来源于人抗体轻链可变区的DNA序列的数量是15个以上。

(5)根据上述(1)记载的禽B细胞，其特征在于，在抗体重链假基因座中插入的或取代该抗体重链假基因座的序列的、来源于人抗体重链可变区的DNA序列的数量是15个以上。

(6)根据上述(1)～(5)中任一项记载的禽B细胞，其特征在于，在抗体轻链基因座中插入的来源于人抗体轻链可变区的DNA序列的位置位于来源于人抗体轻链恒定区的DNA序列所存在的位置的上游，以及在抗体重链基因座中插入的来源于人抗体重链可变区的DNA序列的位置位于来源于人抗体重链恒定区的DNA序列所存在的位置的上游。

(7)根据上述(6)记载的禽B细胞，其特征在于，在抗体轻链基因座中插入的来源于人抗体轻链可变区的DNA序列和来源于恒定区的DNA序列的位置与禽抗体轻链可变区和恒定区的位置相比位于上游，以及在抗体重链基因座中插入的人抗体重链可变区和恒定区的位置与禽抗体重链可变区和恒定区的位置相比位于上游。

(8)根据上述(1)～(7)中任一项记载的禽B细胞，其特征在于，上述人抗体重链是γ链。

(9)根据上述(1)～(8)中任一项记载的禽B细胞，其特征在于，上述人抗体轻链是λ链或κ链。

(10)根据上述(1)～(9)中任一项记载的禽B细胞，其特征在于，上述禽B细胞具有在细胞表面表达人抗体且还在培养液中分泌人抗体的能力。

(11)根据上述(1)～(10)中任一项记载的禽B细胞，其特征在于，禽B细胞是DT40细胞。

(12)根据上述(1)～(11)中任一项记载的禽B细胞，进行使染色质松弛的处理。

(13)根据上述(12)记载的禽B细胞，其中，上述使染色质松弛的处理是使该禽B细胞中的组蛋白去乙酰化酶的功能降低或丧失。

(14)根据上述(13)记载的禽B细胞，其中，上述使组蛋白去乙酰化酶的功能降低或丧失的方法是使该禽B细胞中的组蛋白去乙酰化酶基因的表达降低或丧失。

(15)根据上述(14)记载的禽B细胞，其特征在于，上述组蛋白去乙酰化酶是HDAC2。

(16)根据上述(13)记载的禽B细胞，其特征在于，上述使组蛋白去乙酰化酶的功能降低或丧失的方法是利用HDAC抑制剂处理。

(17)由上述(12)～(16)中任一项记载的禽B细胞构成的产生抗体的细胞文库。

(18)由上述(1)～(16)中任一项记载的禽B细胞制造抗体的方法。

(19)通过上述(18)记载的方法取得的抗体。

(20)用于制造上述(1)～(16)中任一项记载的禽B细胞的试剂盒。

(21)用于通过上述(18)记载的方法产生抗体的试剂盒。

由本发明的细胞，能够简便且迅速地取得识别多种抗原的人抗体。

附图说明

图1是示意性地表示用于将DT40细胞的抗体轻链恒定区和抗体轻链可变区用来源于人的抗体(IgG)轻链恒定区和抗体轻链可变区进行取代的靶向载体的结构的图。cpV1～cpV3：禽假基因

图2是示意性地表示用于在DT40细胞的抗体轻链假基因区域下游，插入基因转变确认用序列(GC确认序列；由来源于人抗体可变区的序列构成的人假基因。以下相同)的靶向载体的结构的图。cpV1～cpV3：禽假基因

图3是示意性地表示用于DT40细胞的抗体轻链假基因区域的缺失、和将DT40细胞的抗体轻链假基因区域用GC确认序列进行取代的靶向载体的结构的图。cpV25、cpV1：禽假基因

图4是示意性地表示用于将DT40细胞的抗体重链恒定区和抗体可变区用来源于人的抗体(IgG)重链恒定区和抗体重链可变区进行取代，进一步插入GC确认序列的靶向载体的结构的图。

图5是示意性地表示将DT40细胞的抗体轻链基因区域用来源于人的抗体轻链可变区和抗体轻链恒定区取代的顺序，和得到的DT40细胞的抗体轻链基因区域的图。cpV1～cpV3：禽假基因

图6是示意性地表示用于将DT40细胞的抗体轻链基因区域用来源于人的抗体轻链可变区和抗体轻链恒定区基因取代，进一步在DT40细胞的抗体轻链假基因区域的下游插入GC确认序列的顺序，和得到的DT40细胞的抗体轻链基因区域的图。cpV1～cpV3：禽假基因、hpV1～hpV2：人假基因

图7是示意性地表示用于将DT40细胞的抗体轻链基因区域用来源于人的抗体轻链可变区和抗体轻链恒定区基因取代，进一步使DT40细胞的抗体轻链假基因区域缺失的顺序，和得到的DT40细胞的抗体轻链基因区域的图。cpV25、cpV1：禽假基因

图8是示意性地表示用于将DT40细胞的抗体轻链基因区域用来源于人的抗体轻链可变区和抗体轻链恒定区基因取代，进一步将DT40细胞的假基因区域取代为GC确认序列的顺序，和得到的DT40细胞抗体轻链基因区域的图。cpV25、cpV1：禽假基因、hpV1、hpV2：人假基因

图9表示对在DT40细胞的抗体轻链基因区域插入来源于人的抗体轻链基因区域的细胞株、或将DT40细胞的抗体轻链基因区域用人抗体轻链基因取代的细胞株产生的抗体，利用流式细胞仪进行解析的结果。

图10是示意性地表示将DT40细胞的抗体重链基因区域变换为来源于人的抗体重链可变区和抗体重链恒定区的顺序，和得到的DT40细胞的抗体重链基因区域的图。

图11是示意性地表示用于将DT40细胞的抗体重链基因区域变换为来源于人的抗体重链可变区和抗体重链恒定区基因，进一步在DT40细胞的重链假基因区域的下游插入GC确认序列的顺序，和得到的DT40细胞的抗体轻链基因区域、以及使用的靶向载体的结构的图。hpV1、hpV2：人假基因

图12表示针对将DT40细胞的抗体重链基因区域变换为来源于人的抗体重链可变区和抗体重链恒定区基因、进一步在DT40细胞的重链假基因区域的下游插入GC确认序列的细胞株所产生的抗体，利用流式细胞仪进行解析的结果。

图13是示意性地表示将DT40细胞的抗体轻链的假基因区域用由来源于人Igλ的可变区的序列构成的假基因(人轻链假基因)进行取代的顺序，和得到的DT40细胞的抗体轻链区域，以及使用的靶向载体的结构的图。

图14是示意性地表示用于将DT40细胞的抗体重链恒定区取代为人IgG₁的重链基因区域的靶向载体的结构的图。

图15是示意性地表示用于在DT40细胞的抗体重链可变区导入来源于人的抗体重链可变区和5个由来源于人Igγ的可变区的序列构成的假基因(人重链假基因)的靶向载体的结构的图。

图16是示意性地表示将DT40细胞的抗体轻链基因区域用来源于人的抗体轻链可变区和抗体轻链恒定区取代并插入人轻链假基因序列(5个)的顺序，和得到的DT40细胞抗体轻链基因区域的图。cpV25、cpV1：禽假基因

图17是示意性地表示在DT40细胞的抗体重链基因区域导入来源于人的抗体重链可变区和抗体重链恒定区并插入人重链假基因序列(5个)的顺序，和得到的DT40细胞抗体重链基因区域的图。

图18表示针对将DT40细胞的抗体轻链基因区域和抗体重链基因区域变换为来源于人的抗体基因并插入人轻链假基因序列(5个)的细胞株所产生的抗体，利用流式细胞仪进行解析的结果。

图19是示意性地表示将DT40细胞的抗体轻链基因区域用来源于人的抗体轻链可变区和抗体轻链恒定区取代并插入人重链假基因序列(15个)的顺序，和使用的靶向载体的结构的图。pV25、pV1：禽假基因

图20是示意性地表示在DT40细胞的抗体重链基因区域导入来源于人的抗体重链可变区和抗体重链恒定区并插入人重链假基因序列(15个)的顺序，和使用的靶向载体的结构的图。

图21是针对将DT40细胞的抗体轻链基因区域和抗体重链基因区域变换为来源于人的抗体基因区域并插入人轻链假基因序列(15个)的L15/H15细胞株所产生的抗体，利用流式细胞仪进行解析的结果。

图22表示对于图21表示的结果，将存在错误的数据基于优先权日前的数据进行修正的结果。

图23是示意性地表示将DT40细胞的抗体重链可变区用来源于人的抗体重链可变区取代的同时在DT40细胞的抗体重链可变区中插入RMCE用盒序列的顺序，和使用的靶向载体的结构的图。

图24是示意性地表示在DT40细胞的抗体重链基因区域中插入30个人重链假基因序列的顺序，和使用的靶向载体的结构的图。

图25表示针对将DT40细胞的抗体轻链基因区域和抗体重链基因区域变换为来源于人的抗体基因区域并在轻链插入15个人轻链假基因序列、在重链插入30个人重链假基因序列的L15/H30细胞株所产生的抗体，利用流式细胞仪进行解析的结果。

图26是示意性地表示在DT40细胞的抗体轻链基因区域中插入30个人轻链假基因序列的顺序，和使用的靶向载体的结构的图。

图27表示针对将DT40细胞的抗体轻链基因区域和抗体重链基因区域变换为来源于人的抗体基因区域并在轻链插入30个人轻链假基因序列、在重链插入30个人重链假基因序列的L30/H30细胞株所产生的抗体，利用流式细胞仪进行解析的结果。

图28表示针对将DT40细胞的抗体轻链基因区域和抗体重链基因区域变换为来源于人的抗体基因区域并在轻链插入30个人轻链假基因序列、在重链插入15个人重链假基因序列的L30/H15细胞株所产生的抗体，利用流式细胞仪进行解析的结果。

图29是示意性地表示利用RMCE法在L30/H15细胞株的抗体重链基因区域中在正向或反向追加插入15个人重链假基因序列而合计为30个的顺序，和使用的靶向载体的结构的图。图中，for和rev分别是指正向、反向。以下，其他图中相同。

图30表示针对利用RMCE法在L30/H15细胞株的抗体重链基因区域中在正向或反向追加插入15个人重链假基因序列的细胞株(正向为L30/H15f15f细胞株，反向为L30/H15r15f细胞株)所产生的抗体，利用流式细胞仪进行解析的结果。

图31是示意性地表示在L30/H15f15f细胞株和L30/H15r15f细胞株的抗体重链基因区域中分别在正向或反向追加插入15个人重链假基因序列而合计为45个的顺序，和使用的靶向载体的结构的图。

图32表示针对在L30/H15f15f细胞株的抗体重链基因区域中在正向追加插入15个人重链假基因序列的细胞株(L30/H15f15f15f细胞株)所产生的抗体，利用流式细胞仪进行解析的结果。

图33表示针对在L30/H15r15f细胞株的抗体重链基因区域中在反向追加插入15个人重链假基因序列的细胞株(L30/H15r15r15f细胞株)所产生的抗体，利用流式细胞仪进行解析的结果。

图34是示意性地表示利用RMCE法在L30/H15f15f15f细胞株和L30/H15r15r15f细胞株的抗体重链基因区域中分别在正向或反向追加插入15个人重链假基因序列而合计为60个的顺序，和使用的靶向载体的结构的图。

图35表示针对在DT40细胞的抗体轻链基因区域中插入30个人轻链假基因序列、在抗体重链基因区域中插入60个人重链假基因的细胞株所产生的抗体，利用流式细胞仪进行解析的结果。

图36表示由TSA处理的L15/H15细胞株，使用ADLib系统分离与Plexin A4蛋白质结合的细胞团，利用流式细胞仪进行解析的结果。

图37表示对图36的P5区的细胞团进行单细胞分选(single cell sorting)后，在96孔板上播种培养，对各孔的细胞上清进行ELISA解析的结果。横轴表示作为测定样品的细胞上清所来源的96孔板的各孔划分的编号。Trypsin inhibitor:胰蛋白酶抑制剂、SA：链霉亲和素、OA：卵清蛋白

图38表示利用蛋白质印迹法(Western Blot)，对阳性克隆的#62和#20分泌的抗体进行分析。在还原和非还原的条件下处理样品，使用山羊抗人IgGγ抗体进行蛋白质印迹(Western Blotting)的结果。

图39表示利用蛋白质印迹法，对由阳性克隆#62和#20分泌的抗体进行分析。在还原和非还原的条件下处理样品，使用山羊抗人IgGλ抗体进行蛋白质印迹的结果。

图40表示利用蛋白质印迹法，对由阳性克隆#62和#20分泌的抗体进行分析。在还原和非还原的条件下处理样品，使用山羊抗禽IgM抗体进行蛋白质印迹的结果。

图41表示由TSA处理的L15/H15细胞株，使用ADLib系统对与His-AP-hSema3A结合的细胞团进行1次筛选的结果。

图42表示将与His-AP-hSema3A结合的细胞团单克隆化之后进行的2次筛选的结果。

图43表示利用蛋白质印迹法，对由2次筛选后的阳性克隆分泌的His-AP-hSema3A抗体进行分析。在还原和非还原的条件下处理样品，使用山羊抗人IgGγ抗体或山羊抗人IgGλ抗体进行蛋白质印迹的结果。

图44表示由TSA处理的L30/H45细胞株，使用ADLib系统对与IL-8结合的细胞团进行1次筛选的结果。

图45表示在将与IL-8结合的细胞团单克隆化之后进行的2次筛选的结果。

图46表示利用蛋白质印迹法，对由2次筛选后的阳性克隆分泌的IL-8抗体进行分析。在还原和非还原的条件下处理样品，使用山羊抗人IgGγ抗体或山羊抗人IgGλ抗体进行蛋白质印迹的结果。

具体实施方式

本发明的实施方式之一是禽B细胞，在抗体轻链基因座中，插入来源于人抗体轻链可变区和人抗体轻链恒定区的DNA序列的全部或一部分，或用来源于人抗体轻链可变区和人抗体轻链恒定区的DNA序列的全部或一部分取代，以及，在抗体重链基因座中，插入来源于人抗体重链可变区和人抗体重链恒定区的DNA序列的全部或一部分，或用来源于的人抗体重链可变区和人抗体重链恒定区的DNA序列的全部或一部分取代，以及，在抗体轻链假基因座中，插入2个以上来源于人抗体轻链可变区的DNA序列，或用2个以上来源于人抗体轻链可变区的DNA序列取代，和/或，在抗体重链假基因座中，插入2个以上来源于人抗体重链可变区的DNA序列，或用2个以上来源于人抗体重链可变区的DNA序列取代。

本发明的B细胞是来源于禽的产生抗体的B细胞，例如，能够举出来源于鸡的DT40细胞。除此以外，也能够使用具有通过基因转变使抗体序列多样化的系统的牛、羊、兔子等的B细胞。

此外，本发明的禽B细胞，在其抗体轻链基因座中，插入来源于人抗体轻链可变区和人抗体轻链恒定区的DNA序列的全部或一部分，或用来源于人抗体轻链可变区和人抗体轻链恒定区的DNA序列的全部或一部分取代，以及，在其抗体重链基因座中，插入来源于人抗体重链可变区和人抗体重链恒定区的DNA序列的全部或一部分，或用来源于人抗体重链可变区和人抗体重链恒定区的DNA序列的全部或一部分取代，以及，在抗体轻链假基因座中，插入2个以上来源于人抗体轻链可变区的DNA序列，或用2个以上来源于人抗体轻链可变区的DNA序列取代，和/或，在抗体重链假基因座中，插入2个以上来源于人抗体重链可变区的DNA序列，或用2个以上来源于人抗体重链可变区的DNA序列取代，除此之外，还可以对其他基因区域等实施变异、修饰。

此处，抗体轻链基因座是存在编码抗体的轻链可变区和轻链恒定区的基因的基因座，抗体重链基因座是存在编码抗体的重链可变区和重链恒定区的基因的基因座。

此外，假基因是虽然具有与发挥功能的基因类似的序列但不作为表达的基因发挥功能的DNA序列。禽的抗体轻链假基因座和重链假基因座分别与存在功能基因的抗体轻链基因座和重链基因座相比位于上游，通过基因转变产生多样性。在人的基因组中的抗体基因座不存在假基因，但在本说明书中，将插入的人抗体可变区和出于产生基因转变的目的而导入禽抗体基因座中的、具有与人抗体可变区类似的序列的DNA序列统称为“人假基因”。

在禽抗体轻链基因座中插入的、或与禽抗体轻链基因座的序列替换的来源于人抗体轻链可变区和人抗体轻链恒定区的DNA序列分别可以是人抗体轻链可变区和人抗体轻链恒定区的全部序列，或者，也可以是其部分序列。此外，在禽抗体轻链基因座中插入的来源于人抗体轻链可变区的DNA序列的位置，优选为来源于人抗体轻链恒定区的DNA序列的插入位置的上游。

同样，在禽抗体重链基因座中插入的、或与禽抗体重链基因座的序列替换的来源于人抗体重链可变区和人抗体恒定区的DNA序列分别可以是人重链可变区和重链恒定区的全部序列，或者，也可以是其部分序列。此外，在禽抗体重链基因座中插入的来源于人抗体重链可变区的DNA序列的位置，优选为来源于人抗体重链恒定区的DNA序列的插入位置的上游。

此外，优选在禽抗体轻链基因座中插入的来源于人抗体轻链可变区和人抗体轻链恒定区的DNA序列的位置，与禽抗体轻链可变区和禽抗体轻链恒定区的位置相比位于上游。同样，优选在禽抗体重链基因座中插入的来源于人抗体重链可变区和重链恒定区的DNA序列的位置，与禽抗体重链可变区和重链恒定区的位置相比位于上游。

本实施方式中，在禽抗体轻链假基因座中插入的、或与禽抗体轻链假基因座的DNA序列替换的来源于人抗体轻链可变区的DNA序列(本说明书和附图中，也记载为“人轻链假基因序列”)，可以使用公知的人抗体轻链可变区的序列。这样的序列信息，例如能够从V Base(http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/vbase/list2.php)这样的网站获得。该人轻链假基因序列可以使用含有人抗体轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的全部或者其一部分的DNA序列，但是优选各CDR不同于在禽抗体轻链基因座中插入的或与禽抗体轻链基因座的序列替换的人抗体轻链可变区的DNA序列、其他的人轻链假基因序列的CDR。此外，关于人轻链假基因序列的框架(FW)区，优选跟在禽抗体轻链基因座中插入的或与禽抗体轻链基因的序列替换的人抗体轻链可变区的框架区一致。例如，作为抗体轻链可变区选择序列号5的DNA序列时，轻链假基因可以将序列号69～序列号88和序列号127～序列号141所示的序列等组合使用。

同样，在禽抗体重链假基因座中插入的、或者与禽抗体重链假基因座的序列替换的来源于人抗体重链可变区的DNA序列(本说明书和附图中，也记载为“人重链假基因序列”)，可以使用公知的人抗体重链可变区的序列。这样的序列信息，例如可以从V Base(http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/vbase/list2.php)这样的网站获得。该人重链假基因序列可以使用包括人抗体重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的全部或其一部分的DNA序列，但优选各CDR不同于在禽抗体重链基因座中插入的或者与禽抗体重链基因座的序列替换的人抗体重链可变区的DNA序列、其他人重链假基因序列的CDR。此外，关于人重链假基因序列的框架(FW)区，优选跟在禽重链抗体基因座中插入的、或与禽重链抗体基因座的序列替换的人抗体重链可变区的框架区一致。例如，作为抗体重链可变区选择序列号30的DNA序列时，重链假基因可以将序列号89～序列号108、序列号127～序列号141、序列号147～序列号161和序列号165～序列号179所示的序列等组合使用。

本实施方式中，在禽抗体轻链假基因座中插入的来源于人抗体轻链可变区的DNA序列的位置，优选与在禽抗体轻链基因座中插入的人抗体轻链可变区相比位于上游，此外，在残留禽抗体轻链假基因序列时，优选与禽抗体轻链假基因区域相比位于下游。同样，在禽抗体重链假基因座中插入的来源于人抗体重链可变区的DNA序列的位置，优选与在禽抗体重链基因座中插入的人抗体重链可变区相比位于上游，此外，在残留禽抗体重链假基因序列时，优选与禽抗体重链假基因区域相比位于下游。

此外，本实施方式中，在禽抗体可变区的上游作为假基因插入的或取代的来源于人抗体可变区的DNA序列，与在禽抗体可变区插入或取代的人抗体可变区序列可以是同向也可以是反向，均能够利用。

在禽抗体轻链假基因座中插入的、或取代(替换)禽抗体轻链假基因座的假基因的来源于人抗体轻链可变区的DNA序列的数量，优选为2个以上，更优选为5个以上、7个以上、9个以上、11个以上、13个以上，进一步优选为15个以上、20个以上、25个以上。同样，在禽抗体重链假基因座中插入的、或取代(替换)禽抗体重链假基因座的假基因的来源于人抗体重链可变区的DNA序列的数量，优选为2个以上，更优选为5个以上、7个以上、9个以上、11个以上、13个以上，进一步优选为15个以上、20个以上、25个以上，最优选为30个以上。

应予说明，此处所述的来源于人抗体轻链可变区的DNA序列或来源于人抗体重链可变区的DNA序列，具有FW1、CDR1、FW2、CDR2、FW3、CDR3、FW4中的任意1个，以遍及可变区的区域所含有的连续的一系列的可变区相同序列作为1个进行处理。

本实施方式中，在禽抗体重链基因座中插入的人抗体重链的种类，可以是γ链、s链、α链、δ链、ε链中的任一个，优选为γ链。此外，在禽抗体轻链基因座和禽抗体轻链假基因座中插入的人抗体轻链的种类，可以是λ链和κ链的任一个。

本实施方式中，为了将进行了基因导入的禽B细胞作为抗体文库利用，优选该禽B细胞具有不仅在细胞膜表面表达人抗体，而且在培养液中分泌人抗体的能力。因此，转录导入的人抗体基因时，需要适当引起与生物体中的表达控制的机理类似的选择性剪接(alternative splicing)。因此，在恒定区的基因导入中，理想的是利用与禽抗体重链恒定区完全相同的基因组结构，但是由于禽的该基因组区域的碱基序列在2015年3月这一时间点没有被解读，因此不能使用该序列。本实施方式中利用小鼠抗体重链基因组序列中的内含子序列，最终，成功实现同时表达细胞膜表面和分泌型两种的人抗体，因此，也能用来源于小鼠、人等公知哺乳动物的内含子序列代替使用。

本实施方式中，作为在禽抗体基因座中插入人抗体基因和/或用人抗体基因取代的方法，使用利用了同源重组的敲入法。此外，在禽抗体链基因座的假基因区域中插入来源于人抗体可变区的序列和/或用人抗体基因取代的方法，除了利用同源重组的敲入法之外，还优选使用利用了部位特异性重组的重组酶介导的盒式交换(Recombinase mediated cassette exchange，RMCE)法。

本实施方式制造的禽B细胞中，除了如上述所示地插入来源于人的抗体基因座的DNA序列或用来源于人的抗体基因座的DNA序列取代的细胞之外，也包括在该细胞的来源于人的抗体轻链或重链可变区进一步导入多种多样的变异而成的禽B细胞。抗体的多样性可以通过将可变区重新编辑，产生多种可变区的序列从而实现。因此，本实施方式制造的禽B细胞中，也包括实施了导入对可变区的重新编辑必要的多种变异的处理而成的禽B细胞。此处，导入对可变区的重新编辑必要的变异的方法，可利用例如使用使XRCC2和XRCC3缺失的B细胞的方法(例如，Cumber et al.,Nature Biotech.204:1129-1134 2002或日本特开2003-503750等)、控制AID基因的表达的方法(例如，Kanayama et al.,Nucleic Acids Res.34:e10.,2006或日本特开2004-298072等)，或者，使染色质松弛促进基因转变的方法(例如，专利文献1、专利文献2或非专利文献1等)等该技术领域公知的方法。特别优选的方法是使染色质松弛促进基因转变的方法。

作为使禽B细胞中的染色质松弛的方法，例如，可举出利用某种方法抑制禽B细胞中内在的组蛋白去乙酰化酶(HDAC)活性而显著促进该细胞内的基因转变的方法(详细内容参见上述专利文献1、专利文献2或非专利文献1等)。作为抑制细胞内在的HDAC的活性的方法，可使用利用HDAC抑制剂处理本发明的B细胞的方法(参见专利文献1或非专利文献1)、使禽B细胞中的HDAC基因的功能降低或丧失的方法(参见专利文献2)等。HDAC抑制剂是抑制HDAC的活性的抑制剂即可没有特别限制，例如，能够使用曲古柳菌素A(TSA)、丁酸、丙戊酸、辛二酰苯胺异羟肟酸(suberoylanilide hydroxamic acid，SAHA)、CBHA(间羧基肉桂酸双羟酰胺，m-carboxycinnamic acid bis-hydroxamide)、PTACH、Apicidin、Scriptaid、M344、APHA compound 8、BML-210、Oxamflatin、MS-275、等。此外，可能的情况下，也可以将活性抑制对象HDAC的失活型蛋白质(显性负效应)等作为抑制物质使用。

使HDAC基因的功能降低或丧失时，成为使基因功能降低或丧失的对象的HDAC的同工酶，因使用的抗体产生B细胞不同而不同，优选为HDAC2基因(详细地，参见专利文献2)。

与上述实施方式相关的本发明的实施方式中，包括由本发明的禽B细胞构成的产生抗体的细胞文库。该细胞文库是本发明的禽B细胞，是产生针对各种抗原的抗体的该禽B细胞的集团。本发明的上述实施方式记载的禽B细胞是通过在禽抗体假基因座插入来源于人的抗体可变区的DNA序列等而在产生的抗体可变区序列中产生多样性，而且通过染色质的松弛等处理，进一步使抗体可变区的序列多样化，具有能够针对各种抗原产生抗体的能力的细胞。

因此，包含多种本发明的禽B细胞的集团能够称为针对多种抗原产生抗体的细胞团。

本发明的其他实施方式是由本发明的禽B细胞产生抗体的方法，以及制备的抗体。

由本发明的禽B细胞产生的抗体是人型抗体，更优选为人抗体。人型抗体是在产生的抗体的重链或轻链的氨基酸序列中含有一部分来源于禽基因的序列的抗体，人抗体是产生的抗体的重链或轻链的氨基酸序列全部为来源于人基因的序列的抗体。

本发明的禽B细胞在适于该细胞的培养条件下进行培养时，产生人型抗体或人抗体。已知在DT40细胞这类来源于禽B细胞的细胞株中，虽然不具有那么高的效率，但是在抗体基因座中产生基因转变。因此，本发明的禽B细胞中，也产生基因转变，通过被插入来源于人的抗体基因的抗体基因座的基因转变，获得产生的抗体的第一次的多样性。进而，在此基础上，通过使本发明的禽B细胞的染色质松弛，抗体基因座中的基因转变效率进一步上升，从可制备能够产生更多种抗体的禽B细胞的集团。为了利用这样的染色质的松弛而选择产生显示期望的抗原特异性的抗体的禽B细胞，可利用ADLib系统。前述的产生抗体的细胞文库也能通过利用ADLib系统而制备(参见专利文献1或非专利文献1)。

此外，特别是，作为取得针对膜结合蛋白质的期望的抗体的方法，可利用ADLib axCELL(antigen expressing cell)法(WO2010/064454)。

本发明的另一实施方式包括用于制造本发明的禽B细胞的试剂盒以及用于产生抗体的试剂盒。

作为用于制造禽B细胞的试剂盒，除了用于培养禽B细胞而必要的培养基、必要的添加剂等之外，还包括用于在禽B细胞的抗体基因座等中插入来源于人抗体基因的DNA序列或者用来源于人抗体基因的DNA序列进行取代的载体、试剂类。此外，还可以包括用于制备产生抗体的细胞文库所需要的要素，例如HDAC抑制剂、用于进行使HDAC基因的功能降低或功能丧失所需要的试剂。

此外，用于产生抗体的试剂盒中，作为用于选择具有期望的抗原特异性的抗体的试剂类，例如，除了各种抗原、磁珠等之外，还可以含有磁珠制备用试剂、抗体选择所使用的标记抗体、ELISA等检查所需要的板等，如果认为抗体制造中需要的物质则可以含有任意的物质。

以下示出实施例做进一步详细说明，本发明不受到实施例的任何限制。

实施例

基因转变的确认

1.载体的制备

1-1.禽抗体轻链(Igλ)的恒定区·可变区的取代(human LC KI vector)

为了取代禽Igλ的恒定区和可变区，制造如图1所示的靶向载体。以下示出各个部分的制造方法。

(1)人Igλ的可变区和恒定区

将由人伯基特淋巴瘤细胞株Ramos制备的cDNA作为模板，通过使用正义引物(TCCACCATGGCCTGGGCTCTG)(序列号1)和反义引物(GTTGAGAACCTATGAACATTCTGTAGGGGCCAC)(序列号2)的PCR，扩增人抗体轻链(Igλ)的可变区和恒定区，克隆至pGEM-T-Easy(Promega Corporation)，得到pGEM-hIgG₁-LC。将该质粒pGEM-hIgG₁-LC作为模板，通过使用正义引物(ATTGGCGCGCCTCTCCAGGTTCCCTGGTGCAGGCACAGTCTGCCCTGACTCAGC)(序列号3)和反义引物(TTCCATATGAGCGACTCACCTAGGACGGTCAGCTTGGTCC)(序列号4)的PCR，得到人Igλ的可变区(序列号5)。

此外，将pGEM-hIgG₁-LC作为模板，通过使用正义引物(ATTGGCGCGCCTCTGCCTCTCTCTTGCAGGTCAGCCCAAGGCTGCCCCCTC)(序列号6)和反义引物(GGAATTCCATATGGAGTGGGACTACTATGAACATTCTGTAGGGG)(序列号7)的PCR，得到人Igλ的恒定区(序列号8)。

(2)左臂(Left Arm)

将鸡B细胞株DT40的基因组DNA作为模板，通过使用正义引物(GAGATCTCCTCCTCCCATCC)(序列号9)和反义引物(CAAAGGACACGACAGAGCAA)(序列号10)的PCR，扩增从禽Igλ的可变区上游至恒定区下游的区域。通过电泳分离为Functional allele(功能性等位基因)和Non-functional allele(非功能性等位基因)，切出约8.0kbp的功能性等位基因，克隆至pGEM-T-Easy，得到pGEM-cIgM-LCgenome。将pGEM-cIgM-LCgenome作为模板，通过使用正义引物(TGTCTCGAGTGAAGGTCACCAAGGATGG))(序列号11)和反义引物(TTAAGCTTGGAGAGGAGAGAGGGGAGAA)(序列号12)的PCR，得到序列号13表示的左臂。

(3)中臂(Center Arm)

通过pGEM-cIgM-LCgenome的序列解析确定位于禽Igλ的可变区和恒定区之间的内含子区域的序列，合成序列号14表示的中臂(在中途插入两端具有loxP序列的杀稻瘟菌素耐药性基因)。

(4)右臂(Right Arm)

使用pGEM-cIgM-LCgenome确定禽Igλ的恒定区的下游区域的序列，合成序列号15表示的右臂(在中途插入两端具有lox2272序列的新霉素耐药性基因)。

(5)靶向载体的构建

在pBluescript中以成为图1表示的结构的方式组装上述左臂、人Igλ可变区、中臂、人Igλ恒定区、右臂，得到human LC KI vector。该载体的基因序列示于序列号16。

1-2.对禽抗体轻链(Igλ)的假基因区域下游的敲入(KI-C-IN vector)

为了在禽Igλ的假基因区域下游插入用于确认基因转变的序列(GC确认序列；由来源于人的Igλ的可变区的序列构成的人假基因)(序列号17)，首先制造如图2所示的靶向载体。各个部分的制造方法如以下所示。

(1)左臂

将DT40的基因组DNA作为模板，使用正义引物(TTCTGTGAGCTGAGAAAAGGAGTGTA)(序列号18)和反义引物(CCTGCATTGTGGCACAGCGGGGTT)(序列号19)，利用PCR将可变区的启动子的上游的4.3kb(假基因(pV)1～3)扩增后，克隆至pCR4blunt-TOPO(Life Technologies Corporation)，得到pCR4-cIgM-LC pV1genome。基于该序列，克隆包含pV1～3的区域(序列号20)，作为左臂。

(2)右臂

基于上一项得到的pCR4-cIgM-LCpV1genome的序列，克隆相当于pV1与启动子之间的区域(序列号21)的部分，作为右臂。

(3)靶向载体的构建

在pCR4blunt-TOPO中以成为图2表示的结构的方式组装上述左臂、新霉素耐药性基因、右臂，得到KI-C-IN vector。该载体的基因序列示于序列号22。

1-3.在禽抗体轻链(Igλ)的假基因区域下游插入GC确认序列(KI-C-IN-C vector)

为了在禽Igλ的假基因区域下游插入GC确认序列，制造如图2所示的靶向载体。各个部分的制造方法如以下所示。

(1)GC确认用序列

基于上述1-1中克隆的人Igλ的可变区，设计在各个CDR中分别插入3个碱基的变异序列和分别缺失3个碱基的变异序列，合成将其用禽Igλ假基因区域的非翻译区域序列连接的GC确认用序列(序列号17)。

(2)靶向载体的构建

在上述1-2中制造的KI-C-IN vector中，以成为图2表示的结构的方式组装GC确认用序列，得到KI-C-IN-C vector。该载体的基因序列示于序列号23。

1-4.禽抗体轻链(Igλ)的假基因区域的缺失(KI-C-DE vector)

为了使禽Igλ的假基因区域缺失，制造图3所示的靶向载体。各个部分的制造方法如以下所示。

(1)左臂

将DT40的基因组DNA作为模板，使用正义引物(CGCTTTGTACGAACGTTGTCACGT)(序列号24)和反义引物(TACCTGAAGGTCTCTTTGTGTTTTG)(序列号25)，利用PCR扩增pV25的上游的约3.0kb后，克隆至pCR4blunt-TOPO，得到序列号26表示的左臂。

(2)右臂

使用与上述1-2中制备的右臂相同的右臂。

(3)靶向载体的构建

在pCR4blunt-TOPO中以成为图3表示的结构的方式组装上述的左臂、新霉素耐药性基因、右臂，得到KI-C-DE vector。该载体的基因序列示于序列号27。

1-5.将禽抗体轻链(Igλ)假基因区域取代为GC确认用序列(KI-C-DE-C vector)

为了将禽Igλ的假基因区域取代为GC确认用序列，制造图3所示的靶向载体。各个部分的制造方法如以下所示。

(1)GC确认用序列

使用上述1-2中制备的GC确认用序列。

(2)靶向载体的构建

在上述1-3中制造的KI-C-DE vector中，以成为图3表示的结构的方式组装上述的GC确认用序列，得到KI-C-DE-C vector。该载体的基因序列示于序列号28。

1-6.对禽抗体重链(IgM)的恒定区·可变区的敲入

为了将从禽IgM(IgM)的可变区至恒定区μ1的区域取代为人抗体重链(IgG₁)，制造图4所示的靶向载体。各个部分的制造方法如以下所示。

(1)人IgG₁恒定区

从含有人IgG₁的人基因组染色体14 32.33的利用鸟枪法测序法得到的序列中，取得相当于IgG₁的序列(登录号：NW_001838121.1)。从第41520位碱基与第43117位碱基之间的序列提取相当于“IGH1”的”C_region”的CH1、hinge、CH2、CH3、transmembrane结构域序列，设计将内含子取代为来源于小鼠IgG_2a的序列而得的序列，通过合成得到人IgG₁恒定区序列(序列号29)。

(2)人IgG₁可变区

基于来源于人的生殖细胞的IgG₁可变区基因的序列，设计连接VH3-23、D5-12、JH1序列的序列，附加来源于禽的分泌信号序列、剪接信号序列，作为人IgG₁可变区(序列号30)。

(3)左臂

将DT40的基因组DNA作为模板，使用正义引物(TTCCCGAAGCGAAAGCCGCGT)(序列号31)和反义引物(ACTCACCGGAGGAGACGATGA)(序列号32)，利用PCR扩增从禽IgM可变区上游至可变区的区域，克隆约4.1kbp的片段，得到pCR4Blunt-TOPO-cIgM-HC pV1genome。基于该序列，设计·合成在3’端附加Vlox序列的左臂(序列号33)。

(4)中臂1

基于在上述的左臂克隆时克隆的从禽IgM可变区上游至可变区的约4.1kbp的序列，合成相当于禽IgM可变区上游的约1.4kbp的中臂1(序列号34)。

(5)中臂2

将DT40的基因组DNA作为模板，使用正义引物(GGGGATCCTGGGTCAGTCGAAGGGGGCG)(序列号35)和反义引物(GTGCGGCCGCCAAAAGCGGTAAAATCCACCC)(序列号36)，利用PCR扩增禽IgM可变区下游的约4.3kbp之后进行克隆，得到序列号37表示的中臂2。

(6)右臂

将DT40的基因组DNA作为模板，使用正义引物(CCAAACCACCTCCTGGTGTCC)(序列号38)和反义引物(CAAACCAAAACTACGGATTCTCTGACC)(序列号39)，利用PCR扩增含有禽IgM恒定区μ2的约0.9kbp之后进行克隆，得到序列号40表示的右臂。

(7)靶向载体的构建

在pBluescript中以成为图4表示的结构的方式组装上述的左臂、多克隆位点、中臂1、人IgG₁可变区、杀稻瘟菌素耐药性基因、中臂2、人IgG₁恒定区、新霉素耐药性基因、右臂，得到human HC V-C vector。该载体的基因序列示于序列号41。

1-7.对禽抗体重链(IgM)的恒定区·可变区·假基因区域的敲入(human HC KI vector)

为了在禽IgM的从假基因区域下游至恒定区μ1的区域插入用于确认基因转变的序列(GC确认序列；由来源于人Igγ的可变区的序列构成的人假基因)、人IgG₁可变区和人IgG₁恒定区，制造图4所示的靶向载体。各个部分的制造方法如以下所示。

(1)人IgG₁恒定区

使用上述1-6中记载的人IgG₁恒定区序列。

(2)人IgG₁可变区

使用上述1-6中记载的人IgG₁可变区。

(3)基因转变确认用序列

基于上述1-6中设计的人Igγ的可变区，设计使CDR1缺失1个碱基、使CDR2缺失2个碱基、将CDR3插入1个碱基的变异序列，合成将其用禽Igγ假基因区域的非翻译区域序列连接的GC确认用序列(序列号42)。

(4)左臂

使用上述1-6中记载的左臂。

(5)中臂1

使用上述1-6中记载的中臂1。

(6)中臂2

使用上述1-6中记载的中臂2。

(7)右臂

使用上述1-6中记载的右臂。

(8)靶向载体的构建

在pBluescript中以成为图4表示的结构的方式组装上述的左臂、GC确认用序列、中臂1、人IgG₁可变区、杀稻瘟菌素耐药性基因、中臂2、人IgG₁恒定区、新霉素耐药性基因、右臂，得到human HC KI vector。该载体的基因序列示于序列号43。

1-8.表达Cre重组酶的载体的构建

为了上述制造的载体的药剂耐药性基因以在两端添加loxP序列的形式组装在载体中，在基因导入后，通过使Cre重组酶工作能够除去该基因。因此，在pEGFP-C1(BD Bioscience Company、#6084-1)中，组装序列号44表示的Cre重组酶基因，制造序列号45表示的Cre_EGFP-C1。

2.将轻链插入·取代为人序列的细胞株的制造

宿主使用来源于鸡的B细胞的细胞株DT40。DT40的培养方法利用以下方法进行。

使用CO₂恒温槽，在39.5℃、5％CO₂存在下培养。培养基使用IMDM(Life Technologies Corporation)，添加9％FBS、1％鸡血清、青霉素100单位/mL、链霉素100μg/mL、单硫代甘油50μM而使用。以下，只要没有特别说明，“培养基”是指上述组成的培养基。

为了评价轻链中的基因转变，准备下表所示的5种细胞株。

[表1]

制造方法如以下所示。

2-1.将可变区·恒定区取代为人型的细胞株的制造

利用限制性内切酶NotI将上述1-1中制备的human LC KI vector制成直链状后，通过电穿孔法对DT40细胞进行基因导入。利用添加有2mg/mL的G418和10μg/mL的杀稻瘟菌素的培养基培养7～10天。对于繁殖的细胞进行利用PCR的基因分型，选择在目的基因座发生基因取代的细胞株。对该细胞株，基因导入上述1-8中制造的Cre_pEGFP-C1，通过利用流式细胞仪的单细胞分选选出GFP阳性细胞后，进行利用PCR的基因分型，得到能够确认药剂耐药性基因被除去的细胞株37-3。然后，利用限制性内切酶NotI将上述1-2中制造的KI-C-IN vector制成直链状后，对细胞株37-3进行基因导入。利用添加有2mg/mL的G418的培养基培养7～10天。对繁殖的细胞进行利用PCR的基因分型，得到在目的基因座中产生基因插入的细胞株LP1(图5)。

2-2.将可变区·恒定区取代为人型，进而在禽假基因区域的下游插入基因转变确认用序列(GC序列)的细胞株的制造

利用限制性内切酶NotI将上述1-3中制备的KI-C-IN-C vector制成直链状后，在上步得到的细胞株37-3中进行基因导入。利用添加有2mg/mL的G418的培养基培养7～10天。对繁殖的细胞进行利用PCR的基因分型，得到在目的基因座中产生基因插入的细胞株LP9(图6)。

2-3.将可变区·恒定区取代为人型，进而使禽假基因区域缺失的细胞株的制造

利用限制性内切酶NotI将上述1-4中制备的KI-C-DE vector制成直链状后，对上述2-1中得到的细胞株37-3进行基因导入。利用添加有2mg/mL的G418的培养基培养7～10天。对繁殖的细胞进行利用PCR的基因分型，得到在目的基因座中产生基因插入的细胞株LP18(图7)。

2-4.将可变区·恒定区取代为人型，进而将禽假基因区域取代为基因转变确认用序列(GC序列)的细胞株的制造

利用限制性内切酶Not I将上述1-5中制备的KI-C-DE-C vector制成直链状后，在上述2-1中得到的细胞株37-3中进行基因导入。利用添加有2mg/mL的G418的培养基培养7～10天。对繁殖的细胞进行利用PCR的基因分型，得到在目的基因座中发生基因取代的细胞株LP20(图8)。

3.抗体表达的确认(流式细胞仪、ELISA)

3-1.利用流式细胞仪的解析

进行在上述2中制造的细胞株的细胞表面表达的抗体的解析。培养各个细胞株，在96孔板(Nunc Company，249662)每孔加入5×10⁵个，利用150μL的FACS缓冲液(含有0.3％牛血清白蛋白(BSA)的PBS)清洗2次后，添加将Goat anti-Chicken IgM-FITC conjugate(Bethyl Company、A30-102F-20)、Goat Anti-Human IgG(Gamma chain specific)R-PE conjugate(Southern biotech Company，A2040-09)或Goat Anti-human lambda PE conjugate(Southern biotech Company，2070-09)利用FACS缓冲液分别稀释至1000倍、500倍、500倍的1次抗体液50μL。在冰浴暗处孵育30分钟后，利用150μL的FACS缓冲液清洗2次，添加利用FACS缓冲液稀释1000倍的PI溶液200μL，混悬。将该混悬液提供于流式细胞仪解析，解析禽IgM和人Igγ(重链)或人Igλ(轻链)的表达，结果如图9所示，确认野生型DT40中仅禽IgM表达，而转化株LP1、LP9、LP18、LP20中禽IgM和人Igλ表达。在任何的细胞株中均没有发现未进行基因导入的Igγ的表达。

3-2.利用ELISA的解析

进行由上述2中制造的细胞分泌至培养上清中的禽IgM和人IgG₁的浓度的测定。将各个细胞株利用不含有鸡血清的培养基混悬为4×10⁵cells/mL之后，在24孔板每孔2mL进行播种，培养3天后，回收培养液。利用0.22μm过滤器过滤后，用于测定。

IgG的测定方法如以下所示。将1.0μg/mL的Goat anti-Human IgG-Fc affinity purified(Bethyl Company，A80-104A)20μL分注至免疫384孔板Maxisorp(Nunc Company，464718)，室温下反应1小时以上，在板上固相化。然后，利用清洗液(含有0.05％Tween20的PBS)清洗5次，添加封闭液(含有1％BSA的PBS)50μL，室温下反应30分钟。利用清洗液清洗5次，添加20μL测定样品或成为标准物质的Human IgG₁Lambda-UNLB(SouthernBiotechCompany，0151L-01)，室温下反应1小时。利用清洗液清洗5次，添加利用含有1％BSA和0.05％Tween20的PBS将Goat anti-Human IgG-Fc HRP conjugated(Bethyl Company，A80-104P)稀释1000倍的稀释液20μL，室温下反应1小时。利用清洗液清洗5次，添加TMB+(Dako Company，S159985)20μL，室温下进行3分钟显色反应，添加1N硫酸20μL使反应停止。使用Infinite M1000(TECAN Company)，测定450nm的吸光度。

IgM的测定中使用alphaLISA Immuno Assay(Perkin Elmer Company)的系统。对Goat anti-chicken IgM antibody(Bethyl Company，A30-102A)使用Chromalink^TM Biotin Labeling Reagent(SoluLink Inc.,#B1001-105)进行生物素标记，制备生物素化抗体。接下来，使Goat anti-chicken IgM antibody(Bethyl Company，A30-102A)与Unconjugated AlphaLISA Acceptor Beads(Perkin Elmer Company)结合，制备抗体结合Alpha Screen Beads。将该生物素标记抗体和抗体结合Alpha Screen Beads，利用检测缓冲液(含有1％BSA的PBS)分别稀释为4.5nM和50μg/mL之后，混合等量，作为禽IgM浓度测定溶液。96孔板(NuncCompany)中，混合禽IgM浓度测定溶液20μL和成为测定样品或标准物质的禽血清(GIBCO Company、16110)5μL后，将每孔12.5μL分注至Alpha Plate-384(Perkin Elmer Company)。室温下反应60分钟后，添加利用检测缓冲液制备成80μg/mL的AlphaScreen streptaVidin Donor Beads(Perkin Elmer Company)12.5μL，室温遮光反应30分钟。然后，使用EnSpire(Perkin Elmer Company)进行解析。

测定结果示于表2。确认与野生型DT40同样，转化株LP1、LP9、LP18、LP20也分泌禽IgM。

[表2]

4.基因转变的确认

将上述3中确认人Igλ(轻链)的表达的细胞株在含有2.5ng/mL的TSA的培养基中培养20天后，从1×10⁶个细胞提取基因组DNA。将该基因组DNA作为模板，通过使用附有识别序列的正义引物(CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGNNNNNNNNNNCAGGTTCCCTGGTGCAGGC)(序列号46)和反义引物(CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGGCTTGGTCCCTCCGCCGAA)(序列号47)的PCR扩增轻链可变区，利用琼脂糖凝胶提取进行精制后，使用QIAGEN PCR Purification Kit(QIGEN Company)浓缩。使用Roche Diagnostics Company的第二代序列解析系统进行该样品的序列解析，通过与插入的人假基因序列相同的基因序列在可变区是否存在评价基因转变的有无。其结果示于表3。在不含有人假基因序列的LP1、LP18中确认不产生基因转变，而在具有人假基因序列的LP9、LP20中确认产生基因转变。

[表3]

产生人抗体的细胞专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。