专利摘要

本发明公开了属于基因工程技术领域的一种高产脂肽的重组菌及其应用，所述高产脂肽的重组菌，其是将亮氨酸合成途径中的2‑异丙基苹果酸合酶基因转化至原始菌株构建而成。本发明的进一步过表达部分亮氨酸合成路径(2‑异丙基苹果酸合酶、3‑异丙基苹果酸脱氢酶、3‑异丙基苹果酸脱水酶和支链氨基酸转氨酶)的重组菌与出发菌株相比，表面活性素产量最高提高了55.6％，可用于脂肽类生物表面活性剂的生产，具有良好的工业应用前景，摇瓶发酵所得发酵液中脂肽产量平均为13‑16g/L。

权利要求

1.一种高产脂肽的重组菌，其是将亮氨酸合成途径中的2-异丙基苹果酸合酶基因转化至原始菌株构建而成；所述重组菌还转入了3-异丙基苹果酸脱氢酶基因、3-异丙基苹果酸脱水酶基因和支链氨基酸转氨酶基因；所述原始菌株为枯草芽孢杆菌；所述2-异丙基苹果酸合酶、3-异丙基苹果酸脱氢酶、3-异丙基苹果酸脱水酶和支链氨基酸转氨酶分别为LeuA、LeuB、LeuCD和IlvK蛋白；所述脂肽为表面活性素。

2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述LeuA蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示，所述LeuB蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述LeuC蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述LeuD蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述IlvK蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

3.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述原始菌株为枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis THY-7，保藏号为CGMCC No.8906。

4.根据权利要求3所述的重组菌，其特征在于，所述原始菌株为枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis THY-7/Pg3-srfA，所述枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis THY-7/Pg3-srfA，是指在枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis THY-7中加入诱导型强启动子Pg3，使强启动子Pg3控制表面活性素合成酶srfA的表达。

5.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于，所述LeuA、LeuB、LeuC和LeuD蛋白受强启动子控制，所述IlvK蛋白受原组成型启动子控制。

6.权利要求1-5任一权利要求所述的重组菌在生产表面活性素中的应用。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种高产脂肽的重组菌及其应用。

背景技术

脂肽(lipopeptide)类生物表面活性剂是一类由亲水的环状寡肽与疏水的脂肪酸链以内酯键连接而成的两性物质，主要由芽孢杆菌、链霉菌等微生物合成。由于组成脂肽的肽环中氨基酸组成与成环方式不同，芽孢杆菌脂肽可分为表面活性素、芬芥素、伊枯草菌素等，其中在气/液界面形成独特“马鞍”构象的表面活性素具有良好的表面活性、生物降解性及抗菌活性，在石油开采、生物防治、医药及日化等领域都有广阔的应用前景。但由于芽孢杆菌发酵生产表面活性素产率低限制了表面活性素的工业化生产和应用。

目前，提高微生物脂肽发酵水平的方法包括培养条件优化、诱变育种、强化表面活性素跨膜运输、强化表面活性素合成酶表达、强化脂肪酸前体供应等。专利文献(CN101892176A、CN 101775427A、WO 2002026961A)等通过对枯草芽孢杆菌发酵生产表面活性素发酵过程中培养基及培养条件进行优化，提高了发酵液中表面活性素的产量。诱变育种方面，CN101928677A公开了通过紫外诱变处理玫瑰孢链霉菌，US05227294公开了用亚硝基甲替尿烷处理枯草芽孢杆菌，上述文献中的微生物在诱变处理后，其表面活性素合成量都有增加。基因工程改造方面，中国专利文献CN103898038A公开了通过强化脂肽由胞内向胞外运输的跨膜蛋白YcxA，枯草芽孢杆菌发酵生产的表面活性素产量提高了97％。中国专利文献CN1554747A公开了在枯草芽孢杆菌中表达comA基因，脂肽产量提高了50％。另外，枯草芽孢杆菌中脂肪酸和氨基酸在表面活性素合成酶的作用下催化合成表面活性素，中国专利文献CN105400784A通过将脂肽合成酶基因簇启动子替换成诱导型强启动子Pg3，表面活性素产量提高了17.7倍。中国专利文献CN109097315A通过过表达支链脂肪酸合成途径中生物素羧化酶YngH，表面活性素产量提高了47％。(Qun Wu,Yan Zhi,Yan Xu,Systematicallyengineering the biosynthesis of a green biosurfactant surfactin by Bacillussubtilis 168[J].Metabolic Engineering,2019,52:87-97)公开了强化细胞内支链脂肪酸合成整条路径提高前体脂肪酸的供应，从而表面活性素产量提高了20.8倍。关于表面活性素合成的另一类主要前体氨基酸，(Coutte F,Niehren J,Dhali D,et al.Modelingleucine's metabolic pathway and knockout prediction improving the productionof surfactin,a biosurfactant from Bacillus subtilis[J].Biotechnology Journal,2015,10(8SI):1216-1234)公开了培养基中添加亮氨酸可使表面活性素产量提高3倍，说明提高亮氨酸含量是提高表面活性素产量的有效策略。但是，(Qun Wu,Yan Zhi,Yan Xu,Systematically engineering the biosynthesis of a green biosurfactantsurfactin by Bacillus subtilis 168[J].Metabolic Engineering,2019,52:87-97)在产表面活性素的宿主菌中过表达了亮氨酸合成途径中的乙酰乳酸合酶AlsS、酮醇酸还原异构酶IlvC、二羟基酸脱水酶IlvD、2-异丙基苹果酸合酶LeuA、3-异丙基苹果酸脱氢酶LeuB和3-异丙基苹果酸脱水酶LeuCD，表面活性素产量并没有提高。关于强化细胞中亮氨酸合成有效提高表面活性素产量的研究未见报道。

发明内容

为了克服现有技术中的缺点，本发明的目的在于提供一种高效的生产脂肽的重组菌，其可以提高脂肽的产量。

所述重组菌，其是将亮氨酸合成途径中的2-异丙基苹果酸合酶基因转化至原始菌株构建而成。

上述重组菌中，可选择的，所述重组菌还转入了3-异丙基苹果酸脱氢酶基因、3-异丙基苹果酸脱水酶基因和支链氨基酸转氨酶基因中的一个或一个以上。

上述重组菌中，所述3-异丙基苹果酸脱氢酶、3-异丙基苹果酸脱水酶和支链氨基酸转氨酶生物素羧化酶分别为LeuB、LeuCD和IlvK蛋白或其具有相同功能的突变体，

上述重组菌中，优选的，所述LeuB蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述LeuC蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述LeuD蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述IlvK蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

上述重组菌中，所述2-异丙基苹果酸合酶为LeuA蛋白或其具有相同功能的突变体，优选的，所述LeuA蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

上述重组菌中，所述原始菌株为具有产脂肽能力的野生菌及其诱变株、突变株或基因工程改造株。

上述重组菌中，所述原始菌株为枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌或假单胞菌。

上述重组菌中，可选择的，所述原始菌株为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilisTHY-7。

所述枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis THY-7，于2014年3月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏登记号为CGMCC No.8906，并在中国专利文献CN 105400784A中公开。

上述重组菌中，可选择的，所述原始菌株为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilisTHY-7/Pg3-srfA。

所述枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis THY-7/Pg3-srfA，是指在枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis THY-7中加入诱导型强启动子Pg3，使强启动子Pg3控制表面活性素合成酶srfA的表达。关于诱导型强启动子Pg3、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis THY-7/Pg3-srfA及其具体的制备方法在中国专利文献CN 105400784A中有公开。

上述重组菌中，所述LeuA、LeuB、LeuC和LeuD蛋白受强启动子控制，所述IlvK蛋白受原组成型启动子控制。

本发明的目的还提供上述重组菌在生产脂肽中的应用。

上述应用中，所述脂肽类生物表面活性剂为表面活性素。

一种上述重组菌的制备方法，包括如下步骤：

扩增得到2-异丙基苹果酸合酶、3-异丙基苹果酸脱氢酶、3-异丙基苹果酸脱水酶基因簇leuABCD和带有自身组成型启动子的支链氨基酸转氨酶生物素羧化酶IlvK，将LeuABCD和IlvK基因序列插入穿梭质粒，构建表达质粒；

将表达质粒导入原始菌株，构建重组菌。

进一步的，具体方法为：

1、利用上下游引物，以枯草芽孢杆菌基因组为模板进行聚合酶链式反应，扩增并获得leuABCD基因，优选的，其核酸序列如SEQ ID NO.6所示。同样的，扩增并获得ilvK基因，优选的，其核酸序列如SEQ ID NO.7所示。

2、将leuABCD和ilvK基因以及穿梭质粒分别进行双酶切，使用连接酶将两种酶切产物进行连接，得到连接产物。

3、将连接产物转化大肠杆菌E.coli TOP10感受态细胞，进行抗性筛选阳性克隆，得到含有leuABCD和ilvK基因序列的表达质粒pJMP-leuABCD-ilvK。

4、将表达质粒pJMP-leuABCD-ilvK转入出发菌株中，获得转化有pJMP-leuABCD-ilvK质粒的基因工程菌。

上述基因工程菌的制备方法中，所述穿梭质粒pJMP的构建方法在中国专利文献CN109097315A中已经公开。

一种上述重组菌的制备方法，可选的，具体方法包括如下：

1、以leuABCD-F和leuABCD-R为上下游引物，以枯草芽孢杆菌基因组为模板进行聚合酶链式反应，扩增并获得leuABCD基因序列，其核酸序列如SEQ ID NO.6所示；以ilvK-F和ilvK-R为上下游引物，以枯草芽孢杆菌基因组为模板进行聚合酶链式反应，扩增并获得ilvK基因序列，其核酸序列如SEQ ID NO.7所示；

2、将leuABCD基因进行Xba I和Mlu I双酶切，将ilvK基因进行Mlu I和Nco I双酶切，将穿梭质粒进行Xba I和Nco I双酶切，纯化酶切产物，使用T4 DNA连接酶将三种酶切产物进行连接，得到连接产物。

3、将连接产物转化大肠杆菌E.coli TOP10感受态细胞，涂布于卡那霉素的LB平板，倒置于37℃培养箱中过夜培养。挑取平板上长出来的抗性克隆进行培养，提取质粒进行酶切及测序验证，得到含有正确leuABCD-ilvK基因序列的表达质粒pJMP-leuABCD-ilvK。

4、将表达质粒pJMP-leuABCD-ilvK使用电转化方法转入枯草芽孢杆菌B.subtilisTHY-7/Pg3-srfA(CN 105400784A)中，涂布于含有氯霉素和卡那霉素的LB平板上，挑取抗性克隆进行培养，进行PCR验证，获得转化有pJMP-leuABCD-ilvK质粒的基因工程菌B.subtilis THY-7/Pg3-srfA(leuABCD-ilvK)。

优选的，步骤1中所述的枯草芽孢杆菌基因组可以选择枯草芽孢杆菌1012wt(MoBiTec公司)、枯草芽孢杆菌THY-7(CN 105400784A)、THY-8(化工进展，2013，32：2952-2956)、THY-15(Journal of industrial microbiology&biotechnology.2015,42(8):1139–1147)或携带leuABCD和ilvK基因的其它芽孢杆菌菌株。

优选的，步骤2中所述穿梭质粒优选pJMP,构建方法在中国专利文献CN109097315A中已经公开。

本发明的目的也在于提供上述基因工程菌在制备脂肽的中的应用。

可选的，采用上述重组菌生产脂肽，步骤如下：

将重组菌接入培养基中，进行扩大培养，得到基因工程菌菌液；

按照1-20％体积百分比将步骤(1)得到的工程菌菌液接入发酵培养基中，进行发酵培养，得到含有脂肽的发酵液。

上述方法中，所述扩大培养的方法为：在35-40℃、摇床转速为150-200rpm的条件下培养10-20h。

上述方法中，所述发酵培养的方法为在35-40℃、摇床转速为150-200rpm的条件下培养1.5-4h时加入0.5-1.5mM IPTG诱导剂后继续培养40-60h。

上述方法中，所述发酵培养基的组成为：糖类30-100g/L，无机氮源10-50g/L，有机氮源0.5-3g/L，KH2PO4 0.1-1g/L,Na2HPO4·12H2O 0.5-0.3g/L,CaCl2 0.002-0.01g/L,MnSO4·H2O 0.002-0.01g/L,FeSO4·7H2O 0.002-0.01g/L,pH 6.5-7.5。

本发明的优点和有益效果：

本发明采用基因工程技术构建重组菌，在产脂肽枯草芽孢杆菌细胞中扩增并表达了亮氨酸合成途径中2-异丙基苹果酸合酶LeuA、3-异丙基苹果酸脱氢酶LeuB、3-异丙基苹果酸脱水酶LeuCD和支链氨基酸转氨酶IlvK，强化了表面活性素分子结构中亮氨酸的合成，从而显著提高了脂肽的产量。本发明所得过表达部分亮氨酸合成路径的重组菌与出发菌株相比，表面活性素产量最高提高了55.6％，可用于脂肽类生物表面活性剂的生产，具有良好的工业应用前景，摇瓶发酵所得发酵液中脂肽产量平均为13-16g/L。

附图说明

图1为用于基因过表达质粒pJMP的示意图。

图2为含有leu ABCD-ilvK基因串的过表达质粒pJMP-leuABCD-ilvK的PCR验证图：泳道1为DNA分子量标准，泳道2为质粒使用引物ilvK-F和ilv-R进行PCR扩增的结果，可得到1.3kb的条带。

图3为携带2-异丙基苹果酸合酶LeuA、3-异丙基苹果酸脱氢酶LeuB、3-异丙基苹果酸脱水酶LeuCD和支链氨基酸转氨酶IlvK基因的枯草芽孢杆菌-大肠杆菌穿梭质粒pJMP-leuABCD-ilvK的示意图。

图4为过表达2-异丙基苹果酸合酶LeuA、3-异丙基苹果酸脱氢酶LeuB、3-异丙基苹果酸脱水酶LeuCD和支链氨基酸转氨酶IlvK的基因工程菌B.subtilisTHY-7/Pg3-srfA(leuABCD-ilvK)的PCR验证图：泳道1为THY-7/Pg3-srfA(pJMP-yngH)用引物ilvK-F和通用引物pJMP-R进行PCR扩增的结果，可得到1.5kb的条带。泳道2为DNA分子量标准。

图5为原始菌株THY-7/Pg3-srfA与基因工程菌THY-7/Pg3-srfA(leuABCD-ilvK)的发酵产物中表面活性素的浓度。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。如未特别指明，实施例中所用的生化试剂均为市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员书中的常规手段。

亮氨酸合成途径中：葡萄糖经过糖酵解途径生成丙酮酸，丙酮酸是亮氨酸合成的前体。在丙酮酸生成α-酮基异戊酸的过程中，由丙酮酸合成乙酰乳酸是该过程的限速步骤。催化该步骤的酶为乙酰羟基酸合成酶，由基因ilvHB和基因alsS编码。在α-酮基异戊酸和乙酰CoA合成L-亮氨酸过程，限速步骤是由α-异丙基苹果酸合成酶催化合成α-异丙基苹果酸，编码该酶的基因为leuA。

发明人前期实验中分别表达这3个相关基因发现：过表达alsS和ilvHB时表面活性素的合成显著降低，过表达leuA时表面活性素产量有所提升，脂肽产量为11.58g/L，提高了13.5％，过表达leuAB时，脂肽产量没有进一步提升。

实施例1携带亮氨酸合成途径中基因leuABCD和ilvK的质粒构建

挑取枯草芽孢杆菌B.subtilis THY-7单菌落，接种于LB液体培养基中，放置于37℃、200rpm的摇床中过夜培养，在12000rpm、5min离心条件下收集菌体，使用Omega公司的细菌基因组提取试剂盒提取THY-7基因组。以得到的基因组为模板，使用上游引物leuABCD-F(序列如SEQ ID NO.8所示)和下游引物leuABCD-R(序列如SEQ ID NO.9所示)进行PCR扩增得到leuABCD片段。使用上游引物ilvK-F(序列如SEQ ID NO.10所示)和下游引物ilvK-R(序列如SEQ ID NO.11所示)进行PCR扩增得到ilvK片段引物由铂尚生物技术(上海)有限公司合成，用无菌水溶解并稀释至10μM备用。PCR扩增所用聚合酶、缓冲液和限制性内切酶购自TaKaRa公司。PCR扩增反应体系为：

热循环条件为

扩增纯化得到枯草芽孢杆菌leuABCD基因片断，其序列如SEQ ID NO.6所示,扩增纯化得到枯草芽孢杆菌ilvK基因片断，其序列如SEQ ID NO.7所示。将leuABCD基因进行XbaI和Mlu I双酶切，将ilvK基因进行Mlu I和Nco I双酶切，将穿梭质粒进行Xba I和Nco I双酶切，27-33℃酶切1-3h后用Omega公司的DNA纯化试剂盒进行纯化，然后使用T4 DNA连接酶(NEB公司)在16-22℃条件下过夜连接。连接产物转化大肠杆菌E.coli TOP10感受态细胞(TianGen公司)，涂布于含卡那霉素的LB平板，倒置于37℃培养箱中过夜培养。挑取平板上长出来的抗性克隆进行菌落PCR，以挑取的菌落为模板，以ilvK-F和质粒引物ilvK-R为引物，扩增出约1.3Kb条带(如图2所示)即为阳性克隆，挑取阳性克隆培养，提取质粒并测序验证，得到含有leuABCD和ilvK基因的表达质粒pJMP-leuABCD-ilvK，其中图1为质粒pJMP的示意图。

实施例2过表达亮氨酸合成途径的基因工程菌B.subtilis THY-7/Pg3-srfA(leuABCD-ilvK)的构建

将实施例1中构建的携带2-异丙基苹果酸合酶LeuA、3-异丙基苹果酸脱氢酶LeuB、3-异丙基苹果酸脱水酶LeuCD和支链氨基酸转氨酶IlvK的枯草芽孢杆菌-大肠杆菌穿梭质粒pJMP-leuABCD-ilvK以电穿孔法转化枯草芽孢杆菌THY-7/Pg3-srfA的感受态细胞，可得到过表达亮氨酸合成路径部分基因的基因工程菌THY-7/Pg3-srfA(leuABCD-ilvK)。其中，枯草芽孢杆菌THY-7/Pg3-srfA感受态细胞的制备及电转化采用中国专利文献CN105400784A中的方法。

复苏后取100uL菌液涂布于含10-30μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上，倒置于37℃培养箱中过夜培养，挑取单菌落，使用上下游引物ilvK-F和pJMP-R进行PCR验证，可扩增出约1.5kb条带，验证结果如图4所示，即获得过表达2-异丙基苹果酸合酶LeuA、3-异丙基苹果酸脱氢酶LeuB、3-异丙基苹果酸脱水酶LeuCD和支链氨基酸转氨酶IlvK的基因工程菌THY-7/Pg3-srfA(leuABCD-ilvK)。所述质粒引物pJMP-R序列如SEQ ID NO.12所示。

实施例3使用基因工程菌THY-7/Pg3-srfA(leuABCD-ilvK)生产脂肽类表面活性剂—表面活性素

将实施例2所得到的过表达2-异丙基苹果酸合酶LeuA、3-异丙基苹果酸脱氢酶LeuB、3-异丙基苹果酸脱水酶LeuCD和支链氨基酸转氨酶IlvK的基因工程菌THY-7/Pg3-srfA(leuABCD-ilvK)接种于LB液体培养基(含氯霉素和卡那霉素)中，37℃、200rpm条件下培养16h，以5％的比例接入装有100mL发酵培养基的摇瓶中，37℃、200rpm条件下培养2-6h时加入IPTG，继续培养至2-3d，即得到含脂肽的发酵液。

发酵液中表面活性素检测采用于慧敏等(中国专利CN 105400784A)的方法。基因工程菌THY-7/Pg3-srfA(leuABCD-ilvK)与出发菌株THY-7/Pg3-srfA发酵液中表面活性素浓度的统计结果如图5所示：THY-7/Pg3-srfA(leuABCD-ilvK)表面活性素产量最高可达15.8g/L，比THY-7/Pg3-srfA出发菌(10.2g/L)提高了54.9％。5L发酵罐培养THY-7/Pg3-srfA(leuABCD-ilvK)，表面活性素产量最高达到19g/L。

以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

序列表

<110>清华大学

<120>一种高产脂肽的重组菌及其应用

<130>0

<160>12

<170>SIPOSequenceListing 1.0

<210>1

<211>518

<212>PRT

<213>Bacillus subtilis

<400>1

Met Arg Lys Ile Asn Phe Phe Asp Thr Thr Leu Arg Asp Gly Glu Gln

1 5 1015

Ser Pro Gly Val Asn Leu Asn Thr Gln Glu Lys Leu Ala Ile Ala Lys

202530

Gln Leu Glu Arg Leu Gly Ala Asp Ile Ile Glu Ala Gly Phe Pro Ala

354045

Ser Ser Arg Gly Asp Phe Leu Ala Val Gln Glu Ile Ala Arg Thr Ile

505560

Lys Asn Cys Ser Val Thr Gly Leu Ala Arg Cys Val Lys Gly Asp Ile

65707580

Asp Ala Ala Trp Glu Ala Leu Lys Glu Gly Ser His Pro Arg Ile His

859095

Val Phe Ile Ala Thr Ser Asp Ile His Leu Lys His Lys Leu Lys Met

100 105 110

Thr Arg Glu Gln Val Ile Glu Arg Ala Val Glu Met Val Lys Tyr Ala

115 120 125

Lys Glu Arg Phe Pro Ile Val Gln Trp Ser Ala Glu Asp Ala Cys Arg

130 135 140

Thr Glu Leu Pro Phe Leu Ala Glu Ile Val Glu Lys Val Ile Asp Ala

145 150 155 160

Gly Ala Ser Val Ile Asn Leu Pro Asp Thr Val Gly Tyr Leu Ala Pro

165 170 175

Ala Glu Tyr Gly Asn Ile Phe Arg Tyr Met Lys Glu Asn Val Pro Asn

180 185 190

Ile His Lys Ala Lys Leu Ser Ala His Cys His Asp Asp Leu Gly Met

195 200 205

Ala Val Ala Asn Ser Leu Ala Ala Ile Glu Asn Gly Ala Asp Gln Ile

210 215 220

Glu Cys Ala Val Asn Gly Ile Gly Glu Arg Ala Gly Asn Ala Ala Leu

225 230 235 240

Glu Glu Ile Ala Val Ala Leu His Thr Arg Lys Asp Phe Tyr Gln Val

245 250 255

Glu Thr Gly Ile Thr Leu Asn Glu Ile Lys Arg Thr Ser Asp Leu Val

260 265 270

Ser Lys Leu Thr Gly Met Ala Val Pro Arg Asn Lys Ala Val Val Gly

275 280 285

Asp Asn Ala Phe Ala His Glu Ser Gly Ile His Gln Asp Gly Phe Leu

290 295 300

Lys Glu Lys Ser Thr Tyr Glu Ile Ile Ser Pro Glu Leu Val Gly Val

305 310 315 320

Thr Ala Asp Ala Leu Val Leu Gly Lys His Ser Gly Arg His Ala Phe

325 330 335

Lys Asp Arg Leu Thr Ala Leu Gly Phe Gln Phe Asp Ser Glu Glu Ile

340 345 350

Asn Lys Phe Phe Thr Met Phe Lys Glu Leu Thr Glu Lys Lys Lys Glu

355 360 365

Ile Thr Asp Glu Asp Leu Val Ser Leu Ile Leu Glu Glu Lys Val Thr

370 375 380

Asp Arg Lys Ile Gly Tyr Glu Phe Leu Ser Leu Gln Val His Tyr Gly

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<212>PRT

<213>Bacillus subtilis

<400>2

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1 5 1015

Val Leu Glu Ser Ala Thr Asp Val Leu Lys Ser Val Ala Glu Arg Phe

202530

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115 120 125

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180 185 190

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290 295 300

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340 345 350

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<210>3

<211>472

<212>PRT

<213>Bacillus subtilis

<400>3

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1 5 1015

Lys His Gly Glu Gly Lys Pro Asp Leu Leu Tyr Ile Asp Leu His Leu

202530

Ile His Glu Val Thr Ser Pro Gln Ala Phe Glu Gly Leu Arg Gln Lys

354045

Gly Arg Lys Val Arg Arg Pro Gln Asn Thr Phe Ala Thr Met Asp His

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Arg Gln Val Thr Ala Leu Glu Arg Asn Cys Glu Glu Phe Gly Val Arg

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100 105 110

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115 120 125

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130 135 140

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<212>DNA

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Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。