专利摘要

一种定位逆胶束酶体系中自旋探针作用位置的方法，将氮氧自由基自旋探针与逆胶束酶体系缔合，通过分别改变逆胶束酶体系中的含水量和逆胶束酶水核中的酶浓度，测定氮氧自由基自旋探针旋转相关时间的变化趋势，实现对自旋探针作用位置的定位。本发明方法能够快速定位出自旋探针的作用位置，在测定自旋探针旋转相关时间的同时还可判断体系的微极性、微粘度，方便、快捷，所使用的试剂环境友好，可广泛应用于超活性以及高性能物质或体系的开发，对今后环境监测、化学分析以及环境保护等领域中的研究具有重要的指导意义。

权利要求

1.一种定位逆胶束酶体系中自旋探针作用位置的方法，其特征在于：将氮氧自由基自旋探针与逆胶束酶体系缔合，通过分别改变逆胶束酶体系中的含水量和逆胶束酶水核中的酶浓度，测定氮氧自由基自旋探针旋转相关时间的变化趋势，实现对自旋探针作用位置的定位。

2.根据权利要求1所述定位逆胶束酶体系中自旋探针作用位置的方法，其特征在于，所述测定氮氧自由基自旋探针旋转相关时间的变化趋势是指：先通过改变逆胶束酶体系中的含水量，检测自旋探针旋转相关时间与逆胶束酶体系中含水量的变化趋势，确定探针作用于逆胶束酶体系的亲水区域或疏水区域；再通过改变逆胶束酶水核中的酶浓度，根据自旋探针旋转相关时间的变化趋势对自旋探针作用位置进行精确定位。

3.根据权利要求1或2所述定位逆胶束酶体系中自旋探针作用位置的方法，其特征在于：所述改变逆胶束酶体系中的含水量即水与有机溶剂的体积比变化范围为0.1～1.2v/v%，所述改变逆胶束酶水核中的酶浓度的变化范围为0.1～0.6mmol/L。

4.根据权利要求1～3之一所述定位逆胶束酶体系中自旋探针作用位置的方法，其特征在于：若随着逆胶束酶体系中的含水量上升，自旋探针旋转相关时间呈下降趋势，并且随着逆胶束酶水核中的酶浓度上升，自旋探针旋转相关时间也呈下降趋势，则自旋探针定位于逆胶束结合水层；若随着逆胶束酶体系中的含水量上升，自旋探针旋转相关时间呈下降趋势，并且随着逆胶束酶水核中的酶浓度上升，自旋探针旋转相关时间呈上升趋势，则自旋探针定位于逆胶束自由水层；若随着逆胶束酶体系中的含水量上升，自旋探针旋转相关时间平稳或呈上升趋势，则自旋探针定位于有机相中。

5.根据权利要求1～4之一所述定位逆胶束酶体系中自旋探针作用位置的方法，其特征在于：将含氮氧自由基化合物的氯仿溶液与逆胶束酶体系的体积比以1:50～110的比例加入到逆胶束酶体系中。

6.根据权利要求5所述定位逆胶束酶体系中自旋探针作用位置的方法，其特征在于：所述含氮氧自由基在氯仿溶液中的摩尔浓度为0.3～0.5mmol/L。

7.根据权利要求1～6之一所述定位逆胶束酶体系中自旋探针作用位置的方法，其特征在于，所述缔合的方式为：将含氮氧自由基化合物的氯仿溶液加入逆胶束酶体系中，室温条件下，震荡8～10h，然后在20～25℃下，水浴20～24h，即成。

8.根据权利要求1～7之一所述定位逆胶束酶体系中自旋探针作用位置的方法，其特征在于：所述逆胶束酶体系的制备方法为：在室温下，将表面活性剂在非极性有机溶剂中的溶液与酶的水溶液以表面活性剂与酶的摩尔比为400～5000:1的比例混合均匀，震荡8～10h后，静置20～30h，即成。

9.根据权利要求8所述定位逆胶束酶体系中自旋探针作用位置的方法，其特征在于：所述表面活性剂为离子型表面活性剂。

10.根据权利要求1～9之一所述定位逆胶束酶体系中自旋探针作用位置的方法，其特征在于：所述酶的分子量≤100kDa。

说明书

技术领域

本发明涉及一种定位逆胶束酶体系中自旋探针作用位置的方法，具体涉及一种通过检测逆胶束酶体系微观构象特征以及探针运动情况以实现定位逆胶束酶体系中自旋探针作用位置的方法。

背景技术

逆胶束是表面活性剂在非极性有机溶剂中超过临界胶团浓度时自组装形成的纳米尺寸的聚集体，具有良好的热力学稳定性。逆胶束酶体系中，表面活性剂疏水的非极性尾部指向有机溶剂，亲水的极性头部指向聚集体内部形成一个纳米级大小的极性腔。此极性腔可容纳一定量的水，其内部接近细胞内环境，酶等生物物质溶解在其中，由于胶团的屏蔽作用，这些生物物质不与有机溶液直接接触，因而逆胶束酶体系可以有效保持生物物质的活性，从而提高该体系中酶催化反应的效率。

近年来，逆胶束酶体系性能的研究受到广泛的关注。逆胶束酶体系的微观性质，包括微极性和微粘度对逆胶束酶体系在环境污染治理等领域的应用非常重要。而这些微观参数的体现可以通过向体系中加入电子自选探针进行考察。逆胶束酶体系中，物质的微观构象发生改变，例如将物质的活性因子激活，或者对物质的活性中心产生影响，进而对其性质产生影响，而这些影响对于超活性以及高性能物质（或体系）的开发具有重要的推动作用。通过研究自选探针在体系中作用位置对于物质微观构象有重要的指导意义。逆胶束酶体系中探针的作用位置体现了体系各组分之间的缔合状况，同时对体现中物质的各种性能（包括活性、稳定性、粘度等）产生影响。然而，现阶段，逆胶束酶体系的微观构象以及探针运动情况还处于空白阶段。因此，开展微观体系中探针作用情况的研究有助于逆胶束酶体系在环境监测、化学分析以及环境保护等领域中的应用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种能够快速检测出体系各项参数并对自旋探针作用位置进行精准定位的定位逆胶束酶体系中自旋探针作用位置的方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：一种定位逆胶束酶体系中自旋探针作用位置的方法，将氮氧自由基自旋探针与逆胶束酶体系缔合，通过分别改变逆胶束酶体系中的含水量和逆胶束酶水核中的酶浓度，测定氮氧自由基自旋探针旋转相关时间的变化趋势，实现对自旋探针作用位置的定位。所述氮氧自由基自旋探针优选氮氧自由基硬脂酸自旋探针。

进一步，所述测定氮氧自由基自旋探针旋转相关时间的变化趋势是指：先通过改变逆胶束酶体系中的含水量，检测自旋探针旋转相关时间与逆胶束酶体系中含水量的变化趋势，确定探针作用于逆胶束酶体系的亲水区域或疏水区域；再通过改变逆胶束酶水核中的酶浓度，根据自旋探针旋转相关时间的变化趋势对自旋探针作用位置进行精确定位。所述亲水区域是指逆胶束结合水层和逆胶束自由水层，所述疏水区域是指有机相。所述逆胶束的水核中的水分为两类，第一类是自由水，分布在水核的中心部位，即逆胶束自由水层；第二类为结合水，分布在水核外围，紧贴表面活性剂，即逆胶束结合水层。所述有机相是指制备逆胶束酶体系时，用于溶解表面活性剂的非极性有机溶剂。

进一步，所述改变逆胶束酶体系中的含水量即水与有机溶剂的体积比变化范围为0.1～1.2v/v%，所述改变逆胶束酶水核中的酶浓度的变化范围为0.1～0.6mmol/L。逆胶束酶体系中的含水量变化是通过改变加水量实现，逆胶束酶水核中的酶浓度变化是通过改变水溶液中酶的加入量实现。

进一步，若随着逆胶束酶体系中的含水量上升，自旋探针旋转相关时间呈下降趋势，并且随着逆胶束酶水核中的酶浓度上升，自旋探针旋转相关时间也呈下降趋势，则自旋探针定位于逆胶束结合水层；若随着逆胶束酶体系中的含水量上升，自旋探针旋转相关时间呈下降趋势，并且随着逆胶束酶水核中的酶浓度上升，自旋探针旋转相关时间呈上升趋势，则自旋探针定位于逆胶束自由水层；若随着逆胶束酶体系中的含水量上升，自旋探针旋转相关时间平稳或呈上升趋势，则自旋探针定位于有机相中。

判断自旋探针位于逆胶束结合水层、逆胶束自由水层或有机相中的理论依据如下：当逆胶束酶体系中水的比例增加时，逆胶束酶水核增大，旋转相关时间有明显的下降，即探针分子运动受到的阻力减小，探针定位于逆胶束酶水核中，由于酶分子具有亲水性，聚集在逆胶束的自由水中，当越来越多的酶分子进入水核中心自由水中时，旋转相关时间下降，即探针受到的阻力减小，因此，证明探针位于逆胶束的结合水层；同理，当逆胶束酶水核中的酶含量升高，而旋转相关时间上升，则说明酶分子与探针之间产生作用力，影响探针的翻转运动，导致自旋探针运动受到的阻力增加，说明探针与酶分子位于同一水层中，即自由水层中；当逆胶束酶体系中水含量升高时，逆胶束酶水核增大，而旋转相关时间没有明显的下降，则探针分子运动受到的阻力没有降低，因此，证明探针并未作用于水核，而定位于有机相中。

进一步，将含氮氧自由基化合物的氯仿溶液与逆胶束酶体系的体积比以1:50～110的比例加入到逆胶束酶体系中。氮氧自由基氯仿溶剂加入量过多会导致逆胶束酶体系结构本身产生改变；而加入量过少会导致检测信号较弱。

进一步，所述含氮氧自由基在氯仿溶液中的摩尔浓度为0.3～0.5mmol/L。过高的氮氧自由基硬脂酸浓度会影响逆胶束酶体系的本身结构，过低的浓度会导致检测信号变弱。

进一步，所述缔合的方式为：将含氮氧自由基化合物的氯仿溶液加入逆胶束酶体系中，室温条件下，震荡8～10h，然后在20～25℃下，水浴20～24h，即成。发明人通过研究发现，所述实验参数范围内，所得氮氧自由基化合物与逆胶束酶体系的缔合更加稳定。

进一步，所述逆胶束酶体系的制备方法为：在室温下，将表面活性剂在非极性有机溶剂中的溶液与酶的水溶液以表面活性剂与酶的摩尔比为400～5000:1（优选500～3000:1）的比例混合均匀，震荡8～10h后，静置20～30h，即成。发明人通过研究发现，所述实验参数范围内，所得逆胶束酶体系更加稳定。

进一步，所述表面活性剂为离子型表面活性剂，优选十二烷基硫酸钠、十六烷基三甲基溴化铵或十二烷基三甲基氯化铵。表面活性剂在非极性有机溶剂中的溶液浓度为1.0～1.5mmol/L。

进一步，所述酶的分子量≤100kDa，优选辣根过氧化物酶。所述酶的水溶液浓度为0.1～0.6mmol/L，逆胶束酶水核中的酶浓度与酶的水溶液浓度一致。

进一步，所述非极性有机溶剂为正己烷、异辛烷等。

本发明应用电子自旋共振法研究逆胶束酶体系中各组分缔合情况，从而实现对逆胶束酶体系中自旋探针作用位置的精确定位。电子自旋共振技术通过未配对电子由低能级到高能级时自旋取向的改变来进行检测分析，具有其它技术不及的高灵敏度，对纳米级体系中探针作用位置能够进行判断分析，通过相关参数的测定，可以获取不成对电子能态以及所处的位置等信息。顺磁性的物质含有一个或者更多未成对电子，当该物质的自旋电子处于外加磁场时，吸收了足够的电磁辐射后，该电子会产生翻转状态，即自旋状态的翻转，该技术对自旋翻转的电子进行瞬间检测，检测非常精准，可信度高。

本发明方法的优点在于：目前，对于逆胶束酶体系中，自旋探针与逆胶束结合水层、逆胶束自由水层或有机相之间缔合的状况及自旋探针作用位置，体系的各项性能参数，包括体系的微极性、微粘度都不明确，该研究领域尚属空白，而本发明方法填补了研究空白，能够快速定位出自旋探针的作用位置，在测定自旋探针旋转相关时间的同时还可判断体系的微极性、微粘度，方便、快捷，所使用的试剂环境友好，可广泛应用于超活性以及高性能物质或体系的开发，对今后环境监测、化学分析以及环境保护等领域中的研究具有重要的指导意义。

附图说明

图1为实施例1中自旋探针旋转相关时间随着逆胶束酶体系中的含水量增加的变化趋势图；

图2为实施例1中自旋探针旋转相关时间随着逆胶束酶水核中的酶浓度增加的变化趋势图；

图3为实施例2中自旋探针旋转相关时间随着逆胶束酶体系中的含水量增加的变化趋势图；

图4为实施例2中自旋探针旋转相关时间随着逆胶束酶水核中的酶浓度增加的变化趋势图；

图5为实施例3中自旋探针旋转相关时间随着逆胶束酶体系中的含水量增加的变化趋势图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明。

本发明实施例所使用的表面活性剂为十二烷基硫酸钠（实施例1）、十六烷基三甲基溴化铵（实施例2）、十二烷基三甲基氯化铵（实施例3），均购于Sigma公司；所使用的辣根过氧化物酶（分子量40kDa）、氮氧自由基硬脂酸，均购于Sigma公司；其它所使用的化学试剂，如无特殊说明，均通过常规商业途径获得。

实施例1

制备不同含水量的逆胶束酶体系：

在室温下，分别将5mL十二烷基硫酸钠的正己烷溶液（1.2mmol/L）与10μL、20μL、30μL、40μL、50μL浓度为0.2mmol/L的辣根过氧化物酶的水溶液样品#1，#2，#3，#4，#5混合均匀，放入震荡器中充分震荡10h后，静置24h，即得不同含水量的逆胶束酶体系#1～#5。

制备水核中不同酶浓度的逆胶束酶体系：

在室温下，分别将5mL十二烷基硫酸钠的正己烷溶液（1.2mmol/L）与20μL酶的水溶液浓度分别为0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.3mmol/L、0.4mmol/L、0.5mmol/L的辣根过氧化物酶的水溶液样品#1’，#2’，#3’，#4’，#5’混合均匀，放入震荡器中充分震荡10h后，静置24h，即得水核中不同酶浓度的逆胶束酶体系#1’～#5’。

氮氧自由基硬脂酸自旋探针与逆胶束酶体系缔合：

将50μL氮氧自由基硬脂酸的氯仿溶液（0.4mmol/L）分别加入上述所得不同含水量的逆胶束酶体系#1，#2，#3，#4，#5中，室温条件下，在摇床中震荡10h，然后在25℃下，水浴24h进行缔合，检测自旋探针旋转相关时间与逆胶束酶体系中的含水量的变化趋势，明确探针作用于逆胶束酶体系的亲水区域或疏水区域；再将50μL氮氧自由基硬脂酸的氯仿溶液（0.4mmol/L）分别加入上述所得水核中不同酶浓度的逆胶束酶体系#1’，#2’，#3’，#4’，#5’中，室温条件下，在摇床中震荡10h，然后在25℃下，水浴24h进行缔合，根据自旋探针旋转相关时间的变化趋势对自旋探针作用位置进行精确定位，实现对自旋探针作用位置的定位。

本实施例采用BrukerEMX-EPR型电子自旋共振仪，计算得出自旋探针的旋转相关时间，具体的计算方法如下：

（1）

（2）

式中：τ为旋转相关时间，△H为中央峰谱线宽度，h₀为中央峰高度，h₊₁为低场峰高度，h_-1为高场峰高度；当τ≥3ns时，采用公式（1），当τ＜3ns时，采用公式（2）。

具体分析如下：如图1所示，#1～#5逆胶束酶体系中的含水量即水与正己烷的体积比（氯仿及水中的酶和正己烷中表面活性剂对溶剂体积的影响忽略不计，下同）分别为0.2v/v%、0.4v/v%、0.6v/v%、0.8v/v%、1.0v/v%，测定电子自旋共振光谱，计算得出逆胶束酶体系中自旋探针旋转相关时间，从整体上看，随着逆胶束酶体系中的含水量增加，自旋探针旋转相关时间呈下降趋势，表明随着含水量的增加，表面活性剂分子链变得疏松，即逆胶束个体变大，微极性增大，探针运动的范围有所增加。

综上，自旋探针在逆胶束酶体系中翻转运动受到的阻力较小，这是由于逆胶束酶中水核具有较强的超活性，使得探针在其中运动阻力非常小，同时随着含水量的增加，旋转相关时间降低，因此，判断自旋探针作用于逆胶束酶的水核中心。

如图2所示，#1’～#5’逆胶束酶体系中酶在逆胶束酶水核中的浓度分别为0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.3mmol/L、0.4mmol/L、0.5mmol/L，测定电子自旋共振光谱，计算得出逆胶束酶体系中自旋探针旋转相关时间，从整体上看，随着逆胶束酶水核中的酶浓度增加，自旋探针旋转相关时间呈下降的趋势，说明此时探针分子运动受到的阻力逐渐降低，体系的微粘度降低。

综上，由逆胶束酶体系的性质可知，酶进入自由水层，被包裹起来，位于逆胶束酶水核中心自由水层，当越来越多的酶分子进入自由水中，如果探针位于自由水层，则随着酶分子数量增加，自旋探针受到的阻力会增加，而从检测结果来看，自旋探针的旋转相关时间在高浓度酶时有所降低，进一步证实自旋探针作用于逆胶束酶体系的结合水层。

实施例2

制备不同含水量的逆胶束酶体系：

在室温下，分别将5mL十六烷基三甲基溴化铵的正己烷溶液（1.0mmol/L）与10μL、20μL、30μL、40μL、50μL浓度为0.2mmol/L的辣根过氧化物酶的水溶液样品#1，#2，#3，#4，#5混合均匀，放入震荡器中充分震荡8h后，静置20h，即得不同含水量的逆胶束酶体系#1～#5。

制备水核中不同酶浓度的逆胶束酶体系：

在室温下，分别将5mL十六烷基三甲基溴化铵的正己烷溶液（1.0mmol/L）与20μL酶的水溶液浓度分别为0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.3mmol/L、0.4mmol/L、0.5mmol/L的辣根过氧化物酶的水溶液样品#1’，#2’，#3’，#4’，#5’混合均匀，放入震荡器中充分震荡8h后，静置20h，即得水核中不同酶浓度的逆胶束酶体系#1’～#5’。

氮氧自由基硬脂酸自旋探针与逆胶束酶体系缔合：

将50μL氮氧自由基硬脂酸的氯仿溶液（0.3mmol/L）分别加入上述所得不同含水量的逆胶束酶体系#1，#2，#3，#4，#5中，室温条件下，在摇床中震荡8h，然后在25℃下，水浴20h进行缔合，检测自旋探针旋转相关时间与逆胶束酶体系中的含水量的变化趋势，明确探针作用于逆胶束酶体系的亲水区域或疏水区域；再将50μL氮氧自由基硬脂酸的氯仿溶液（0.3mmol/L）分别加入上述所得水核中不同酶浓度的逆胶束酶体系#1’，#2’，#3’，#4’，#5’中，室温条件下，在摇床中震荡8h，然后在25℃下，水浴20h进行缔合，根据自旋探针旋转相关时间的变化趋势对自旋探针作用位置进行精确定位，实现对自旋探针作用位置的定位。

具体分析如下：如图3所示，设置逆胶束酶体系中的含水量即水与正己烷的体积比分别为0.2v/v%、0.4v/v%、0.6v/v%、0.8v/v%、1.0v/v%，测定电子自旋共振光谱，计算得出逆胶束酶体系中自旋探针旋转相关时间，从整体上看，随着逆胶束酶体系中的含水量增加，自旋探针旋转相关时间呈下降趋势，表明随着含水量的增加，表面活性剂分子链变得疏松，即逆胶束个体变大，探针运动受到的阻力减小，运动的范围有所增加。

综上，自旋探针在逆胶束酶体系中翻转运动受到的阻力较小，这是由于逆胶束中水核具有较强的超活性，使得探针在其中运动阻力非常小，同时随着含水量的增加，旋转相关时间降低，因此，判断自旋探针作用于逆胶束酶的水核中心。

如图4所示，#1’～#5’逆胶束酶体系中酶在逆胶束酶水核中的浓度分别为0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.3mmol/L、0.4mmol/L、0.5mmol/L，测定电子自旋共振光谱，计算得出逆胶束酶体系中自旋探针旋转相关时间，从整体上看，随着逆胶束酶水核中的酶浓度增加，自旋探针旋转相关时间大致呈上升趋势。当酶含量升高，而旋转相关时间上升，则说明酶分子与探针之间产生作用力，影响探针的翻转运动，导致自选探针运动受到的阻力增加，说明探针与酶分子位于同一水层中，即自由水层中。

实施例3

制备不同含水量的逆胶束酶体系：

在室温下，分别将5mL十二烷基三甲基氯化铵的正己烷溶液（1.0mmol/L）与10μL、20μL、30μL、40μL、50μL浓度为0.2mmol/L的辣根过氧化物酶的水溶液样品#1，#2，#3，#4，#5混合均匀，放入震荡器中充分震荡8h后，静置20h，即得不同含水量的逆胶束酶体系#1～#5。

制备水核中不同酶浓度的逆胶束酶体系：

在室温下，分别将5mL十二烷基三甲基氯化铵的正己烷溶液（1.0mmol/L）与20μL酶的水溶液浓度分别为0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.3mmol/L、0.4mmol/L、0.5mmol/L的辣根过氧化物酶的水溶液样品#1’，#2’，#3’，#4’，#5’混合均匀，放入震荡器中充分震荡8h后，静置20h，即得水核中不同酶浓度的逆胶束酶体系#1’～#5’。

氮氧自由基硬脂酸自旋探针与逆胶束酶体系缔合：

将100μL氮氧自由基硬脂酸的氯仿溶液（0.5mmol/L）分别加入上述所得不同含水量的逆胶束酶体系#1，#2，#3，#4，#5中，室温条件下，在摇床中震荡8h，然后在25℃下，水浴20h进行缔合，检测自旋探针旋转相关时间与逆胶束酶体系中的含水量的变化趋势，明确探针作用于逆胶束酶体系的亲水区域或疏水区域；再将50μL氮氧自由基硬脂酸的氯仿溶液（0.5mmol/L）加入上述所得水核中不同酶浓度的逆胶束酶体系#1’，#2’，#3’，#4’，#5’中，室温条件下，在摇床中震荡8h，然后在20℃下，水浴20h进行缔合，根据自旋探针旋转相关时间的变化趋势对自旋探针作用位置进行精确定位，实现对自旋探针作用位置的定位。

具体分析如下：如图5所示，#1～#5逆胶束酶体系中的含水量即水与正己烷的体积比分别为0.2v/v%、0.4v/v%、0.6v/v%、0.8v/v%、1.0v/v%，测定电子自旋共振光谱，计算得出逆胶束酶体系中自旋探针旋转相关时间，从整体上看，随着逆胶束酶体系中的含水量增加，自旋探针旋转相关时间并没有体现出明显的下降趋势，且呈上升趋势，表明随着含水量的增加，表面活性剂分子链变得疏松，即逆胶束酶个体变大，而探针运动受到的阻力并没有降低，因此，自旋探针运动范围不在水核，而是位于有机溶剂中。

一种定位逆胶束酶体系中自旋探针作用位置的方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。