专利摘要
本发明涉及一种松脂醇活性物质的酶促合成方法。该方法包括以下步骤：将水或磷酸盐缓冲液与水溶性有机溶剂混合得到混合溶液；将松脂醇底物加入所述混合溶液中；加入漆树酶在20-45℃下反应48-96小时；反应完后，向反应产物中加入适量甲醇和酒石酸钠，然后对反应产物进行乙酸乙酯萃取、无水硫酸钠干燥和浓缩处理，然后进行甲醇重结晶得到结晶物或者硅胶柱层析浓缩纯化得到层析物；对结晶物或层析物进行氮吹或冷冻干燥，得到松脂醇活性物质。本发明所提供的松脂醇活性物质的合成方法条件温和，反应环保，简单快捷，成本低廉，在制备同类生物药物活性的复杂化合物等领域有广阔的应用前景。
说明书
技术领域
本发明涉及一种松脂醇活性物质的合成方法，尤其涉及一种松脂醇活性物质的酶促合成方法，属于活性化合物合成技术领域。
背景技术
松脂醇是我国特产中草药杜仲中的活性成分之一，在我国已有几千年的使用史，最早有文字可查的记载上溯到东汉初年(约公元25年)成书的《神农本草经》。
现代研究表明，松脂醇和它的单甲基酯、双甲基酯和β-D-糖苷等衍生物，都具有抑制环腺苷酸磷酸二脂酶活性，以及抗高血压和抑制肿瘤等功能，杜仲的药理功能主要来自于其中的松脂醇等活性成分。传统的松脂醇一般从植物中分离，或者通过化学法合成，以松树为原料进行分离时分离率最高为20-25％，以杜仲为原料进行分离时的分离率约为10％，化学法具有合成步骤多而繁琐、反应复杂、副产物多、后处理烦琐等缺点，更重要的是对环境有严重的影响。
因此，现在一个研究的热点方向是寻找一种高效的催化剂，在水或水溶性溶剂体系中催化合成目标产物。真菌漆酶和植物漆酶是两大类对化合物的催化具有不同的作用。有资料表明，国内外对漆酶催化过程中，由于没有解决溶剂使用上的问题，对于此类生物催化剂的高效使用上存在很大不足，仍然存在严重的过程污染。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种松脂醇活性物质的制备方法，通过采用高效的生物催化剂，并在水溶性溶剂体系中进行反应制备得到松脂醇活性物质，该方法具有原料廉价易得，催化剂制备容易，一步反应快捷，后处理简单，产率较高，对环境污染较小等特点。
为达到上述目的，本发明提供了一种松脂醇活性物质的酶促合成方法，其包括以下步骤：
将水或磷酸盐缓冲液与水溶性有机溶剂混合得到混合溶液；
将松脂醇底物加入所述混合溶液中；
加入漆树酶在20-45℃下反应48-96小时；
反应完后，向反应产物中加入适量甲醇和酒石酸钠，然后对反应产物进行乙酸乙酯 萃取、无水硫酸钠干燥和浓缩处理，然后进行甲醇重结晶得到结晶物或者硅胶柱层析浓缩纯化得到层析物；
对结晶物或层析物进行氮吹或冷冻干燥，得到松脂醇活性物质。
本发明所提供的上述酶促合成方法是在水溶性溶剂体系中，使松脂醇的原料在漆树酶作为催化剂的情况下反应制备得到松脂醇活性物质。
在本发明提供的上述酶促合成方法中，优选地，在混合溶液中，水或磷酸盐缓冲液的体积含量为5-95％。
在本发明提供的上述酶促合成方法中，优选地，所采用的磷酸盐缓冲液的pH值为6-8，即所采用的磷酸盐缓冲液为pH值6-8的磷酸盐缓冲液。
本发明所采用的磷酸盐缓冲液可以是本领域中任何所常用的磷酸盐缓冲液，优选地，所采用的磷酸盐为磷酸氢钠和/或磷酸氢钾等。
在本发明提供的上述酶促合成方法中，优选地，所采用的水溶性有机溶剂为丙酮、乙醇、甘油、二氧六环、乙酸、乙腈、甲醇、丙醇、乙二醇、异丙醇和四氢呋喃中的一种或几种的组合。
在本发明提供的上述酶促合成方法中，所采用的松脂醇底物可以是任何常用的物质，优选地，本发明所采用的松脂醇底物为松柏醇和/或异丁香酚等。
在本发明提供的上述酶促合成方法中，优选地，甲醇与水溶性有机溶剂等摩尔量，酒石酸钠为水或磷酸盐缓冲液的摩尔量的二分之一。
在本发明提供的上述酶促合成方法中，优选地，硅胶柱层析中所采用的淋洗剂为正己烷和乙酸乙酯，二者的体积比为4∶1。
在本发明提供的上述酶促合成方法中，优选地，松脂醇底物在混合溶液中的浓度为0.01-0.1mol/L。在本发明中，所采用的松脂醇底物可以是松柏醇或异丁香酚等，松脂醇底物的添加量可多可少，在以分离量的可得基础上，优选地，松脂醇底物的添加量为0.5mmol以上。
在本发明提供的上述酶促合成方法中，漆树酶只是一种催化剂，目的就是为了减少其用量，但保证反应完成，达到最大的经济性和环保性，即使酶的用量少点，反应速度差点，在分析量产率可得的情况下，漆树酶的添加量越少越好；优选地，以混合溶液计，漆树酶的添加量为1-10μg/mL。
在本发明提供的上述酶促合成方法中，优选地，该方法还包括对利用乙酸乙酯进行萃取得到的萃取物进行饱和氯化钠洗涤的步骤。利用饱和氯化钠进行洗涤的步骤的目的 是脱气和水溶性溶剂，其用量只要能够达到上述目的即可，一般其添加量与所添加的水或磷酸盐缓冲液等质量即可。
本发明提供的上述酶促合成方法具有以下优点：
1、配置水溶性溶剂体系进行反应，解决了物质相不溶的问题；
2、在合成过程中不再使用苯、甲苯和其它等对环境有严重污染的溶剂，属于环境友好型催化反应；
3、反应之后的后处理简单，反应效果好，产率高。
总之，本发明所提供的松脂醇活性物质的合成方法条件温和，反应环保，简单快捷，成本低廉，在制备同类生物药物活性的复杂化合物等领域有广阔的应用前景。
附图说明
图1为实施例1制备的松脂醇活性物质的红外图谱；
图2为实施例6制备的松脂醇活性物质的红外图谱。
具体实施方式
为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现对本发明的技术方案进行以下详细说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。
实施例1
本实施例提供了一种松脂醇活性物质的制备方法，其包括以下步骤：
将磷酸氢钠缓冲液(浓度为0.1mol/L，pH值为6.8)与丙酮按照1∶1的体积比混合得到混合溶液，在该混合溶液中，磷酸盐缓冲液的体积含量为50％；
将1mmol松脂醇底物松柏醇加入到25mL混合溶液中；
加入1μg漆树酶在室温下反应72小时；
反应完后，向反应产物中加入适量甲醇和酒石酸钠(甲醇与水溶性有机溶剂等摩尔量，酒石酸钠为磷酸盐缓冲液的摩尔量的二分之一)，然后利用乙酸乙酯对反应产物进行萃取、饱和氯化钠洗涤、无水硫酸钠干燥和浓缩处理，然后进行甲醇重结晶浓缩纯化；
对结晶物或层析物进行氮吹或冷冻干燥，得到松脂醇活性物质。
采用本实施例提供的松脂醇活性物质的制备方法得到的松脂醇活性物质的产率为18.5-23.5wt％。
实施例2
本实施例提供了一种松脂醇活性物质的制备方法，其包括以下步骤：
将磷酸氢钾缓冲液(浓度为0.1mol/L，pH值为6.8)与丙酮按照4∶1的体积比混合得到混合溶液，在该混合溶液中，磷酸盐缓冲液的体积含量为80％；
将1mmol松脂醇底物异丁香酚加入到50mL混合溶液中；
加入10μg漆树酶在室温下反应72小时；
反应完后，向反应产物中加入适量甲醇和酒石酸钠(甲醇与水溶性有机溶剂等摩尔量，酒石酸钠为磷酸盐缓冲液的摩尔量的二分之一)，然后利用乙酸乙酯对反应产物进行萃取、饱和氯化钠洗涤、无水硫酸钠干燥和浓缩处理，然后进行甲醇重结晶浓缩纯化；
对结晶物或层析物进行氮吹或冷冻干燥，得到松脂醇活性物质。
采用本实施例提供的松脂醇活性物质的制备方法得到的松脂醇活性物质的产率为2.0-8.5wt％。
实施例3
本实施例提供了一种松脂醇活性物质的制备方法，其包括以下步骤：
将磷酸氢二钠和磷酸二氢钾缓冲液(浓度为0.1mol/L，pH值为6.8)与乙醇按照1∶1的体积比混合得到混合溶液，在该混合溶液中，磷酸盐缓冲液的体积含量为50％；
将1mmol松脂醇底物松柏醇加入50mL混合溶液中；
加入15μg漆树酶在室温下反应72小时；
反应完后，向反应产物中加入适量甲醇和酒石酸钠(甲醇与水溶性有机溶剂等摩尔量，酒石酸钠为磷酸盐缓冲液的摩尔量的二分之一)，然后利用乙酸乙酯对反应产物进行萃取、饱和氯化钠洗涤、无水硫酸钠干燥和浓缩处理，然后进行硅胶柱层析(正己烷∶乙酸乙酯＝4∶1)浓缩纯化；
对结晶物或层析物进行氮吹或冷冻干燥，得到松脂醇活性物质。
采用本实施例提供的松脂醇活性物质的制备方法得到的松脂醇活性物质的产率为17-25wt％。
实施例4
本实施例提供了一种松脂醇活性物质的制备方法，其包括以下步骤：
将磷酸氢钠缓冲液(浓度为0.1mol/L，pH值为6.8)与乙醇按照1∶5的体积比混合得到混合溶液，在该混合溶液中，磷酸盐缓冲液的体积含量为16.67％；
将1mmol松脂醇底物异丁香酚加入30mL混合溶液中；
加入5μg漆树酶在室温下反应72小时；
反应完后，向反应产物中加入适量甲醇和酒石酸钠(甲醇与水溶性有机溶剂等摩尔 量，酒石酸钠为磷酸盐缓冲液的摩尔量的二分之一)，然后利用乙酸乙酯对反应产物进行萃取、饱和氯化钠洗涤、无水硫酸钠干燥和浓缩处理，然后进行甲醇重结晶浓缩纯化；
对结晶物或层析物进行氮吹或冷冻干燥，得到松脂醇活性物质。
采用本实施例提供的松脂醇活性物质的制备方法得到的松脂醇活性物质的产率为7.0-12.8wt％。
实施例5
本实施例提供了一种松脂醇活性物质的制备方法，其包括以下步骤：
将磷酸氢钠缓冲液(浓度为0.1mol/L，pH值为6.8)与甘油按照1∶1的体积比混合得到混合溶液，在该混合溶液中，磷酸盐缓冲液的体积含量为50％；
将1mmol松脂醇底物松柏醇加入50mL混合溶液中；
加入20μg漆树酶在室温下反应72小时；
反应完后，向反应产物中加入适量甲醇和酒石酸钠(甲醇与水溶性有机溶剂等摩尔量，酒石酸钠为磷酸盐缓冲液的摩尔量的二分之一)，然后利用乙酸乙酯对反应产物进行萃取、饱和氯化钠洗涤、无水硫酸钠干燥和浓缩处理，然后进行硅胶柱层析(正己烷∶乙酸乙酯＝4∶1)浓缩纯化；
对结晶物或层析物进行氮吹或冷冻干燥，得到松脂醇活性物质。
采用本实施例提供的松脂醇活性物质的制备方法得到的松脂醇活性物质的产率为36.7-57.3wt％。
实施例6
本实施例提供了一种松脂醇活性物质的制备方法，其包括以下步骤：
将磷酸氢钾缓冲液(浓度为0.1mol/L，pH值为6.8)与二氧六环按照1∶1的体积比混合得到混合溶液，在该混合溶液中，磷酸盐缓冲液的体积含量为50％；
将1mmol松脂醇底物异丁香酚加入50mL混合溶液中；
加入5μg漆树酶在室温下反应72小时；
反应完后，向反应产物中加入适量甲醇和酒石酸钠(甲醇与水溶性有机溶剂等摩尔量，酒石酸钠为磷酸盐缓冲液的摩尔量的二分之一)，然后利用乙酸乙酯对反应产物进行萃取、饱和氯化钠洗涤、无水硫酸钠干燥和浓缩处理，然后进行甲醇重结晶浓缩纯化；
对结晶物或层析物进行氮吹或冷冻干燥，得到松脂醇活性物质。
采用本实施例提供的松脂醇活性物质的制备方法得到的松脂醇活性物质的产率为10.0-15.7wt％。
实施例7
本实施例提供了一种松脂醇活性物质的制备方法，其包括以下步骤：
将磷酸氢钠缓冲液(浓度为0.1mol/L，pH值为6.8)与二氧六环按照93∶7的体积比混合得到混合溶液，在该混合溶液中，磷酸盐缓冲液的体积含量为93％；
将1mmol松脂醇底物异丁香酚加入25mL混合溶液中；
加入4μg漆树酶在室温下反应72小时；
反应完后，向反应产物中加入适量甲醇和酒石酸钠(甲醇与水溶性有机溶剂等摩尔量，酒石酸钠为磷酸盐缓冲液的摩尔量的二分之一)，然后利用乙酸乙酯对反应产物进行萃取、饱和氯化钠洗涤、无水硫酸钠干燥和浓缩处理，然后进行甲醇重结晶浓缩纯化；
对结晶物或层析物进行氮吹或冷冻干燥，得到松脂醇活性物质。
采用本实施例提供的松脂醇活性物质的制备方法得到的松脂醇活性物质的产率为1.2-5.0wt％。
实施例8
本实施例提供了一种松脂醇活性物质的制备方法，其包括以下步骤：
将水与二氧六环按照93∶7的体积比混合得到混合溶液，在该混合溶液中，水体积含量为93％；
将1mmol松脂醇底物松柏醇加入25mL混合溶液中；
加入12μg漆树酶在室温下反应72小时；
反应完后，向反应产物中加入适量甲醇和酒石酸钠(甲醇与水溶性有机溶剂等摩尔量，酒石酸钠为磷酸盐缓冲液的摩尔量的二分之一)，然后利用乙酸乙酯对反应产物进行萃取、饱和氯化钠洗涤、无水硫酸钠干燥和浓缩处理，然后进行甲醇重结晶浓缩纯化；
对结晶物或层析物进行氮吹或冷冻干燥，得到松脂醇活性物质。
采用本实施例提供的松脂醇活性物质的制备方法得到的松脂醇活性物质的产率为3.0wt％。
对实施例1和实施例6制备得到的松脂醇活性物质(松脂醇I和松脂醇II)进行结构鉴定，包括薄层层析、红外、氢谱和碳谱，检测结果如下，其中，红外图谱分别如图1和图2所示。
松脂醇I的结构鉴定：
Rf：0.57(chloroform/menthol＝9/1).EIMS(70eV)m/z：137(M+，100)，358(34).
IR(KBr)em-1：3400，2960，2880，1760，1600，1520，1270，1030.
1H-NMR(DMSO-d6)δ(ppm)：3.03(2H，quint，β-CH)，3.73(2H，quint，γA-CH2)，3.77(6H，s，OCH3)，4.12(2H，γB-CH2)，4.61(2H，d，J＝4.7Hz，α-CH)，6.73～～6.92(5H，Ar-H).
13C-NMR(DMSO-d6)δ(ppm)：53.6(β-CH)，55.6(OCH3)，70.9(γ-CH2)，85.1(α-CH)，110.4(2)，115.1(5)，118.6(6)，132.2(1)，145.9(4)，147.5(3).
松脂醇II的结构鉴定：
Rf：0.18(hexane/AcOEt＝3/2).EIMS(70eV)m/z：650(M+，100).
IR(KBr)cm-1：3310，2960，1600，1500，1450，1330，1270，1220，1140，1050.
1H-NMR(DMSO-d6)δ(ppm)：1.32(6H，d，J＝6.8Hz，γ-CH3)，1.82(6H，d，J＝6.4Hz，γ’-CH3)，3.43(2H，quint，β-CH)，3.77(6H，s，OCH3)，3.82(6H，s，OCH3)，5.10(2H，d，J＝9.0Hz，α-CH)，6.09～6.17(2H，m，β’-CH)，6.35(1H，d，J＝15.9Hz，α’-CH)，6.80～6.99(8H，m，Ar-H).
13C-NMR(DMSO-d6)δ(ppm)：17.1(γ-CH3)，17.2(γ’-CH3)，44.1(β-CH)，55.9(OCH3)，56.0(OCH3)，92.1(α-CH)，109.2(A-3)，110.6(B-3)，113.1(B-5)，121.0(A-5)，122.2(β’-CH)，125.2(A-6)，130.2(A-4)，130.6(α’-CH)，131.4(B-4)，133.2(B-6)，143.4(B-2)，143.6(A-1)，146.1(B-1)，147.7(A-2) 。
松脂醇活性物质的酶促合成方法专利购买费用说明
Q：办理专利转让的流程及所需资料
A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。
1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。
2：按规定缴纳著录项目变更手续费。
3：同时提交相关证明文件原件。
4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。
Q:专利著录项目变更费用如何缴交
A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式
Q：专利转让变更，多久能出结果
A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。
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