专利摘要

我们首次将抗性基因sat整合到质粒pMA5上构建出新的具有NTC抗性质粒pMA5‑sat。另外，实验室前期筛选获得一株核黄素生产菌Bacillus subtilis RF1，该菌株对多种常规抗生素都有一定的抗性，所以对于该菌株运用质粒表达外源基因的抗性筛选造成了困难。为了验证所构建新型质粒的实用性，首次将来自Bacillus subtilis RF1自身的葡萄糖‑6‑磷酸脱氢酶基因zwf连接抗性质粒pMA5‑sat上，得到表达载体pMA5‑sat‑zwf,将表达载体转化到核黄素生产菌Bacillus subtilis RF1中得到重组菌Bacillus subtilis RF1/pMA5‑sat‑zwf。多次发酵罐结果表明重组菌发酵60h核黄素产量达到12.01g/L，比原始菌的9.22g/L提高了30.3％。说明新构建的重组质粒pMA5‑sat能够用于枯草芽孢杆菌的代谢改造。

权利要求

1.一种重组枯草芽孢杆菌发酵生产核黄素的方法，其特征是：

培养基组成：种子培养基g/L：蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10；发酵罐发酵培养基g/L：葡萄糖40，酵母粉10，二水合柠檬酸三钠0.11，(NH4)2HPO4 6,KH2PO4 5，MgSO4·7H2O 1.5，ZnSO4·7H2O 0.03，MnCl2·4H2O 0.05，FeSO4·7H2O 0.02；发酵罐补料培养基g/L：葡萄糖600，酵母粉10，(NH4)2HPO4 6，KH2PO4 5；

发酵罐培养条件：5L发酵罐装液量2L,转速600rpm，用30％v/v NH4OH和1M H2SO4控制pH为6.8，温度40℃，采取葡萄糖浓度限制补料策略使发酵液葡萄糖浓度保持在10-15g/L；其中所述的重组枯草芽孢杆菌的制备方法如下：

(1)构建重组质粒pMA5-sat：以合成的sat全基因片段DNA为模板，根据sat基因的特异性设计引物，P1：5’-ACCGGGATCCATGAAAATTTCGGTGATC-3’BamHI；P2：5’-GGCACGCGTTTAGGCGTCATCCTGTGCTCC-3’MluI；扩增条件：94℃预变性，5min，一个循环；94℃变性，1min，58℃退火，1min，72℃延伸，30s，35个循环；72℃，10min，一个循环；15℃，10min，一个循环；PCR扩增体系：合成的sat全基因片段DNA 1μL，上下游引物各0.5μL，dNTP Mix4μL，10×Ex Taq Buffer5μL，灭菌的双蒸水38μL，Ex Taq DNA聚合酶1μL，扩增sat基因，大小为525bp；将基因sat连接表达载体pMA5，得到重组质粒pMA5-sat；

(2)重组质粒pMA5-sat-zwf的构建：以枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis RF1基因组DNA为模板，根据NCBI中提供的Bacillus subtilis 168的zwf基因序列，用Primer 5.0软件设计引物P3：AGGCGGATCCGTGAAAACAAACCAACAACC、P4：ACCGACGCGTTTATATGTTCCACCAGTGTA，并在其上下游引入酶切位点BamH I和Mlu I；以Bacillus subtilis RF1基因组DNA为模板，克隆出基因片段；PCR产物经胶回收后得到zwf基因片段和pMA5通过BamH I与Mlu I双酶切，经琼脂糖凝胶电泳后，回收目的片段，16℃连接过夜后转化E.coli JM109，通过酶切验证，最终得到表达载体pMA5-zwf；再设计引物P5：AGGCGATATCGTAAGCTAGACAAAAC、P6：ACCGGGTACCTTATATGTTCCACCAGTG，并在其上下游引入酶切位点EcoR V和Kpn I；以质粒pMA5-zwf为模板克隆出带启动子HpaII的基因片段HpaII-zwf；基因片段HpaII-zwf和步骤(1)所述载体pMA5-sat通过EcoR V与Kpn I双酶切，经琼脂糖凝胶电泳后，回收目的片段，16℃连接过夜后转化E.coli JM109，通过酶切验证，最终得到表达载体pMA5-sat-zwf；

(3)重组枯草芽孢杆菌重组菌的获得：步骤(2)获得的所述载体用改进的Spizizen法制备枯草芽孢杆菌感受态细胞，将重组质粒转化感受态枯草芽孢杆菌Bacillus subtilisRF1，在含NTC抗生素的抗性平板上挑取抗性转化子，提取质粒酶切验证正确，得到重组菌Bacillus subtilis RF1/pMA5-sat-zwf。

说明书

技术领域

构建重组质粒pMA5-sat表达NTC抗性基因和运用抗性质粒表达葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因zwf提高核黄素产量属于基因工程领域。

背景技术

诺瓦丝菌素Norseothricin(NTC)是一种链丝菌素Streptothricin类抗生素，能够抑制蛋白质的合成和正确编码。NTC被广泛运用于细菌、真菌、酵母、植物细胞等的抗性筛选，是一种对阳性筛选子没有副作用的一种抗生素。并且，NTC易溶于水，并且在4℃水溶液中可稳定保存2年。实验证实，由基因sat编码的链丝菌素乙酰基转移酶，能够乙酰化NTC的β-赖氨酸的β-氨基，使NTC失活。

实验室前期选育了一株核黄素高产菌Bacillus subtilis RF1，多次实验证明该菌株对于氨苄霉素、卡那霉素、红霉素、氯霉素等都有抗性，所以对于该菌株的抗性筛造成了困难。但是，通过实验证明该菌株不能够在浓度为20mg/L的NTC抗性培养基中生长。于是，我们考虑构建一种新型的抗性筛选质粒。而质粒pMA5作为一种稳定的穿梭质粒，被广泛运用于枯草芽孢杆菌的表达系统中。所以，我们尝试将抗性基因sat整合到质粒pMA5上构建出一种能够抗NTC抗生素的新型的抗性质粒。

核黄素是一种维生素，又称维生素B2，是人和动物体必需的维生素之一，为黄素酶类辅酶的组成部分，在生物体内主要以黄素单核苷酸(FMN)和黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)的形式存在，参与机体组织呼吸链电子传递及氧化还原反应，在呼吸和生物氧化中起着重要作用，是生命活动中不可缺少的维生素。其中，在枯草芽孢杆菌中，核黄素的合成以GTP和核酮糖-5-磷酸(P5P)为前体物经过7步酶催化反应得到，并且整个过程可以总结为下列反应方程式：3P5P+Gly+14ATP+2NADPH+2C1→riboflavin+3NADH+2formate。所以核黄素的过量合成存在两个假说的瓶颈：一是前体物GTP和核酮糖-5-磷酸的有限供应；二是催化合成过程的酶的有限供应和活性。葡萄糖-6-磷酸脱氢酶是葡萄糖进入磷酸戊糖途的一个关键酶，课题组对前期选育的原始菌Bacillus subtilis RF1的磷酸戊糖途径的关键酶葡萄糖-6-磷酸脱氢酶进行加强表达以提高磷酸戊糖通量，一方面获得更高水平的前体物核酮糖-5-磷酸的积累，另一方面也提高了核黄素合成所需NADPH的剂量。从而提高核黄素的产量。

发明内容

本发明的主要研究内容：本发明利用分子技术克隆了链丝菌素因乙酰基转移酶基因sat，构建重组抗性表达载体pMA5-sat，并将其转化Bacillus subtilis RF1，得到重组菌Bacillus subtilis RF1/pMA5-sat，并且重组菌能够在NTC抗性平板上稳定地生长。实验结果表明，重组质粒能够在宿主菌中正常表达抗性基因sat，使NTC抗生素失活，从而构建出一种新型的NTC抗生素抗性质粒。

首次运用抗性质粒pMA5-sat在核黄素生产菌Bacillus subtilis RF1加强表达葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因zwf，得到重组菌Bacillus subtilis RF1/pMA5-sat-zwf,并成功提高了核黄素产量，说明重组质粒pMA5-sat能够有效的用于枯草芽孢杆菌的改造。

本发明的技术方案：

(1)抗性质粒pMA5-sat的构建：

以上海生工公司合成的sat全基因片段DNA为模板，根据sat基因的特异性设计引物，P1：5’-ACCGGGATCCATGAAAATTTCGGTGATC-3’(BamHI)；P2：5’-GGCACGCGTTTAGGCGTCATCCTGTGCTCC-3’(MluI)；扩增条件：94℃预变性，5min，一个循环；94℃变性，1min，58℃退火，1min，72℃延伸，30s，35个循环；72℃，10min，一个循环；15℃，10min，一个循环。PCR扩增体系：合成的sat全基因片段DNA 1μL，上下游引物各0.5μL，dNTPMix 4μL，10×Ex Taq Buffer 5μL，灭菌的双蒸水38μL，Ex Taq DNA聚合酶1μL，扩增sat基因，大小为525bp。将基因sat连接表达载体pMA5，得到重组质粒pMA5-sat，通过转化大肠杆菌感受态转入大肠杆菌E.coli JM109中，在含氨苄霉素的抗性平板上挑取抗性转化子，提取质粒酶切验证，并送样至生工测序正确，得到重组菌E.coli JM109/pMA5-sat；

(2)抗性质粒pMA5-sat转化Bacillus subtilis RF1：

从重组菌E.coli JM109/pMA5-sat中提取构建正确的重组质粒pMA5-sat，用改进的Spizizen法制备枯草芽孢杆菌感受态细胞，将重组质粒转化感受态枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis RF1，在含NTC抗生素的抗性平板上挑取抗性转化子，提取质粒酶切验证正确，得到重组菌Bacillus subtilis RF1/pMA5-sat。

(3)表达载体的构建pMA5-sat-zwf：

以枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis RF1基因组DNA为模板，根据NCBI中提供的Bacillus subtilis 168的zwf基因序列，用Primer 5.0软件设计引物P3：AGGCGGATCCGTGAAAACAAACCAACAACC、P4：ACCGACGCGTTTATATGTTCCACCAGTGTA,并在其上下游引入酶切位点BamH I和Mlu I。以Bacillus subtilis RF1基因组DNA为模板，克隆出基因片段。PCR产物经胶回收后得到zwf基因片段，连接克隆载体pMD-18T，转化E.coli JM109，阳性转化子经酶切验证后，由上海生工生物有限公司测序，并将重组质粒命名为T-zwf。载体T-zwf和pMA5通过BamH I与MluI双酶切，经琼脂糖凝胶电泳后，回收目的片段，16℃连接过夜后转化E.coli JM109，通过酶切验证，最终得到表达载体pMA5-zwf。再设计引物P5：AGGCGATATCGTAAGCTAGACAAAAC、P6：ACCGGGTACCTTATATGTTCCACCAGTG，并在其上下游引入酶切位点EcoR V和Kpn I。以质粒pMA5-zwf为模板克隆出带启动子HpaII的基因片段HpaII-zwf。基因片段HpaII-zwf和载体pMA5-sat通过EcoR V与Kpn I双酶切，经琼脂糖凝胶电泳后，回收目的片段，16℃连接过夜后转化E.coli JM109，通过酶切验证，最终得到表达载体pMA5-sat-zwf。

(4)表达载体pMA5-sat-zwf转化Bacillus subtilis RF1：

从重组菌E.coli JM109/pMA5-sat-zwf中提取构建正确的重组质粒pMA5-sat-zwf，用改进的Spizizen法制备枯草芽孢杆菌感受态细胞，将重组质粒转化感受态枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis RF1，在含NTC抗生素的抗性平板上挑取抗性转化子，提取质粒酶切验证正确，得到重组菌Bacillus subtilis RF1/pMA5-sat-zwf。

用所述重组枯草芽孢杆菌发酵生产核黄素的方法：

出发菌株：枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis RF1和Bacillus subtilis RF1/pMA5-sat-zwf；

培养基组成：种子培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10。发酵罐发酵培养基(g/L):葡萄糖40，酵母粉10，二水合柠檬酸三钠0.11，(NH₄)₂HPO₄6,KH₂PO₄5,MgSO₄·7H₂O1.5,ZnSO₄·7H2O 0.03,MnCl₂·4H₂O 0.05,FeSO₄·7H₂O 0.02。发酵罐补料培养基(g/L)：葡萄糖600，酵母粉10，(NH₄)₂HPO₄6，KH₂PO₄5。

发酵罐培养条件：5L发酵罐装液量2L,转速600rpm，用30％(v/v)NH₄OH和1M H₂SO₄控制pH为6.8，温度40℃,采取葡萄糖浓度限制补料策略使发酵液葡萄糖浓度保持在10-15g/L。用生物传感分析仪(SBA-40C山东，中国)测定发酵液中残余葡萄糖的含量。

本发明的有益效果：构建出一种新型的抗性质粒，可用于宿主菌的抗性筛选，为宿主菌表达外源基因提供了条件。运用抗性质粒在核黄素生产菌Bacillus subtilis RF1中加强表达葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，有效地增强了细胞内磷酸戊糖途径的通量，为核黄素的合成提供了充足的前体物和辅酶NADPH供应。对重组菌Bacillus subtilis RF1/pMA5-sat-zwf进行发酵分析，多次发酵罐结果表明重组菌发酵60h核黄素产量达到12.01g/L，比原始菌的9.22g/L提高了30.3％。

具体实施方式

实施例1：抗性质粒pMA5-sat的构建：

以上海生工公司合成的sat全基因片段DNA为模板，根据sat基因的特异性设计引物，P1：5’-ACCGGGATCCATGAAAATTTCGGTGATC-3’(BamHI)；P2：5’-GGCACGCGTTTAGGCGTCATCCTGTGCTCC-3’(MluI)；扩增条件：94℃预变性，5min，一个循环；94℃变性，1min，58℃退火，1min，72℃延伸，30s，35个循环；72℃，10min，一个循环；15℃，10min，一个循环。PCR扩增体系：合成的sat全基因片段DNA 1μL，上下游引物各0.5μL，dNTPMix 4μL，10×Ex Taq Buffer 5μL，灭菌的双蒸水38μL，Ex Taq DNA聚合酶1μL，扩增sat基因，大小为525bp。将基因sat连接表达载体pMA5，得到重组质粒pMA5-sat，通过转化大肠杆菌感受态转入大肠杆菌E.coli JM109中，在含氨苄霉素的抗性平板上挑取抗性转化子，提取质粒酶切验证，并送样至生工测序正确，得到重组菌E.coli JM109/pMA5-sat；

实施例2：抗性质粒pMA5-sat转化Bacillus subtilis RF1：

从重组菌E.coli JM109/pMA5-sat中提取构建正确的重组质粒pMA5-sat，用改进的Spizizen法制备枯草芽孢杆菌感受态细胞，将重组质粒转化感受态枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis RF1，在含NTC抗生素的抗性平板上挑取抗性转化子，提取质粒酶切验证正确，得到重组菌Bacillus subtilis RF1/pMA5-sat。

实施例3：表达载体的构建pMA5-sat-zwf：

以枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis RF1基因组DNA为模板，根据NCBI中提供的Bacillus subtilis 168的zwf基因序列，用Primer 5.0软件设计引物P3：AGGCGGATCCGTGAAAACAAACCAACAACC、P4：ACCGACGCGTTTATATGTTCCACCAGTGTA,并在其上下游引入酶切位点BamH I和Mlu I。以Bacillus subtilis RF1基因组DNA为模板，克隆出基因片段。PCR产物经胶回收后得到zwf基因片段，连接克隆载体pMD-18T，转化E.coli JM109，阳性转化子经酶切验证后，由上海生工生物有限公司测序，并将重组质粒命名为T-zwf。载体T-zwf和pMA5通过BamH I与Mlu I双酶切，经琼脂糖凝胶电泳后，回收目的片段，16℃连接过夜后转化E.coli JM109，通过酶切验证，最终得到表达载体pMA5-zwf。再设计引物P5：AGGCGATATCGTAAGCTAGACAAAAC、P6：ACCGGGTACCTTATATGTTCCACCAGTG，并在其上下游引入酶切位点EcoR V和Kpn I。以质粒pMA5-zwf为模板克隆出带启动子HpaII的基因片段HpaII-zwf。基因片段HpaII-zwf和载体pMA5-sat通过EcoR V与Kpn I双酶切，经琼脂糖凝胶电泳后，回收目的片段，16℃连接过夜后转化E.coli JM109，通过酶切验证，最终得到表达载体pMA5-sat-zwf。

实施例4：表达载体pMA5-sat-zwf转化Bacillus subtilis RF1：

从重组菌E.coli JM109/pMA5-sat-zwf中提取构建正确的重组质粒pMA5-sat-zwf，用改进的Spizizen法制备枯草芽孢杆菌感受态细胞，将重组质粒转化感受态枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis RF1，在含NTC抗生素的抗性平板上挑取抗性转化子，提取质粒酶切验证正确，得到重组菌Bacillus subtilis RF1/pMA5-sat-zwf。

实施例5：用所述重组枯草芽孢杆菌发酵生产核黄素

发酵条件如上本发明技术方案所述。对重组菌Bacillus subtilis RF1/pMA5-sat-zwf进行发酵分析，多次发酵罐结果表明重组菌发酵60h核黄素产量达到12.01g/L，比原始菌的9.22g/L提高了30.3％。

一种新型抗性质粒的构建及其在核黄素生产菌中的运用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。