专利摘要

本发明提供一种催化性能提升的谷氨酸脱羧酶突变体及其应用，所述突变体是来源自巨大芽孢杆菌CICC10055的野生型谷氨酸脱羧酶SEQIDNO:1第280位氨基酸由酪氨酸Y突变为甲硫氨酸M得到。通过谷氨酸脱羧酶的活性测定分析，发现相较于野生型谷氨酸脱羧酶，本发明的谷氨酸脱羧酶突变体Y280M在不同pH或温度条件下都表现出明显提高的酶活性，提示其更适合工业化生产γ‑氨基丁酸。

权利要求

1.一种谷氨酸脱羧酶突变体，其特征在于，是将对应于来源自巨大芽孢杆菌CICC10055的野生型谷氨酸脱羧酶SEQ ID NO:1第280位氨基酸由酪氨酸Y突变为甲硫氨酸M得到。

2.如权利要求1所述的谷氨酸脱羧酶突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

3.编码如权利要求1或2所述的谷氨酸脱羧酶突变体的编码基因。

4.如权利要求3所述的编码基因，其特征在于，其核苷酸序列可以是SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。

5.含有如权利要求3或4所述的编码基因的表达载体、重组菌株。

6.权利要求1或2所述的突变体在生产γ-氨基丁酸中的应用。

7.一种含有共表达的如权利要求1或2所述的谷氨酸脱羧酶突变体和γ-氨基丁酸转运蛋白的重组菌株。

8.如权利要求7所述的重组菌株，其特征在于，所述γ-氨基丁酸转运蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。

9.如权利要求7或8所述的重组菌株，其特征在于，其是棒杆菌属、肠杆菌属或短杆菌属菌株。

10.如权利要求9所述的重组菌株，其特征在于，其是谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌、黄色短杆菌、钝齿棒杆菌、枯草芽孢杆菌。

11.利用如权利要求7至10任一项所述的重组菌株制备γ-氨基丁酸的方法，其特征在于，将所述重组菌株发酵和蛋白诱导表达后，制备成全细胞催化菌泥；在纯水相体系中加入L-谷氨酸或其盐作为底物和所述全细胞催化菌泥，培育以产生γ-氨基丁酸。

说明书

技术领域

本发明公开了一种活性增强的谷氨酸脱羧酶突变体及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

γ-氨基丁酸 (γ-aminobutyricacid, GABA)是一种重要的抑制性神经递质，具有降低血压、抗焦虑和抑郁、改善睡眠、提高记忆力、治疗癫痫等生理功能，在食品、医药和饲料等领域具有广泛的市场前景。γ-氨基丁酸因较好的生理功能和应用前景受到广泛关注，并被应用于食品、医药和化妆品中。日本厚生省、欧洲食品安全局和美国食品药品管理局承认乳酸菌发酵生产的GABA为天然食品添加剂。我国卫生部也批准此类产品为新资源食品。此外，γ-氨基丁酸还可用于合成2-吡咯烷酮，2-吡咯烷酮可用于合成尼龙-4，具有重要的工业应用价值。据粗略统计，目前全球各类 GABA 总产能约6万吨/年，约10 %属于微生物法或植物富集法生产的可以应用于食品或医药等领域。

目前，γ-氨基丁酸生产包括化学合成法、植物富集法和微生物合成法等。化学合成的GABA有原料残留，因此安全性差，不能添加到食品中；植物中GABA含量低，富集提取成本较高；而微生物合成GABA因安全性高、生产成本低和对环境友好更具开发价值。谷氨酸脱羧酶（EC 4.1.1.15）能不可逆地催化L-谷氨酸（盐）转化生成γ-氨基丁酸，是生物转化法合成γ-氨基丁酸的关键酶制剂，具有巨大的市场应用价值。但是，目前国内外已报道的谷氨酸脱羧酶一般催化效率较低且酶活性范围偏酸性，这一特性已经严重影响了其在工业上的应用前景。

因此，通过筛选或分子改造谷氨酸脱羧酶，获得具有优良的催化性能的关键酶制剂，并基于此构建高效生物催化系统，是实现γ-氨基丁酸高产需要解决的主要技术问题之一。

发明内容

本发明的目的在于提供一种催化性能提升的谷氨酸脱羧酶突变体及其重组菌株，并使用该菌株建立了高效生产γ-氨基丁酸的全细胞转化方法。

本发明首先提供了一种酶活提高的谷氨酸脱羧酶突变体，是将对应于来源自巨大芽孢杆菌CICC 10055的野生型谷氨酸脱羧酶SEQ ID NO:1第280位氨基酸由酪氨酸Y突变为甲硫氨酸M的氨基酸序列。所述谷氨酸脱羧酶突变体包括如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，所述谷氨酸脱羧酶突变体的编码核苷酸序列可以是SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。

其次，本发明提供表达了一种生产γ-氨基丁酸的双酶共表达载体，所述共表达载体是在一个质粒中同时导入谷氨酸脱羧酶突变体和γ-氨基丁酸转运蛋白的编码基因。进一步地，本发明提供一种重组菌株，其是将所述双酶共表达载体转化或导入宿主菌株所得。宿主菌株选自棒杆菌属、肠杆菌属或短杆菌属菌株，优选地是谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌、黄色短杆菌、钝齿棒杆菌枯草芽孢杆菌等。

在一个实施方案中，所述双酶共表达载体中γ-氨基丁酸转运蛋白含有如SEQ IDNO:5所示的氨基酸序列，其编码核酸序列如SEQ ID NO:6所示。根据本发明，用于所述突变体表达的载体种类没有特殊限定，可以为能够在菌株中表达目的基因的本领域常用的各种表达载体，用于所述突变体表达的宿主菌株也没有特殊限定，可以为本领域技术人员已知的各种模式菌株。

最后，本发明提供了一种高效制备γ-氨基丁酸的方法。采用发酵罐进行重组菌株的高密度发酵和蛋白诱导表达，制备全细胞催化菌泥；在纯水相体系中加入L-谷氨酸（盐）底物和全细胞催化菌泥，常温常压下进行γ-氨基丁酸制备。

本发明有益效果在于，本发明通过对谷氨酸脱羧酶基因进行的突变，能够大大提高其产γ-氨基丁酸的能力，通过谷氨酸脱羧酶的活性测定分析，发现相较于野生型谷氨酸脱羧酶，本发明的谷氨酸脱羧酶突变体Y280M在不同pH或温度条件下都表现出明显提高的酶活性，提示其更适合工业化生产。进一步的设计了共表达谷氨酸脱羧酶突变体和γ-氨基丁酸转运蛋白构建的优良重组菌株。通过实验表明，基于共表达谷氨酸脱羧酶突变体和γ-氨基丁酸转运蛋白构建的重组菌株具有优良的γ-氨基丁酸生产能力，全细胞催化反应12h后，转化液中γ-氨基丁酸的含量可达662.1 g/L，底物摩尔转化率接近100%，相比于含有未突变谷氨酸脱羧酶基因的重组菌具有更好的工业化应用前景。

附图说明

图1 不同生物来源的谷氨酸脱羧酶序列比对分析。

图2基于全细胞催化生产γ-氨基丁酸示意图。

图3 γ-氨基丁酸制备样品。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明，但并不构成对本发明的限制。

实施例1 谷氨酸脱羧酶突变体的构建

谷氨酸脱羧酶是生物催化L-谷氨酸脱羧反应生成γ-氨基丁酸的关键酶，但是目前国内外已报道的谷氨酸脱羧酶一般催化效率较低且酶活性范围偏酸性，当环境pH高于6.0时，绝大部分谷氨酸脱羧酶的酶活会急剧下降，这一特性严重影响了其在工业上的应用。本领域技术人员都知晓，利用全细胞催化等生物法制备γ-氨基丁酸时，工程菌的胞内pH环境常需要保持中碱性，以使胞内的大部分酶或蛋白发挥作用，从而维持工程菌株正常的生理状态。目前，来源于大肠杆菌（Escherichia coli）的谷氨酸脱羧酶的晶体结构已经得到解析（PDB ID:1PMO），并鉴定出许多重要的催化位点和保守基序。来源于嗜热古细菌（Pyrococcus horikoshii）的谷氨酸脱羧酶是目前唯一发现的最适pH为偏碱性的酶制剂。本发明人通过分析来源于巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）的野生型谷氨酸脱羧酶序列与上述其他菌株来源的同源序列比对结果（如图1所示），将筛选谷氨酸脱羧酶突变体的原则确定为需要提高该酶在偏中性范围内的活性。采用将巨大芽孢杆菌谷氨酸脱羧酶保守基序中某一氨基酸残基突变为嗜热古细菌谷氨酸脱羧酶中相对应的氨基酸残基的策略，在多个氨基酸残基突变位点上进行了尝试，结合同源建模和保守性位点预测，最终确定SEQID NO:1的氨基酸序列的第280位酪氨酸Y为突变靶点。

采用定点突变策略，根据待突变的氨基酸位点来设计点突变引物，通过PCR方法获得谷氨酸脱羧酶突变序列。

本实施例选取的表达载体pXMJ19为诱导表达型载体，该质粒本身含有强启动子tac相关序列（包括操纵序列lacO），当加入IPTG或乳糖等诱导物时，会促使阻遏蛋白离开操纵序列从而起始基因表达。设计包含突变位点的重叠互补引物（Y280M-F：5’-aggacacaagtatggtttagtttaccctggcttg-3’和Y280M-R：5’-ctaaaccatacttgtgtcctgacacgttaatg-3’），以含有野生型谷氨酸脱羧酶编码序列的pXMJ19-GAD质粒为模板，利用PCR扩增获得相应点突变质粒后，使用DpnI限制性内切酶消化模板质粒，随后转化大肠杆菌感受态并涂布含有氯霉素的筛选平板。筛选获得含有特定突变位点的重组质粒突变体，并进行公司测序确认，突变质粒分别命名为pXMJ19-GAD-Y280M。

实施例2 谷氨酸脱羧酶突变体酶活测定

将上述获得的含有pXMJ19-GAD-Y280M质粒的重组大肠杆菌进行蛋白诱导表达。具体方法为：将单克隆菌落接种于含有3 mL LB液体培养基(10 g/L胰蛋白胨，5 g/L酵母提取物，5g/L NaCl)，经过过夜培养后获得种子液。将种子液以1%体积比转接于100 mL LB液体培养基中，菌体浓度OD600生长至1.0左右时，添加终浓度为0.4 mM IPTG诱导目的蛋白表达，调整培养温度25℃，继续诱导培养16 h。

离心收集菌体后，弃上清，用ddH2O重悬菌体细胞。采用超声破碎法对菌体细胞进行破碎处理。谷氨酸脱羧酶活性测定采用以下标准方案：取0.4 mL样品溶液，依次加入 0.1mL 1mol/L 碳酸钠溶液，0.5 mL 0.2mol/L硼酸盐缓冲液（pH 10），上下摇动混匀后，加入1mL 6%苯酚溶液，加入1 mL 次氯酸钠溶液（有效氯不低于7.5%），摇匀后室温放置6 min，沸水浴中加热10 min，立即置于冰浴中10 min，然后加入2 mL 60%乙醇，混匀后室温放置10min，测定640 nm处吸光度值。标准液经过比色法，测定OD640吸光度值，以吸光度为纵坐标，GABA浓度为横坐标，绘制标准曲线。酶活定义：每分钟生成1 μmol GABA定义为一个酶活单位U，每毫克蛋白对应的酶活为比酶活U/mg。

通过谷氨酸脱羧酶的活性测定分析，发现相较于野生型谷氨酸脱羧酶，谷氨酸脱羧酶突变体Y280M在不同pH或温度条件下都表现出明显提高的酶活性，提示其更适合工业化生产。

表1 野生型和突变体的催化活性比较

实施例3 谷氨酸脱羧酶和γ-氨基丁酸转运蛋白共表达重组菌株构建

采用单个强启动子将谷氨酸脱羧酶突变体编码基因和γ-氨基丁酸转运蛋白编码基因进行串联表达，其中谷氨酸脱羧酶突变体编码基因和γ-氨基丁酸转运蛋白编码基因间为保守性RBS序列（5’-ctttaagaaggagatatacat-3’）。在具体实施方案中，设计一对引物对（GAD-5F：5’-agtcggatccatgcctcaatggcatccgcatc-3’和GAD-3R：5’-ctgtctgtactgatgtagccatatgtatatctccttcttaaagttaatgatgaaatccat-3），以pXMJ19-GAD-Y280M突变质粒为模板，扩增获得Y280M突变体片段；设计一对引物对（GadT-5F：5’- gacaatggatttcatcattaactttaagaaggagatatacatatggctacatcagtacagacag-3’和GadT-3R：5’-tgctgaattcttagtgtttcttgtcattcatcacaatatatgctggtgaagttgcacg-3’），以大肠杆菌基因组为模板，扩增获得GadT片段。以上述两段基因序列为模板，并以GAD-5F和GadT-3R为引物，通过搭桥PCR扩增获得已经添加RBS序列的谷氨谷氨酸脱羧酶突变体和γ-氨基丁酸转运蛋白编码基因融合片段（Y280M-GadT）。将上述片段经过BamHI和EcoRI双酶切后进行回收，与同样经过BamHI和EcoRI双酶切的pXMJ19质粒骨架进行连接，将连接产物转化大肠杆菌后，筛选获得双酶共表达载体pXMJ19-Y280M-GadT，将所获质粒送公司进行测序确认。将上述构建获得的双酶共表达载体pXMJ19-Y280M-GadT，转化食品安全级工业菌种谷氨酸棒杆菌，筛选获得含有双酶共表达载体的重组菌株，用于γ-氨基丁酸的生产制备。

实施例4 重组菌株的高密度发酵培养和蛋白诱导

本实施例用于提供一种重组菌株的高密度发酵培养和全细胞催化菌泥的制备方法。所述发酵培养的方法可以包括以下步骤：将含有双酶共表达载体pXMJ19-Y280M-GadT的重组菌株，接种于100 mL LBHIS液体培养基（2.5 g/L酵母提取，5 g/L胰蛋白胨，5 g/L NaCl，18g/L 脑心浸液），在32 °C，200 r/min摇床中进行过夜震荡培养，获得重组菌株种子液。按照2~4%接种量将种子液接种于已装有5 L发酵培养基的发酵罐中，设定培养温度30°C，搅拌转速400 r/min，自动控制培养pH条件为7.0。待菌体生长至OD600≈30~50时，添加终浓度为1mM IPTG，继续发酵培养20 h，诱导靶蛋白的表达。待诱导完成后，取1 mL菌液进行超声破碎处理后，随后利用SDS-PAGE检测重组菌株中双酶的表达情况。发酵培养结束后，离心收集菌体细胞，去掉上清废液，使用ddH2O洗涤和重悬菌体细胞，即得全细胞催化用菌泥。

实施例5 构建全细胞催化系统高效生产γ-氨基丁酸

基于全细胞催化生产γ-氨基丁酸示意图见图2。将构建的表达谷氨酸脱羧酶突变体和γ-氨基丁酸转运蛋白的重组菌株，在纯水相体系中直接加入L-谷氨酸底物，开发生物转化法高效生产γ-氨基丁酸的工艺。作为一个优选的具体实施方案，利用3 L发酵罐建立全细胞催化反应体系，分批次添加950 g/L终浓度的L-谷氨酸底物，加入15 g/L全细胞催化用菌泥，控制反应转速200 r/min，催化反应温度35°C，催化反应时间12 h。待反应结束后，利用液相色谱法对全细胞催化反应液组分和含量进行分析。结果表明，基于共表达谷氨酸脱羧酶突变体和γ-氨基丁酸转运蛋白构建的重组菌株具有优良的γ-氨基丁酸生产能力，全细胞催化反应12 h后，转化液中γ-氨基丁酸的含量可达662.1 g/L，底物摩尔转化率接近100%。相比于含有未突变谷氨酸脱羧酶基因的重组菌，本发明的谷氨酸脱羧酶基因突变体的重组菌的转化率提高显著，因而具有更好的工业化应用前景。

表2 野生型和突变体菌株的γ-氨基丁酸生产性能

通过离心收集全细胞催化结束后的转化液，去陈菌体沉淀细胞，建立和优化γ-氨基丁酸分离提取工艺。γ-氨基丁酸分离纯化的工艺基本流程包括转化液预处理、双层滤纸过滤、活性炭脱色、真空抽滤、冷却结晶、洗涤干燥等。经过上述工艺获得的γ-氨基丁酸样品具有优良的晶型、色泽和纯度（获得的γ-氨基丁酸产品如图3所示）。

以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所

<120> 一种谷氨酸脱羧酶突变体及其在生产γ-氨基丁酸中的应用

<130>

<160> 13

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 467

<212> PRT

<213> Bacillus megaterium

<400> 1

MPQWHPHREQ KNLPDEFPVN PLFSRQGEVT IPRLRIGDQG MLPETAYQII HDEIALDGNA 60

RLNLATFVTT WMEPDAKRLY GESFDKNMID KDEYPQTAAI EERCVRILAD LWNSPNPDTT 120

MGVSTTGSSE ACMLGGLALK RRWQKLRKSK GLSTDRPNIV FSSSVQVVWE KFANYWDVEP 180

RYVNINPDHP YLDAEGVINA VDENTIGVVP ILGVTYTGGY EPIAAIAKAL DELQEKTGLD 240

IPIHVDAASG GFIAPFLQPD LIWDFRLPRV KSINVSGHKY GLVYPGLGWV IWREKEDLPE 300

DLIFRVSYLG GNMPTFALNF SRPGAQVLLQ YYNFLRLGKD GYYAVQKTSQ ENALFLSKEI 360

GEMDAFEILA DGSDIPVLAW KLKEDYTPNW TLYDLSRQLR TYGWQVPAYP LPADMEEITI 420

MRIVVRNGFS RDLAHLFMVN FKQAVEFLNS LDRPVLKDTK YDNGFHH 467

<210> 2

<211> 1404

<212> DNA

<213> Bacillus megaterium

<400> 2

attcctatcc atgtagatgc tgcttctgga ggttttatcg ctccatttct tcaaccagac 780

cttatctggg atttccgctt gccgcgagta aagtccatta acgtgtcagg acacaagtat 840

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ggctattatg ccgtgcaaaa aacctcccaa gaaaacgcgc tgtttcttag caaagaaatt 1080

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atgcgcattg ttgttagaaa tgggttttca agagaccttg ctcatttatt tatggttaat 1320

ttcaaacaag ccgttgaatt tcttaactcg ttggatagac ctgttcttaa agacacgaaa 1380

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<210> 3

<211> 467

<212> PRT

<213> Bacillus megaterium

<400> 3

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RLNLATFVTT WMEPDAKRLY GESFDKNMID KDEYPQTAAI EERCVRILAD LWNSPNPDTT 120

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<210> 4

<211> 1404

<212> DNA

<213> Bacillus megaterium

<400> 4

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<210> 5

<211> 511

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 5

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<210> 6

<211> 1536

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 6

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ccagcatata ttgtgatgaa tgacaagaaa cactaa 1536

<210> 7

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

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<210> 8

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ctaaaccata cttgtgtcct gacacgttaa tg 32

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

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<210> 10

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

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<210> 11

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

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<210> 12

<211> 64

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

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<210> 13

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

tgctgaattc ttagtgtttc ttgtcattca tcacaatata tgctggtgaa gttgcacg 58

一种谷氨酸脱羧酶突变体及其在生产γ-氨基丁酸中的应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。