专利摘要

本发明涉及一种新的非天然人参皂苷Rd12(3‑O‑β‑D‑glucopyranosyl(1‑2)‑β‑D‑glucopyranosyl‑12‑O‑β‑D‑glucopyranosyl‑protopanaxadiol)及其制备方法和应用，本发明以廉价的蔗糖为葡萄糖糖基供体，利用糖基转移酶和蔗糖合成酶作为偶联催化剂，以人参皂苷Rg3为糖基受体，以廉价的蔗糖为糖基供体，高效催化人参皂苷Rg3的C12位羟基糖基化生产非天然人参皂苷Rd12，具有专一性好、催化效率高、产物纯化简单等特点。另外，本发明制备的非天然人参皂苷Rd12可作为抗肿瘤药物，非天然人参皂苷Rd12对结肠癌细胞、肝癌细胞、肺癌细胞和胃癌细胞有显著的抑制作用。

权利要求

1.一种非天然人参皂苷Rd12，其特征在于，所述非天然人参皂苷Rd12具有式I所示结构：

2.一种制备如权利要求1所述非天然人参皂苷Rd12的方法，其特征在于，在含有人参皂苷Rg3、蔗糖、蔗糖合成酶、糖基转移酶和尿苷二磷酸的催化反应体系或宿主细胞的存在下，将人参皂苷Rg3转化为非天然人参皂苷Rd12；

其中，所述宿主细胞包括表达糖基转移酶和/或蔗糖合成酶的载体。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述糖基转移酶为糖基转移酶Bs-YjiC。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述糖基转移酶Bs-YjiC的编码基因来源于枯草芽孢杆菌和/或其突变体。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述糖基转移酶Bs-YjiC的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或与其具有85％同源性。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述糖基转移酶Bs-YjiC的氨基酸序列与SEQ ID NO.1具有95％同源性。

7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述蔗糖合成酶来源于拟南芥、大豆、亚硝酸单胞菌或嗜酸性喜温硫杆菌中的任意一种或至少两种的组合。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述蔗糖合成酶来源于拟南芥、大豆或嗜酸性喜温硫杆菌中的任意一种或至少两种的组合。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述蔗糖合成酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.2-6中的任意一种或与SEQ ID NO.2-6中的任意一种具有85％同源性。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述蔗糖合成酶的氨基酸序列与SEQ IDNO.2-6中的任意一种具有95％同源性。

11.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述蔗糖合成酶为来自拟南芥的蔗糖合成酶AtSuSy，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

12.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述糖基转移酶在所述催化反应体系中的浓度为10-1000mU/mL。

13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述糖基转移酶在所述催化反应体系中的浓度为160mU/mL。

14.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述蔗糖合成酶在所述催化反应体系中的浓度为10-1000mU/mL。

15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述蔗糖合成酶在所述催化反应体系中的浓度为200mU/mL。

16.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述糖基转移酶为糖基转移酶Bs-YjiC。

17.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述蔗糖合成酶为蔗糖合成酶AtSuSy。

18.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母、谷氨酸棒状杆菌、枯草芽孢杆菌或黑曲霉中的任意一种或至少两种的组合。

19.一种抗肿瘤药物，其特征在于，所述药物包括如权利要求1所述的非天然人参皂苷Rd12。

20.根据权利要求19所述的抗肿瘤药物，其特征在于，所述抗肿瘤药物还包括药学上可接受的载体。

21.根据权利要求19所述的抗肿瘤药物，其特征在于，所述肿瘤包括肝癌、肺癌、结肠癌或胃癌中的任意一种或至少两种的组合。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术和植物学技术领域，涉及一种非天然人参皂苷Rd12及其制备方法和应用，具体涉及一种利用糖基转移酶和蔗糖合成酶偶联反应催化人参皂苷Rg3生成非天然人参皂苷Rd12的方法及应用。

背景技术

人参(Panax ginseng C.A.Mayer)为五加科人参属中重要的药用植物，主要分布于我国东北部的长白山地区以及日本、韩国、朝鲜等东亚国家；作为传统中药，其在中国已使用有几千年，《神农本草经》记载人参具有“主补五脏、安神、定魂魄、止惊悸、除邪气、名目、”等多种功效。因此，人参冠有“百草之王”的美誉。

人参皂苷是人参的主要活性成分，是由苷元与不同的糖基连接构成的糖苷类化合物。根据苷元的不同，可将人参皂苷分为原人参二醇型人参皂苷、原人参三醇型人参皂苷和齐墩果酸型人参皂苷三大类。原人参二醇型人参皂苷主要包括Rh2、CK、F2、Rg3、Rd等，其结构特点是糖基分别或者同时连接在原人参二醇骨架的C3-OH和C20-OH位置，而原人参二醇的C12-OH则没有糖基连接；C3-OH和C20-OH连接的糖基数目、种类以及糖基连接方式的不同对原人参二醇型人参皂苷结构以及药理活性多样性的形成至关重要。

糖基转移酶(UDP-glycosyltransferase，UGT，EC2.4.1.X)催化的糖基化反应是人参皂苷生物合成途径中最后一步修饰作用，通过糖基化作用可以生产许多不同结构以及药理活性的人参皂苷。与植物来源糖基转移酶相比，微生物来源的糖基转移酶具有催化活性高、底物谱广、区域选择性差等特点。因此，从微生物中挖掘新的具有独特催化活性和区域选择性的糖基转移酶并用于人参皂苷的糖基化修饰将有助于合成新的并且具有独特药理活性的人参皂苷。

体外糖基化反应具有催化效率高、底物耐受性好、产物纯化简单等特点，但是，体外糖基化反应需要使用价格昂贵的尿苷二磷酸葡萄糖(UDP-葡萄糖,UDPG)作为糖基供体。蔗糖合成酶(Sucrose synthase，SuSy，EC 2.4.1.13)可以高效催化廉价的蔗糖与尿苷二磷酸(UDP)反应生成尿苷二磷酸葡萄糖和果糖；另外，蔗糖合成酶和糖基转移酶还可用于双酶偶联反应，蔗糖合成酶合成的尿苷二磷酸葡萄糖可作为糖基转移酶催化糖基化反应的糖基供体；同时，糖基转移酶催化糖基化反应生成的尿苷二磷酸又可用作蔗糖合成酶合成尿苷二磷酸葡萄糖的原料。因此，在糖基转移酶和蔗糖合成酶双酶偶联反应体系中，只需加入少量的尿苷二磷酸和较高浓度的廉价蔗糖即可以实现昂贵的尿苷二磷酸葡萄糖的循环再生，从而可以以廉价的蔗糖为葡萄糖基供体，高效催化底物的糖基化修饰。

发明内容

本发明提供一种非天然人参皂苷Rd12及其制备方法和应用，通过所述方法，将糖基转移酶Bs-YjiC与蔗糖合成酶偶联，从而实现以廉价的蔗糖为葡萄糖糖基供体，以人参皂苷Rg3为糖基受体，高效催化人参皂苷Rg3的C12位羟基糖基化制备非天然人参皂苷Rd12的方法。

第一方面，本发明提供一种非天然人参皂苷Rd12(3-O-β-D-glucopyranosyl(1-2)-β-D-glucopyranosyl-12-O-β-D-glucopyranosyl-protopanaxadiol)，所述非天然人参皂苷Rd12具有式I所示结构：

本发明中，非天然人参皂苷Rd12是由人参皂苷Rg3底物的C12位羟基糖基化生成，其相比于其它人参皂苷，人参皂苷Rd12水溶性更好，稳定性更高、生物吸收性更好。

第二方面，本发明提供一种制备如第一方面所述的非天然人参皂苷Rd12的催化体系，所述催化体系包括人参皂苷Rg3、蔗糖、蔗糖合成酶、糖基转移酶和尿苷二磷酸。

本发明中，蔗糖合成酶和糖基转移酶可用于双酶偶联反应，蔗糖合成酶合成的UDP-葡萄糖可作为糖基转移酶催化糖基化反应的糖基供体；同时，糖基转移酶催化底物糖基化反应生成的副产物UDP又可用作蔗糖合成酶合成UDP-葡萄糖的原料。因此，在糖基转移酶/蔗糖合成酶双酶偶联反应中，只需加入少量的UDP和较高浓度的廉价蔗糖即可以实现UDP-葡萄糖的循环再生。

优选地，可用于本发明的糖基转移酶为糖基转移酶Bs-YjiC，所述糖基转移酶Bs-YjiC的编码基因来源于枯草芽孢杆菌和/或其突变体，所述糖基转移酶Bs-YjiC的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或与其具有85％同源性，优选95％同源性的氨基酸序列。

所述SEQ ID NO.1的氨基酸序列如下：

本发明中，与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列有至少85％同源性，优选95％同源性且具有糖基转移酶酶活性的由SEQ ID NO.1衍生的多肽，其中所述的衍生多肽还包括将所述的氨基酸序列添加了标签序列、信号序列或分泌信号序列后所形成的融合蛋白。

蔗糖合酶(sucrose synthase，SuSy，EC2.4.1.13)是植物中糖类代谢的关键酶，植物光合作用产生的糖通常以淀粉的形式储存，SuSy在这个过程中发挥关键作用。SuSy为可逆反应酶，既可以催化一分子UDP-葡萄糖和一分子果糖合成一分子蔗糖和一分子UDP，继而合成淀粉，又可以催化一分子蔗糖和UDP反应生成一分子UDP-葡萄糖和果糖。

可用于本发明的蔗糖合酶没有特别限制，可以为来源于各种植物或者微生物的、具有催化蔗糖与UDP原位合成UDP-葡萄糖功能的蔗糖合酶。通常，所述蔗糖合成酶来源于拟南芥、大豆、亚硝酸单胞菌或嗜酸性喜温硫杆菌中的任意一种或至少两种的组合，优选为拟南芥、大豆或嗜酸性喜温硫杆菌中的任意一种或至少两种的组合，所述蔗糖合成酶为蔗糖合成酶AtSuSy；

根据本发明，所述蔗糖合成酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2-6中的任意一种或与SEQ ID NO.2-6中的任意一种具有85％同源性，优选95％同源性的氨基酸序列；

所述SEQ ID NO.2(拟南芥)的氨基酸序列如下：MANAERMITRVHSQRERLNETLVSERNEVLALLSRVEAKGKGILQQNQIIAEFEALPEQTRKKLEGGPFFDLLKSTQEAIVLPPWVALAVRPRPGVWEYLRVNLHALVVEELQPAEFLHFKEELVDGVKNGNFTLELDFEPFNASIPRPTLHKYIGNGVDFLNRHLSAKLFHDKESLLPLLKFLRLHSHQGKNLMLSEKIQNLNTLQHTLRKAEEYLAELKSETLYEEFEAKFEEIGLERGWGDNAERVLDMIRLLLDLLEAPDPCTLETFLGRVPMVFNVVILSPHGYFAQDNVLGYPDTGGQVVYILDQVRALEIEMLQRIKQQGLNIKPRILILTRLLPDAVGTTCGERLERVYDSEYCDILRVPFRTEKGIVRKWISRFEVWPYLETYTEDAAVELSKELNGKPDLIIGNYSDGNLVASLLAHKLGVTQCTIAHALEKTKYPDSDIYWKKLDDKYHFSCQFTADIFAMNHTDFIITSTFQEIAGSKETVGQYESHTAFTLPGLYRVVHGIDVFDPKFNIVSPGADMSIYFPYTEEKRRLTKFHSEIEELLYSDVENKEHLCVLKDKKKPILFTMARLDRVKNLSGLVEWYGKNTRLRELANLVVVGGDRRKESKDNEEKAEMKKMYDLIEEYKLNGQFRWISSQMDRVRNGELYRYICDTKGAFVQPALYEAFGLTVVEAMTCGLPTFATCKGGPAEIIVHGKSGFHIDPYHGDQAADTLADFFTKCKEDPSHWDEISKGGLQRIEEKYTWQIYSQRLLTLTGVYGFWKHVSNLDRLEARRYLEMFYALKYRPLAQAVPLAQDD；

所述SEQ ID NO.3(拟南芥)的氨基酸序列如下：MPTGRFETMREWVYDAISAQRNELLSLFSRYVAQGKGILQSHQLIDEFLKTVKVDGTLEDLNKSPFMKVLQSAEEAIVLPPFVALAIRPRPGVREYVRVNVYELSVDHLTVSEYLRFKEELVNGHANGDYLLELDFEPFNATLPRPTRSSSIGNGVQFLNRHLSSIMFRNKESMEPLLEFLRTHKHDGRPMMLNDRIQNIPILQGALARAEEFLSKLPLATPYSEFEFELQGMGFERGWGDTAQKVSEMVHLLLDILQAPDPSVLETFLGRIPMVFNVVILSPHGYFGQANVLGLPDTGGQVVYILDQVRALENEMLLRIQKQGLEVIPKILIVTRLLPEAKGTTCNQRLERVSGTEHAHILRIPFRTEKGILRKWISRFDVWPYLETFAEDASNEISAELQGVPNLIIGNYSDGNLVASLLASKLGVIQCNIAHALEKTKYPESDIYWRNHEDKYHFSSQFTADLIAMNNADFIITSTYQEIAGSKNNVGQYESHTAFTMPGLYRVVHGIDVFDPKFNIVSPGADMTIYFPYSDKERRLTALHESIEELLFSAEQNDEHVGLLSDQSKPIIFSMARLDRVKNLTGLVECYAKNSKLRELANLVIVGGYIDENQSRDREEMAEIQKMHSLIEQYDLHGEFRWIAAQMNRARNGELYRYIADTKGVFVQPAFYEAFGLTVVESMTCALPTFATCHGGPAEIIENGVSGFHIDPYHPDQVAATLVSFFETCNTNPNHWVKISEGGLKRIYERYTWKKYSERLLTLAGVYAFWKHVSKLERRETRRYLEMFYSLKFRDLANSIPLATDEN；

所述SEQ ID NO.4(拟南芥)的氨基酸序列如下：MANPKLTRVLSTRDRVQDTLSAHRNELVALLSRYVDQGKGILQPHNLIDELESVIGDDETKKSLSDGPFGEILKSAMEAIVVPPFVALAVRPRPGVWEYVRVNVFELSVEQLTVSEYLRFKEELVDGPNSDPFCLELDFEPFNANVPRPSRSSSIGNGVQFLNRHLSSVMFRNKDCLEPLLDFLRVHKYKGHPLMLNDRIQSISRLQIQLSKAEDHISKLSQETPFSEFEYALQGMGFEKGWGDTAGRVLEMMHLLSDILQAPDPSSLEKFLGMVPMVFNVVILSPHGYFGQANVLGLPDTGGQVVYILDQVRALETEMLLRIKRQGLDISPSILIVTRLIPDAKGTTCNQRLERVSGTEHTHILRVPFRSEKGILRKWISRFDVWPYLENYAQDAASEIVGELQGVPDFIIGNYSDGNLVASLMAHRMGVTQCTIAHALEKTKYPDSDIYWKDFDNKYHFSCQFTADLIAMNNADFIITSTYQEIAGTKNTVGQYESHGAFTLPGLYRVVHGIDVFDPKFNIVSPGADMTIYFPYSEETRRLTALHGSIEEMLYSPDQTDEHVGTLSDRSKPILFSMARLDKVKNISGLVEMYSKNTKLRELVNLVVIAGNIDVNKSKDREEIVEIEKMHNLMKNYKLDGQFRWITAQTNRARNGELYRYIADTRGAFAQPAFYEAFGLTVVEAMTCGLPTFATCHGGPAEIIEHGLSGFHIDPYHPEQAGNIMADFFERCKEDPNHWKKVSDAGLQRIYERYTWKIYSERLMTLAGVYGFWKYVSKLERRETRRYLEMFYILKFRDLVKTVPSTADD；

所述SEQ ID NO.5(大豆)的氨基酸序列如下：MATDRLTRVHSLRERLDETLTANRNEILALLSRIEAKGKGILQHHQVIAEFEEIPEENRQKLTDGAFGEVLRSTQEAIVLPPWVALAVRPRPGVWEYLRVNVHALVVEELQPAEYLHFKEELVDGSSNGNFVLELDFEPFNAAFPRPTLNKSIGNGVQFLNRHLSAKLFHDKESLHPLLEFLRLHSVKGKTLMLNDRIQNPDALQHVLRKAEEYLGTVPPETPYSEFEHKFQEIGLERGWGDNAERVLESIQLLLDLLEAPDPCTLETFLGRIPMVFNVVILSPHGYFAQDNVLGYPDTGGQVVYILDQVRALENEMLHRIKQQGLDIVPRILIITRLLPDAVGTTCGQRLEKVFGTEHSHILRVPFRTEKGIVRKWISRFEVWPYLETYTEDVAHELAKELQGKPDLIVGNYSDGNIVASLLAHKLGVTQCTIAHALEKTKYPESDIYWKKLEERYHFSCQFTADLFAMNHTDFIITSTFQEIAGSKDTVGQYESHTAFTLPGLYRVVHGIDVFDPKFNIVSPGADQTIYFPHTETSRRLTSFHPEIEELLYSSVENEEHICVLKDRSKPIIFTMARLDRVKNITGLVEWYGKNAKLRELVNLVVVAGDRRKESKDLEEKAEMKKMYGLIETYKLNGQFRWISSQMNRVRNGELYRVICDTRGAFVQPAVYEAFGLTVVEAMTCGLPTFATCNGGPAEIIVHGKSGFHIDPYHGDRAADLLVDFFEKCKLDPTHWDKISKAGLQRIEEKYTWQIYSQRLLTLTGVYGFWKHVSNLDRRESRRYLEMFYALKYRKLAESVPLAAE；

所述SEQ ID NO.6(嗜酸性喜温硫杆菌)的氨基酸序列如下：MIEALRQQLLDDPRSWYAFLRHLVASQRDSWLYTDLQRACADFREQLPEGYAEGIGPLEDFVAHTQEVIFRDPWMVFAWRPRPGRWIYVRIHREQLALEELSTDAYLQAKEGIVGLGAEGEAVLTVDFRDFRPVSRRLRDESTIGDGLTHLNRRLAGRIFSDLAAGRSQILEFLSLHRLDGQNLMLSNGNTDFDSLRQTVQYLGTLPRETPWAEIREDMRRRGFAPGWGNTAGRVRETMRLLMDLLDSPSPAALESFLDRIPMISRILIVSIHGWFAQDKVLGRPDTGGQVVYILDQARALEREMRNRLRQQGVDVEPRILIATRLIPESDGTTCDQRLEPVVGAENVQILRVPFRYPDGRIHPHWISRFKIWPWLERYAQDLEREVLAELGSRPDLIIGNYSDGNLVATLLSERLGVTQCNIAHALEKSKYLYSDLHWRDHEQDHHFACQFTADLIAMNAADIIVTSTYQEIAGNDREIGQYEGHQDYTLPGLYRVENGIDVFDSKFNIVSPGADPRFYFSYARTEERPSFLEPEIESLLFGREPGADRRGVLEDRQKPLLLSMARMDRIKNLSGLAELYGRSSRLRGLANLVIIGGHVDVGNSRDAEEREEIRRMHEIMDHYQLDGQLRWVGALLDKTVAGELYRVVADGRGVFVQPALFEAFGLTVIEAMSSGLPVFATRFGGPLEIIEDGVSGFHIDPNDHEATAERLADFLEAARERPKYWLEISDAALARVAERYTWERYAERLMTIARIFGFWRFVLDRESQVMERYLQMFRHLQWRPLAHAVPME.

本发明中，所述蔗糖合成酶可以为一个或多个；

本发明中，所述糖基转移酶可以为一个或多个；

在本发明的催化体系中，糖基转移酶和蔗糖合酶的使用比例没有特殊限制，可根据所需要生成的产物的种类和量来进行决定，通常，可用于本发明制备非天然人参皂苷的糖基转移酶和蔗糖合酶的浓度如下：

根据本发明，所述糖基转移酶的浓度为10-1000mU/mL，例如可以是10mU/mL、20mU/mL、30mU/mL、40mU/mL、50mU/mL、60mU/mL、80mU/mL、100mU/mL、120mU/mL、150mU/mL、200mU/mL、250mU/mL、300mU/mL、350mU/mL、400mU/mL、450mU/mL、500mU/mL、550mU/mL、600mU/mL、650mU/mL、700mU/mL、750mU/mL、800mU/mL、850mU/mL、900mU/mL、950mU/mL或1000mU/mL，优选的为160mU/mL。

根据本发明，所述蔗糖合酶的浓度为10-1000mU/mL，例如可以是10mU/mL、20mU/mL、30mU/mL、40mU/mL、50mU/mL、60mU/mL、80mU/mL、100mU/mL、120mU/mL、150mU/mL、200mU/mL、250mU/mL、300mU/mL、350mU/mL、400mU/mL、450mU/mL、500mU/mL、550mU/mL、600mU/mL、650mU/mL、700mU/mL、750mU/mL、800mU/mL、850mU/mL、900mU/mL、950mU/mL或1000mU/mL，优选为200mU/mL。

第三方面，本发明提供一种载体，所述载体用于表达如第二方面所述的糖基转移酶和/或蔗糖合酶。

根据本发明，所述糖基转移酶为糖基转移酶Bs-YjiC。

根据本发明，所述蔗糖合成酶为蔗糖合成酶AtSuSy。

本发明中，所述糖基转移酶和蔗糖合酶可以表达在同一个载体上，也可以表达在不同的在载体上，在此不作特殊限定，本领域技术人员可以根据需要进行选择。

第四方面，本发明提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包括如第三方面所述的载体。

根据本发明，所述宿主细胞为大肠杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母、谷氨酸棒状杆菌、枯草芽孢杆菌或黑曲霉中的任意一种或至少两种的组合。

本发明中，所述糖基转移酶和蔗糖合成酶可以分别表达在不同的宿主细胞中，也可以同时在同一个宿主细胞中异源表达，在此不作特殊限定，本领域技术人员可以根据需要进行选择。

本发明中，具有活性的糖基转移酶、蔗糖合酶或其组合可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

第五方面，本发明提供一种如第二方面所述的催化体系或如第四方面所述的宿主细胞的用途，其特征在于，所述催化体系用于催化人参皂苷Rg3转化为非天然人参皂苷Rd12。

本发明中，所述人参皂苷Rg3可以通过从人参或者其它含有这些成分的植物中提取获得、人参总皂苷水解获得或是整合了人参皂苷合成途径的微生物工程菌合成获得中的任意一种方式或多种方式组合获得。

本发明中，所述催化体系中的糖基转移酶和蔗糖合成酶可以是第四方面所述的宿主细胞破碎获得的粗酶液或将粗酶液进一步经不同蛋白纯化方法获得的纯酶。

第六方面，本发明提供一种制备非天然人参皂苷Rd12的方法，在第二方面所述的催化体系或如第四方面所述的宿主细胞的存在下，将人参皂苷Rg3转化为非天然人参皂苷Rd12；

根据本发明，所述的方法包括如下反应：

所述反应包括在蔗糖合成酶AtSuSy的作用下，催化蔗糖与UDP反应生成UDP-葡萄糖和果糖；同时，糖基转移酶Bs-YjiC以生成的UDP-葡萄糖为糖基供体，催化人参皂苷Rg3的C12位羟基糖基化生成非天然人参皂苷Rd12和UDP。

第七方面，本发明提供一种抗肿瘤药物，所述药物包括如权利要求1所述的非天然人参皂苷Rd12；

本发明中，所述抗癌药物可以仅包含非天然人参皂苷Rd12，可以是非天然人参皂苷Rd12与人参皂苷Rg3的组合，可以是非天然人参皂苷Rd12与天然人参皂苷Rh2的组合，还可以是非天然人参皂苷Rd12与天然人参皂苷CK的组合，其中各组合物的质量比例在此不作特殊限定，本领域技术人员可以根据需要进行选择。

根据本发明，所述抗肿瘤药物还包括药学上可接受的载体。

根据本发明，所述肿瘤包括肝癌、肺癌、结肠癌或胃癌中的任意一种或至少两种的组合。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明以廉价的蔗糖为葡萄糖糖基供体，利用糖基转移酶和蔗糖合成酶作为偶联催化剂，以人参皂苷Rg3为糖基受体，高效催化人参皂苷Rg3的C12位羟基糖基化生产非天然人参皂苷Rd12，专一性好、转化效率高、产物纯化简单。

(2)本发明制备的非天然人参皂苷Rd12对肠癌、肝癌、肺癌和胃癌细胞的抑制作用均优于底物人参皂苷Rg3。

(3)本发明制备的含有非天然人参皂苷Rd12的药物在治疗肿瘤细胞方面具有巨大的潜力。

附图说明

图1为蔗糖合成酶AtSuSy和糖基转移酶Bs-YjiC的SDS-PAGE蛋白电泳结果图；

图2为非天然人参皂苷Rd12的反应过程机理图；

图3为本发明非天然人参皂苷Rd12的高效液相色谱-电喷雾电离质谱法联用仪鉴定结果，其中，(A)为高效液相结果图，(B)为质谱结果图。

图4为分批补料催化人参皂苷Rg3合成非天然人参皂苷Rd12的结果图。

具体实施方式

为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

本发明中酶活性测定方法及酶活性单位定义如下：

蔗糖合成酶酶活性测定：在200μL反应体系中含有蔗糖合成酶(10μg)，UDP(0.5mM)，蔗糖(300mM),Tris-HCl缓冲液(50mM，pH 7.5)，30℃水浴反应0.5h，快速煮沸终止反应，进行HPLC检测果糖的生成。蔗糖合成酶酶活性定义为，每微克蔗糖合成酶每分钟催化蔗糖水解所生成的果糖的微摩尔含量。

糖基转移酶酶活性测定：在200μL反应体系中含有人参皂苷Rg3(1mM)，尿苷二磷酸葡萄糖(5mM),Tris-HCl缓冲液(50mM，pH 7.5)，10μg糖基转移酶Bs-YjiC，35℃水浴反应0.5h，加入200μL甲醇终止反应，进行高效液相色谱检测人参皂苷Rg3的消耗量。糖基转移酶酶活性定义为，每微克糖基转移酶每分钟所消耗的人参皂苷Rg3的微摩尔含量。

实施例1糖基转移酶以及蔗糖合成酶的克隆、表达与纯化

本发明专利中的糖基转移酶Bs-YjiC筛选自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis168)，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其核酸序列(SEQ ID NO.7)如下：ATGAAAAAGTACCATATTTCGATGATCAATATCCCGGCGTACGGACATGTCAATCCTACGCTTGCTTTAGTAGAGAAGCTTTGTGAGAAAGGGCACCGTGTCACGTACGCGACGACTGAGGAGTTTGCGCCCGCTGTTCAGCAAGCCGGTGGAGAAGCATTGATCTATCATACATCCTTGAATATTGATCCTAAGCAAATCAGGGAGATGATGGAAAAGAATGACGCGCCCCTCAGCCTTTTGAAAGAATCACTCAGCATTCTGCCGCAGCTTGAGGAGTTATATAAGGATGATCAGCCTGATCTGATCATCTATGACTTTGTTGCGCTGGCTGGTAAATTGTTTGCTGAAAAGCTTAATGTTCCGGTCATTAAGCTCTGTTCGTCATATGCCCAAAATGAATCCTTTCAGTTAGGAAATGAAGACATGCTGAAAAAAATAAGAGAAGCAGAGGCTGAATTTAAAGCCTACTTGGAGCAAGAGAAGTTGCCGGCTGTTTCATTTGAACAGTTAGCTGTGCCGGAAGCATTAAATATTGTCTTTATGCCGAAGTCTTTTCAGATTCAGCATGAGACGTTCGATGACCGTTTCTGTTTTGTCGGCCCCTCTCTCGGAGAACGGAAGGAAAAAGAAAGCCTGTTGATTGACAAGGATGATCGCCCGCTTATGCTGATTTCTTTGGGTACGGCGTTTAACGCATGGCCGGAATTTTACAAGATGTGCATCAAGGCATTTCGGGATTCTTCATGGCAAGTGATCATGTCGGTTGGGAAAACGATTGATCCAGAAAGCTTGGAGGATATTCCTGCTAACTTTACCATTCGCCAAAGTGTGCCGCAGCTTGAGGTGTTAGAGAAAGCTGATTTGTTCATCTCTCATGGCGGGATGAACAGTACGATGGAAGCGATGAACGCAGGTGTGCCGCTTGTCGTCATTCCGCAAATGTATGAGCAGGAGCTCACTGCAAATCGGGTTGATGAATTAGGCCTTGGCGTTTATTTGCCGAAAGAGGAAGTGACTGTTTCCAGCCTGCAGGAAGCGGTTCAGGCTGTATCCAGTGATCAAGAGCTGCTCAGCCGCGTCAAGAATATGCAAAAGGATGTAAAAGAAGCTGGCGGAGCGGAGCGTGCGGCAGCTGAGATTGAAGCGTTTATGAAAAAATCCGCTGTCCCGCAGTAA.

本发明专利中蔗糖合成酶来自拟南芥，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，其核酸序列(SEQ ID NO.8)如下：

ATGGCAAACGCTGAACGTATGATAACGCGCGTCCACAGCCAACGTGAGCGTTTGAACGAAACGCTTGTTTCTGAGAGAAACGAAGTCCTTGCCTTGCTTTCCAGGGTTGAAGCCAAAGGTAAAGGTATTTTACAACAAAACCAGATCATTGCTGAATTCGAAGCTTTGCCTGAACAAACCCGGAAGAAACTTGAAGGTGGTCCTTTCTTTGACCTTCTCAAATCCACTCAGGAAGCAATTGTGTTGCCACCATGGGTTGCTCTAGCTGTGAGGCCAAGGCCTGGTGTTTGGGAATACTTACGAGTCAATCTCCATGCTCTTGTCGTTGAAGAACTCCAACCTGCTGAGTTTCTTCATTTCAAGGAAGAACTCGTTGATGGAGTTAAGAATGGTAATTTCACTCTTGAGCTTGATTTCGAGCCATTCAATGCGTCTATCCCTCGTCCAACACTCCACAAATACATTGGAAATGGTGTTGACTTCCTTAACCGTCATTTATCGGCTAAGCTCTTCCATGACAAGGAGAGTTTGCTTCCATTGCTTAAGTTCCTTCGTCTTCACAGCCACCAGGGCAAGAACCTGATGTTGAGCGAGAAGATTCAGAACCTCAACACTCTGCAACACACCTTGAGGAAAGCAGAAGAGTATCTAGCAGAGCTTAAGTCCGAAACACTGTATGAAGAGTTTGAGGCCAAGTTTGAGGAGATTGGTCTTGAGAGGGGATGGGGAGACAATGCAGAGCGTGTCCTTGACATGATACGTCTTCTTTTGGACCTTCTTGAGGCGCCTGATCCTTGCACTCTTGAGACTTTTCTTGGAAGAGTACCAATGGTGTTCAACGTTGTGATCCTCTCTCCACATGGTTACTTTGCTCAGGACAATGTTCTTGGTTACCCTGACACTGGTGGACAGGTTGTTTACATTCTTGATCAAGTTCGTGCTCTGGAGATAGAGATGCTTCAACGTATTAAGCAACAAGGACTCAACATTAAACCAAGGATTCTCATTCTAACTCGACTTCTACCTGATGCGGTAGGAACTACATGCGGTGAACGTCTCGAGAGAGTTTATGATTCTGAGTACTGTGATATTCTTCGTGTGCCCTTCAGAACAGAGAAGGGTATTGTTCGCAAATGGATCTCAAGGTTCGAAGTCTGGCCATATCTAGAGACTTACACCGAGGATGCTGCGGTTGAGCTATCGAAAGAATTGAATGGCAAGCCTGACCTTATCATTGGTAACTACAGTGATGGAAATCTTGTTGCTTCTTTATTGGCTCACAAACTTGGTGTCACTCAGTGTACCATTGCTCATGCTCTTGAGAAAACAAAGTACCCGGATTCTGATATCTACTGGAAGAAGCTTGACGACAAGTACCATTTCTCATGCCAGTTCACTGCGGATATTTTCGCAATGAACCACACTGATTTCATCATCACTAGTACTTTCCAAGAAATTGCTGGAAGCAAAGAAACTGTTGGGCAGTATGAAAGCCACACAGCCTTTACTCTTCCCGGATTGTATCGAGTTGTTCACGGGATTGATGTGTTTGATCCCAAGTTCAACATTGTCTCTCCTGGTGCTGATATGAGCATCTACTTCCCTTACACAGAGGAGAAGCGTAGATTGACTAAGTTCCACTCTGAGATCGAGGAGCTCCTCTACAGCGATGTTGAGAACAAAGAGCACTTATGTGTGCTCAAGGACAAGAAGAAGCCGATTCTCTTCACAATGGCTAGGCTTGATCGTGTCAAGAACTTGTCAGGTCTTGTTGAGTGGTACGGGAAGAACACCCGCTTGCGTGAGCTAGCTAACTTGGTTGTTGTTGGAGGAGACAGGAGGAAAGAGTCAAAGGACAATGAAGAGAAAGCAGAGATGAAGAAAATGTATGATCTCATTGAGGAATACAAGCTAAACGGTCAGTTCAGGTGGATCTCCTCTCAGATGGACCGGGTAAGGAACGGTGAGCTGTACCGGTACATCTGTGACACCAAGGGTGCTTTTGTCCAACCTGCATTATATGAAGCCTTTGGGTTAACTGTTGTGGAGGCTATGACTTGTGGTTTACCGACTTTCGCCACTTGCAAAGGTGGTCCAGCTGAGATCATTGTGCACGGTAAATCGGGTTTCCACATTGACCCTTACCATGGTGATCAGGCTGCTGATACTCTTGCTGATTTCTTCACCAAGTGTAAGGAGGATCCATCTCACTGGGATGAGATCTCAAAAGGAGGGCTTCAGAGGATTGAGGAGAAATACACTTGGCAAATCTATTCACAGAGGCTCTTGACATTGACTGGTGTGTATGGATTCTGGAAGCATGTCTCGAACCTTGACCGTCTTGAGGCTCGCCGTTACCTTGAAATGTTCTATGCATTGAAGTATCGCCCATTGGCTCAGGCTGTTCCTCTTGCACAAGATGATTGA.

具体的制备方法如下：

(1)以枯草芽孢杆菌的基因组DNA和拟南芥的cDNA为模版，进行PCR扩增。引物序列如下：

注：GGATCC：BamHⅠ酶切位点；GTCGAC:SalⅠ酶切位点；GTCGAC：NdeⅠ酶切位点；GCGGCCGC：Not I酶切位点。

(2)将两个基因分别插入到经相同的限制性内切酶处理的pET32载体中，构建重组载体pET32-Bs-YjiC和pET32-AtSuSy，取1μL重组质粒pET32-Bs-YjiC，pET32-AtSuSy以及空质粒pET32，分别与100μL大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞混匀并进行转化，转化条件为：冰浴30min，42℃水浴热激90s，冰浴1-2min；

(3)将全部转化的菌液涂布于含有100μg/L氨苄青霉素或卡那霉素的LB固体平板上，37℃过夜培养14-16h；

(4)将验证正确的重组质粒转入E.coli BL21(DE3)宿主细胞，诱导目的蛋白的表达；诱导条件为：在含有100μg/L氨苄青霉素或卡那霉素的LB培养基中(10g/L NaCl，10g/L蛋白胨和5g/L酵母粉)，37℃培养3～4h至菌体OD600为0.6～0.8，加入IPTG至终浓度为0.3mM以诱导目的蛋白的表达，诱导蛋白的培养条件为16℃、200r/min培养16-20h。同时，以转入pET32的E.coliBL21在相同条件下培养作为对照；

(5)培养完成后，6000r/min离心5min收集菌体，将菌体用25mmol/LTris-HCl，pH7.0缓冲液悬浮后，超声破碎，通过SDS-PAGE蛋白电泳分析目的蛋白Bs-YjiC和AtSuSy的表达情况，结果如图1所示。

如图1SDS-PAGE蛋白胶所示，与表达了空质粒的重组菌株相比，重组糖基转移酶Bs-YjiC和蔗糖合成酶均在破碎液上清中可溶性表达，其中，糖基转移酶Bs-YjiC的大小约为62kDa，而蔗糖合成酶的大小约为110kDa。进一步通过镍柱亲核层析可纯化获得纯度超过95％的糖基转移酶Bs-YjiC和蔗糖合成酶AtSuSy。

实施例2糖基转移酶Bs-YjiC和蔗糖合成酶AtSuSy偶联催化人参皂苷Rg3合成非天然人参皂苷Rd12

以人参皂苷Rg3(3-O-[β-D-glucopyranosyl(1-2)-β-D-glucopyranosyl]-20(S)-protopanaxadiol)为底物，以廉价的蔗糖作为糖基供体，通过糖基转移酶-蔗糖合成酶双酶偶联反应，可催化人参皂苷Rg3的C12-OH糖基化生成非天然人参皂苷Rd12(3-O-[β-D-glucopyranosyl(1-2)-β-D-glucopyranosyl]-12-β-D-glucopyranosyl-protopanaxadiol)，具体的反应如图2所示，具体如下：

该酶反应体系包括：2mM Rg3，0.5mM UDP，300mM蔗糖，160U/mL糖基转移酶Bs-YjiC和200U/mL蔗糖合成酶AtSuSy，35℃，反应0.5h。

通过高效液相色谱电喷雾电离质谱法联用仪(HPLC-ESI-MS)对酶反应产物进行鉴定，结果如图3所示。

从图3可以看出，图(A)中未添加蔗糖作为糖基供体的空白对照反应检测出新产物的生成，而添加了蔗糖作为糖基供体的糖基转移酶Bs-YjiC和蔗糖合成酶AtSuSy偶联反应可以催化人参皂苷Rg3生成单一的非天然人参皂苷Rd12产物。同时，从图(B)质谱结果显示该产物的分子量分为[M+H]+m/z+～947.5689]+和[M+H-H2O]+m/z+～929.5474，从而进一步确定了该产物为人参皂苷Rd12。

实施例3分批补料合成非天然人参皂苷Rd12

为了避免避免一次性加入过多的人参皂苷Rg3对糖基转移酶活性的抑制，同时鉴于糖基转移酶Bs-YjiC和蔗糖合成酶AtSuSy偶联反应在0.5h内即可将2mM人参皂苷Rg3糖基化生成非天然人参皂苷Rd12。因此，进一步通过分批补料，即在时间点1h、2h、4h和8h分别补充2mM人参皂苷Rg3，以合成更高浓度的非天然人参皂苷Rd12。

从图4可以看出，经过4批次的补充人参皂苷Rg3底物，反应18h，最终可以获得9.8mM人参皂苷Rd12(9.3g/L)，人参皂苷Rg3的转化率达到98％，且人参皂苷Rd12的合成速率达到0.5g/L/h。

实施例4人参皂苷Rd12的抗癌活性

取对数期生长的肿瘤细胞，包括结肠癌细胞Lovo、肝癌细胞HepG2，肺癌细胞DMS53以及胃癌细胞SNU719。首先，将指数生长期的癌症细胞制成细胞悬浮液并以每孔100μL接种于96孔板中预培养48h直至细胞密度为1.0×104每孔。待细胞贴壁生长后，分别加入100μL不同浓度的非天然人参皂苷Rd12和人参皂苷Rg3，以人参皂苷Rg3作为对照实验。孵育48h后，向每孔板中加入15μL MTT溶液致终浓度为5mg/mL，继续孵育肿瘤细胞4h，终止培养并吸去培养液。然后，每孔中加入150μL的二甲基亚砜，充分震荡使晶体溶解。然后利用酶标仪在570nm处测各孔的光密度值，通过OD570值计算人参皂苷对不同癌症细胞的抑制率。

表1不同人参皂苷对癌细胞的抑制活性分析(μg/mL)

半抑制浓度(IC50)是评价药物活性的重要参数，IC50数值越高，说明该化合物的活性越低，而IC50数值越低，说明该化合物的活性越高。稀有人参皂苷Rg3是人参中重要的抗癌物质，如表1所示，人参皂苷Rg3对肠癌细胞Lovo和肺癌细胞DMS53的半抑制浓度(IC50)超过300μg/mL，对肝癌细胞HepG2和胃癌细胞SNU719的半抑制浓度(IC50)分别为286μg/mL和281μg/mL；而非天然人参皂苷Rd12对肠癌细胞Lovo、肝癌细胞HepG2、肺癌细胞DMS53和胃癌细胞SNU719的半抑制浓度(IC50)分别为198μg/mL、160μg/mL、26μg/mL和112μg/mL。说明非天然人参皂苷Rd12对这几种癌症均具有显著的抑制活性，同时也说明人参皂苷Rg3的C12位羟基糖基化后，所生成的非天然人参皂苷Rd12对胃癌细胞、肠癌、肝癌以及肺癌的抑制作用较参皂苷Rg3均有显著提升。因此，与人参皂苷Rg3相比，含有非天然人参皂苷Rd12的药物在治疗肿瘤细胞方面具有更大的应用潜力。

注意，上述仅为本发明的较佳实施例及所运用技术原理。本领域技术人员会理解，本发明不限于这里所述的特定实施例，对本领域技术人员来说能够进行各种明显的变化、重新调整和替代而不会脱离本发明的保护范围。因此，虽然通过以上实施例对本发明进行了较为详细的说明，但是本发明不仅仅限于以上实施例，在不脱离本发明构思的情况下，还可以包括更多其他等效实施例，而本发明的范围由所附的权利要求范围决定。

序列表

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所

<120> 一种非天然人参皂苷Rd12及其制备方法和应用

<130> PYS201711773EC

<141> 2017-11-17

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 392

<212> PRT

<213> 人工合成序列()

<400> 1

Met Lys Lys Tyr His Ile Ser Met Ile Asn Ile Pro Ala Tyr Gly His

1 5 1015

Val Asn Pro Thr Leu Ala Leu Val Glu Lys Leu Cys Glu Lys Gly His

202530

Arg Val Thr Tyr Ala Thr Thr Glu Glu Phe Ala Pro Ala Val Gln Gln

354045

Ala Gly Gly Glu Ala Leu Ile Tyr His Thr Ser Leu Asn Ile Asp Pro

505560

Lys Gln Ile Arg Glu Met Met Glu Lys Asn Asp Ala Pro Leu Ser Leu

65707580

Leu Lys Glu Ser Leu Ser Ile Leu Pro Gln Leu Glu Glu Leu Tyr Lys

859095

Asp Asp Gln Pro Asp Leu Ile Ile Tyr Asp Phe Val Ala Leu Ala Gly

100 105 110

Lys Leu Phe Ala Glu Lys Leu Asn Val Pro Val Ile Lys Leu Cys Ser

115 120 125

Ser Tyr Ala Gln Asn Glu Ser Phe Gln Leu Gly Asn Glu Asp Met Leu

130 135 140

Lys Lys Ile Arg Glu Ala Glu Ala Glu Phe Lys Ala Tyr Leu Glu Gln

145 150 155 160

Glu Lys Leu Pro Ala Val Ser Phe Glu Gln Leu Ala Val Pro Glu Ala

165 170 175

Leu Asn Ile Val Phe Met Pro Lys Ser Phe Gln Ile Gln His Glu Thr

180 185 190

Phe Asp Asp Arg Phe Cys Phe Val Gly Pro Ser Leu Gly Glu Arg Lys

195 200 205

Glu Lys Glu Ser Leu Leu Ile Asp Lys Asp Asp Arg Pro Leu Met Leu

210 215 220

Ile Ser Leu Gly Thr Ala Phe Asn Ala Trp Pro Glu Phe Tyr Lys Met

225 230 235 240

Cys Ile Lys Ala Phe Arg Asp Ser Ser Trp Gln Val Ile Met Ser Val

245 250 255

Gly Lys Thr Ile Asp Pro Glu Ser Leu Glu Asp Ile Pro Ala Asn Phe

260 265 270

Thr Ile Arg Gln Ser Val Pro Gln Leu Glu Val Leu Glu Lys Ala Asp

275 280 285

Leu Phe Ile Ser His Gly Gly Met Asn Ser Thr Met Glu Ala Met Asn

290 295 300

Ala Gly Val Pro Leu Val Val Ile Pro Gln Met Tyr Glu Gln Glu Leu

305 310 315 320

Thr Ala Asn Arg Val Asp Glu Leu Gly Leu Gly Val Tyr Leu Pro Lys

325 330 335

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Ser Asp Gln Glu Leu Leu Ser Arg Val Lys Asn Met Gln Lys Asp Val

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<210> 2

<211> 808

<212> PRT

<213> 人工合成序列()

<400> 2

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Arg Leu Asn Glu Thr Leu Val Ser Glu Arg Asn Glu Val Leu Ala Leu

202530

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Val Leu Pro Pro Trp Val Ala Leu Ala Val Arg Pro Arg Pro Gly Val

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Lys Asn Gly Asn Phe Thr Leu Glu Leu Asp Phe Glu Pro Phe Asn Ala

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Ser Ile Pro Arg Pro Thr Leu His Lys Tyr Ile Gly Asn Gly Val Asp

145 150 155 160

Phe Leu Asn Arg His Leu Ser Ala Lys Leu Phe His Asp Lys Glu Ser

165 170 175

Leu Leu Pro Leu Leu Lys Phe Leu Arg Leu His Ser His Gln Gly Lys

180 185 190

Asn Leu Met Leu Ser Glu Lys Ile Gln Asn Leu Asn Thr Leu Gln His

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<210> 3

<211> 807

<212> PRT

<213> 人工合成序列()

<400> 3

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1 5 1015

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Leu Lys Thr Val Lys Val Asp Gly Thr Leu Glu Asp Leu Asn Lys Ser

505560

Pro Phe Met Lys Val Leu Gln Ser Ala Glu

一种非天然人参皂苷Rd12及其制备方法和应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。