专利摘要

本发明公开了一种对映选择性提高的菜豆环氧化物水解酶突变体，属于基因工程和蛋白质表达领域。本发明的突变体是在SEQIDNO.2所示的氨基酸的基础上，将第102位的色氨酸突变成了亮氨酸。本发明的突变酶PvEH1W102L的对映体比率(E值)是14.95，是野生型酶(E＝7.36)的2.03倍。

权利要求

1.一种菜豆环氧化物水解酶突变体，其特征在于，所述环氧化物水解酶突变体是：

(a)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白质；

(b)在严格条件下与(a)限定的氨基酸序列杂交且编码具有环氧化物水解酶活性的氨基酸序列。

2.一种编码环氧化物水解酶突变体的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列是SEQ ID NO.3所示的序列。

3.一种获得权利要求1所述环氧化物水解酶突变体的方法，其特征在于，是在如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列基础上，将第102位的色氨酸突变成了亮氨酸。

4.含有编码权利要求1所述突变体的基因的载体。

5.表达权利要求1所述突变体的基因工程菌。

6.根据权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是以大肠杆菌、芽孢杆菌或者酵母菌为宿主构建得到的。

7.权利要求1所述突变体、编码权利要求1所述突变体的核苷酸片段、含有编码权利要求1所述突变体的基因的载体、表达权利要求1所述突变体的基因工程菌的应用。

8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述应用是指在医药、农药、铁电液晶、香料、精细化学品工业中的应用。

9.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述应用是指在手性生物催化中的应用。

10.根据权利要求9所述应用，其特征在于，所述应用是以权利要求1所述突变体或表达权利要求1所述突变体的基因工程菌为催化剂，在磷酸盐缓冲液中催化外消旋邻甲基苯基缩水甘油醚。

说明书

技术领域

本发明涉及一种对映选择性提高的菜豆环氧化物水解酶突变体，属于基因工程和蛋白质表达领域。

背景技术

环氧化物水解酶(epoxide hydrolases,EHs,EC 3.3.2.-)能够催化外消旋环氧化物的水解动力学拆分或对映归一性水解，保留单一构型环氧化物或转化为手性邻二醇，是用于手性中间体制备的极具价值的生物催化剂作为生物催化剂。传统的化学法拆分环氧化物往往需要重金属类有毒物质作为催化剂，不仅面临着环境的巨大挑战，且很难获得高产率的手性纯化合物。EHs具有反应时不需要金属离子和辅酶、来源广泛、对映选择性高等优点。EHs是一类催化水分子立体选择性的加成环氧化物水解为相应1,2-二醇的水解酶类，是一种典型α/β折叠型水解酶。然而，不同来源的EHs的性质均存在很大的差异，自然界筛选到的具有EHs活性的微生物往往存在酶活低、对映选择性较低及稳定性差等缺陷，往往不能满足工业化应用的需求。近年来，分子生物学技术，如定点突变、饱和突变、错易PCR和DNA shuffling等也用于改造EHs的催化活性、稳定性、对映选择性等性质，并且通过高通量筛选获得优良突变酶。

从菜豆(Phaseolus vulgaris)克隆了一种环氧化物水解酶(PvEH1)，并实现其在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中异源表达。但该重组酶对环氧化物的对映选择性并不高，从而限制了其在高附加值药物前体的手性合成中的应用潜力。通过同源建模分析该酶的蛋白质结构，并通过定点突变技术对PvEH1进行分子改造，提高其对映选择性，具有较强的工业化应用价值。

发明内容

本发明要解决的第一个问题是提供一种催化活性提高的环氧化物水解酶(PvEH1)突变体。

所述突变体是：

(a)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白质；

(b)在严格条件下与(a)限定的氨基酸序列杂交且编码具有环氧化物水解酶活性的氨基酸序列。

在本发明的一种实施方式中，编码所述突变体的基因的核苷酸序列是SEQ ID NO.3所示的序列。

本发明还提供获得所述突变体的方法，是在如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列基础上，将第102位的色氨酸突变成了亮氨酸(W102L)。

在本发明的一种实施方式中，以携带编码环氧化物水解酶的基因pveh1的重组质粒为模板，设计并合成引物，通过PCR进行定点突变，得到携带编码突变体的基因的重组质粒，转化表达宿主；培养宿主使之产环氧化物水解酶突变体。

本发明还提供一种表达所述环氧化物水解酶突变体的基因工程菌，所述基因工程菌的构建方法包括以下步骤：以携带编码环氧化物水解酶的基因pveh1的重组质粒为模板，设计并合成引物，通过PCR进行定点突变，得到携带编码突变体的基因的重组质粒，转化表达宿主。

在本发明的一种实施方式中，所述携带编码环氧化物水解酶的基因pveh1的重组质粒为pET28a(+)-pveh1，表达宿主为E.coli BL21(DE3)。

本发明还提供一种应用所述环氧化物水解酶突变体水解邻甲基苯基缩水甘油醚的方法，是以所述突变体或表达所述突变体的基因工程菌为催化剂，在磷酸盐缓冲液(Na₂HPO₄-NaH₂PO₄,pH 7.0)中催化外消旋邻甲基苯基缩水甘油醚(底物浓度为10mM)。

本发明的突变体命名方式：

采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示突变体。如W102L，表示位置102的氨基酸由亲本环氧化物水解酶的色氨酸Trp替换成亮氨酸Leu，位置的编号对应于亲本环氧化物水解酶的氨基酸序列的相应位点。

本发明的有益效果：本发明的突变体是在SEQ ID NO.2所示的氨基酸的基础上，将第102位的色氨酸突变成了亮氨酸。本发明摇瓶诱导10h得到的突变酶PvEH1^W102L的对映体比率(E值)是14.95，是野生型酶(E＝7.36)的2.03倍。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明，其目的仅在于更好理解本发明的内容而非限制本发明的保护范围。

实施例1：突变酶基因及其表达质粒的构建

一、质粒pET-28a(+)-pveh1的获得

重组E.coli BL21(DE3)/pET-28a(+)-pveh1的培养基组成为：蛋白胨1％，酵母膏0.5％，NaCl 1％。

将重组菌接种于培养基装液量为5mL试管中于37℃、215rpm振荡培养12h。培养结束后，将菌体于12,000rpm下离心1min并收集细胞，利用质粒提取试剂盒Pure PlasmidMini Kit(康为世纪生物科技有限公司)提取质粒pET-28a(+)-pveh1；其中质粒pET-28a(+)-pveh1中的环氧化物水解酶PvEH1的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示(核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)。

二、重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET-28a(+)-pveh1(W102L)的构建

设计并合成特异性定点突变引物如下：

W102L-F

W102L-R

以W102L-F、W102L-R(SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6)为上下游引物，以pET28a(+)-pveh1为模板，利用QuickChange^TM试剂盒进行PCR，PCR条件如下：预变性95℃，4min；变性98℃，10s；退火55℃，15s；延伸72℃，8min；从变性到延伸循环30次，最后充分延伸72℃，10min。体系为25μL，以野生型pveh1的质粒为模板。

PCR完成后，加入0.5μL Dpn I及1μL 10×T Buffer，25℃过夜消化。转化参照生工超级感受态细胞制备试剂盒使用说明书。将获得的突变酶表达载体由上海睿迪生物有限公司测序确认碱基序列。

实施例2：突变酶PvEH1^W102L的获取

将E.coli BL21-pveh1^W102L单菌落接种于2mL含100μg/mL卡那霉素的LB培养基中，于37℃、215r/min培养过夜；取1mL培养液转接于50mL相同的培养基中，培养至OD₆₀₀为0.6-0.8时，添加IPTG(终浓度0.5mmol/L)，20℃诱导10h。收集菌体，每g湿菌体用10mL磷酸钠缓冲液(Na₂HPO₄-NaH₂PO₄，100mmol/L，pH 7.0)悬浮得到菌悬液。

实施例3：突变酶PvEH1^W102L对映选择性的测定

在2mL EP管中加入40μL菌悬液和910μL磷酸盐缓冲液，25℃保温5min，再加入50μL外消旋邻甲基苯基缩水甘油醚(rac-o-GMPE，终浓度10mmol/L)立即记时反应，定时取反应液100μL加入1mL乙酸乙酯终止反应。微孔过滤后，样品分析采用正相HPLC、OD-H柱和紫外检测仪。流动相为正己烷/异丙醇(80:20，v/v)，流速为0.8mL/min，检测波长为220nm，(R)-o-GMPE和(S)-o-GMPE的出峰时间分别为6.52min和8.02min。底物e.e._s＝[(S-R)/(R+S)]×100％；E＝ln[(1-c)×(1-e.e._s)]/ln[(1-c)×(1+e.e._s)]。其中：R和S表示(R)-和(S)-o-GMPE浓度，c表示rac-o-GMPE转化率。野生型酶可以保留(R)-o-GMPE底物得到24.18％的产率(其中e.e._s为98.56％)，而突变酶PvEH1^W102L可以保留(R)-o-GMPE底物得到35.09％的产率(其中e.e._s为97.84％)。突变酶PvEH1^W102L的对映体比率(E值)是14.95，是野生型酶(E＝7.36)的2.03倍。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一种对映选择性提高的菜豆环氧化物水解酶突变体

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 320

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Glu Gly Val Glu His Arg Thr Val Glu Val Asn Gly Ile Lys Met

1 5 1015

His Val Ala Glu Lys Gly Glu Gly Pro Val Val Leu Phe Leu His Gly

202530

Phe Pro Glu Leu Trp Tyr Ser Trp Arg His Gln Ile Leu Ala Leu Ser

354045

Ala Leu Gly Tyr Arg Ala Val Ala Pro Asp Leu Arg Gly Tyr Gly Asp

505560

Thr Asp Ala Pro Ala Ser Val Ser Ser Tyr Thr Ile Leu His Leu Val

65707580

Ala Asp Val Val Ala Leu Ile Asp Ser Leu Gly Val Asp Gln Val Phe

859095

Leu Val Ala His Asp Leu Gly Ala Leu Val Gly Trp Tyr Thr Cys Leu

100 105 110

Phe Arg Pro Asp Arg Ile Lys Ala Tyr Val Cys Leu Ser Val Pro Phe

115 120 125

Met Pro Arg Asn Pro Lys Val Lys Pro Val Asp Ala Met Arg Ala Leu

130 135 140

Tyr Gly Asp Asp Tyr Tyr Ile Cys Arg Phe Gln Glu Pro Gly Lys Met

145 150 155 160

Glu Thr Leu Tyr Asp Asn Asn Ile Glu Glu Ala Ile Lys Asn Met Leu

165 170 175

Thr Ser Arg Arg Pro Gly Pro Pro Ile Leu Pro Lys Glu Gly Ala Gly

180 185 190

Ser Asn Pro Leu Ala Ser Gly Ser Leu Pro Ser Arg Pro Leu Pro Ser

195 200 205

Trp Leu Ser Gln Glu Asp Leu Thr Tyr Tyr Ala Ser Lys Phe Gly Lys

210 215 220

Thr Gly Leu Thr Gly Gly Leu Asn Tyr Tyr Arg Asn Leu Asn Leu Asn

225 230 235 240

Trp Glu Leu Thr Ala Ala Trp Thr Gly Val Gln Val Lys Val Pro Val

245 250 255

Lys Phe Ile Thr Gly Asp Leu Asp Ile Val His Thr Ser Leu Gly Thr

260 265 270

Lys Asp Tyr Ile Glu Ser Gly Ala Phe Lys Arg Asp Val Pro Phe Leu

275 280 285

Glu Glu Val Val Val Gln Glu Gly Val Ala His Phe Asn Asn Gln Glu

290 295 300

Ala Ala Glu Asp Val Ser Asn His Ile Tyr Asp Phe Ile Asn Lys Phe

305 310 315 320

<210> 2

<211> 320

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Glu Gly Val Glu His Arg Thr Val Glu Val Asn Gly Ile Lys Met

1 5 1015

His Val Ala Glu Lys Gly Glu Gly Pro Val Val Leu Phe Leu His Gly

202530

Phe Pro Glu Leu Trp Tyr Ser Trp Arg His Gln Ile Leu Ala Leu Ser

354045

Ala Leu Gly Tyr Arg Ala Val Ala Pro Asp Leu Arg Gly Tyr Gly Asp

505560

Thr Asp Ala Pro Ala Ser Val Ser Ser Tyr Thr Ile Leu His Leu Val

65707580

Ala Asp Val Val Ala Leu Ile Asp Ser Leu Gly Val Asp Gln Val Phe

859095

Leu Val Ala His Asp Trp Gly Ala Leu Val Gly Trp Tyr Thr Cys Leu

100 105 110

Phe Arg Pro Asp Arg Ile Lys Ala Tyr Val Cys Leu Ser Val Pro Phe

115 120 125

Met Pro Arg Asn Pro Lys Val Lys Pro Val Asp Ala Met Arg Ala Leu

130 135 140

Tyr Gly Asp Asp Tyr Tyr Ile Cys Arg Phe Gln Glu Pro Gly Lys Met

145 150 155 160

Glu Thr Leu Tyr Asp Asn Asn Ile Glu Glu Ala Ile Lys Asn Met Leu

165 170 175

Thr Ser Arg Arg Pro Gly Pro Pro Ile Leu Pro Lys Glu Gly Ala Gly

180 185 190

Ser Asn Pro Leu Ala Ser Gly Ser Leu Pro Ser Arg Pro Leu Pro Ser

195 200 205

Trp Leu Ser Gln Glu Asp Leu Thr Tyr Tyr Ala Ser Lys Phe Gly Lys

210 215 220

Thr Gly Leu Thr Gly Gly Leu Asn Tyr Tyr Arg Asn Leu Asn Leu Asn

225 230 235 240

Trp Glu Leu Thr Ala Ala Trp Thr Gly Val Gln Val Lys Val Pro Val

245 250 255

Lys Phe Ile Thr Gly Asp Leu Asp Ile Val His Thr Ser Leu Gly Thr

260 265 270

Lys Asp Tyr Ile Glu Ser Gly Ala Phe Lys Arg Asp Val Pro Phe Leu

275 280 285

Glu Glu Val Val Val Gln Glu Gly Val Ala His Phe Asn Asn Gln Glu

290 295 300

Ala Ala Glu Asp Val Ser Asn His Ile Tyr Asp Phe Ile Asn Lys Phe

305 310 315 320

<210> 3

<211> 963

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atggaaggcg tagaacacag gacagtggaa gtgaatggca tcaaaatgca tgtagcagag 60

aaaggagagg gtcctgtcgt cttgttcctc catggcttcc ccgagctctg gtactcctgg 120

cgccaccaga ttctggctct cagcgccctc gggtaccgcg ccgtggctcc tgatctgcgt 180

ggctacggag acaccgatgc cccggcttcg gtgagcagct acaccatctt gcacctcgtg 240

gctgacgtcg tggcactcat tgactcactt ggtgtggatc aagtcttcct cgttgcccat 300

gatctcggag ccctagtagg atggtacaca tgtttatttc gacctgatag aatcaaggcc 360

tatgtttgcc tcagcgtccc tttcatgccc agaaacccaa aagtgaagcc cgttgatgcc 420

atgcgtgccc tttatgggga tgactactac atctgcagat tccaggaacc aggcaagatg 480

gaaactctgt atgacaataa tatcgaagaa gcaatcaaga acatgcttac aagtaggaga 540

ccaggaccac caatcctccc caaagaagga gcgggttcca atccccttgc ttcagggtcc 600

cttccatcaa ggcctcttcc atcttggctc tcacaggaag atctgactta ctatgcttct 660

aaatttggca agacaggctt aactggtggc ctcaactact atagaaatct caacctcaat 720

tgggagctca cagcagcatg gactggagtt caagtcaaag ttcctgtgaa gttcattaca 780

ggtgatttgg atatagttca cacctcactg gggaccaaag actacataga gagtggtgct 840

ttcaagagag atgtgccatt tttggaggaa gtggttgtgc aggaaggggt tgctcacttc 900

aacaaccaag aagctgcaga ggatgtcagc aatcacattt atgattttat caacaagttc 960

tga 963

<210> 4

<211> 963

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atggaaggcg tagaacacag gacagtggaa gtgaatggca tcaaaatgca tgtagcagag 60

aaaggagagg gtcctgtcgt cttgttcctc catggcttcc ccgagctctg gtactcctgg 120

cgccaccaga ttctggctct cagcgccctc gggtaccgcg ccgtggctcc tgatctgcgt 180

ggctacggag acaccgatgc cccggcttcg gtgagcagct acaccatctt gcacctcgtg 240

gctgacgtcg tggcactcat tgactcactt ggtgtggatc aagtcttcct cgttgcccat 300

gattggggag cactaatcgg atggtacaca tgtttatttc gacctgatag aatcaaggcc 360

tatgtttgcc tcagcgtccc tttcatgccc agaaacccaa aagtgaagcc cgttgatgcc 420

atgcgtgccc tttatgggga tgactactac atctgcagat tccaggaacc aggcaagatg 480

gaaactctgt atgacaataa tatcgaagaa gcaatcaaga acatgcttac aagtaggaga 540

ccaggaccac caatcctccc caaagaagga gcgggttcca atccccttgc ttcagggtcc 600

cttccatcaa ggcctcttcc atcttggctc tcacaggaag atctgactta ctatgcttct 660

aaatttggca agacaggctt aactggtggc ctcaactact atagaaatct caacctcaat 720

tgggagctca cagcagcatg gactggagtt caagtcaaag ttcctgtgaa gttcattaca 780

ggtgatttgg atatagttca cacctcactg gggaccaaag actacataga gagtggtgct 840

ttcaagagag atgtgccatt tttggaggaa gtggttgtgc aggaaggggt tgctcacttc 900

aacaaccaag aagctgcaga ggatgtcagc aatcacattt atgattttat caacaagttc 960

tga 963

<210> 5

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gttgcccatg atctcggagc cctagta 27

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tactagggct ccgagatcat gggcaac 27

一种对映选择性提高的菜豆环氧化物水解酶突变体专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。