专利摘要

本发明的目的是提供一种新型酯酶，该酯酶的氨基酸序列为SEQIDNO:1。本发明的酯酶可催化虾青素酯的水解生成游离虾青素，在催化水解48h后，使大部分的虾青素酯得以水解，水解度可达99％以上，体现了该酯酶在天然游离虾青素制备上的潜能。

权利要求

1.一种酯酶，其特征在于，所述的酯酶包含有：

1)氨基酸序列为SEQ ID NO:1的酶；

2)在1)中取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，由1)所衍生的，具有1)中酯酶功能的酶。

2.一种基因，其特征在于，所述的基因编码权利要求1所述的酯酶。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，所述的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。

4.一种重组表达载体，其特征在于，所述的重组表达载体携带有权利要求2所述的基因。

5.一种重组宿主微生物，其特征在于，所述的重组宿主微生物转化/转染有权利要求4所述的重组表达载体。

6.权利要求5所述的重组宿主微生物在重组表达权利要求1所述的酯酶中的应用。

7.权利要求1所述的酯酶在催化水解虾青素酯制备游离虾青素中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的虾青素酯是由雨生红球藻油和/或虾油来提供的。

9.一种制备游离虾青素的方法，其特征在于，所述的方法是使用权利要求1所述的酯酶水解虾青素酯来制备游离虾青素。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的虾青素酯是由雨生红球藻油和/或虾油来提供的。

说明书

技术领域

本发明属于功能酶筛选技术领域，具体涉及一种酯酶及其应用。

背景技术

脂类水解酶(Lipolytic enzymes，EC 3.1.1.x)是α/β水解酶家族的一员，可催化酯键的水解和合成，并广泛存在于动物、植物和微生物中。根据脂类水解酶催化底物脂肪酸链长短的不同，可将其分为酯酶(Esterase，EC 3.1.1.1)和脂肪酶(Lipase，EC 3.1.1.3)。脂类水解酶在水相中可催化水解反应的进行，在有机体系中可催化转酯、酯合、酯交换和氨解等多种反应的进行。脂类水解酶作用高效，反应条件温和，并且反应过程中不需要辅酶的添加，不仅如此，脂类水解酶还具有高的化学、区域和立体选择性，它已成为工业生产的重要催化剂，如食品加工、洗涤剂、医药、精细化工等行业。

工业化对脂类水解酶需求的日益增长，也促进了筛选方法的不断完善和发展。其中宏基因组文库构建法是通过抽提特定环境中所有微生物基因组DNA，并进行基因分析和克隆的一种手段。据报道，在自然界中，约99％的微生物处于不可培养状态，因此构建宏基因组文库可以使自然界中的微生物资源得以充分的利用，宏基因组文库成为获得优良性状酶催化剂的一种高效手段。

虾青素(Astaxanthin)，也被称为虾黄质、虾黄素和龙虾壳色素，类胡萝卜素的一种，分子式为C₄₀H₅₂O₄，是一种萜类不饱和化合物。虾青素分布十分广泛，特别是虾蟹等水生动物中，是这类生物的主要色素，如龙虾等海产品红润的肉色，即虾青素在体内的积累而成。虾青素不稳定，易被氧化，氧化后的产物为虾红素(as-tacene)。大量研究表明，虾青素具有良好的生理功能，如抗氧化、抗衰老、增强免疫力、抗肿瘤等，分子结构的独特性，使得虾青素成为自然界最强的抗氧化剂。虾青素因其良好的生物学功能，已被广泛应用于食品、化妆品、医药、水产养殖等行业。目前，虾青素的制备主要有化学合成法和生物获取法两种，其中化学合成的虾青素已被美国食品与药物管理局(FDA)明确禁止进入保健市场，这是因为化学合成的虾青素在结构、生理功能和应用等方面与天然虾青素存在明显的差异，而且化学合成过程中不可避免的引入杂质，影响了虾青素使用的安全性。生物中获取虾青素的方法包括：①从水产品加工的下脚料，如虾壳、蟹壳中提取；②培养红发夫酵母生产虾青素；③培养微藻(雨生红球藻)生产虾青素。其中，虾壳蟹壳和雨生红球藻内的虾青素主要以复杂的虾青素酯的形式存在，而不同的虾青素酯的功能又存在差异，这就限制了这两种来源的虾青素的进一步高值化利用。通过将虾青素酯进行水解，制备出的游离虾青素具有广泛的应用。一方面，游离虾青素可通过连接特定脂肪酸，制备具有特定功能的虾青素酯，另一面，游离虾青素可以用于与虾青素酯的功能比较研究。不仅如此，制备出高纯度的游离虾青素，还可以用作标准品。

目前水解虾青素酯制备游离虾青素的方法，主要采用皂化法，但皂化过程使用了大量的碱和有机溶剂，破坏了环境，造成了浪费，不仅如此，碱的使用，还会使虾青素遭到破坏，产生虾红素等副产物。另一种是采用酯酶或脂肪酶水解法，这为虾青素酯的水解提供了一条新的思路。但目前存在的脂类水解酶水解法仍存在处理量小和转化率低等问题，因此寻找新型脂类水解酶将其应用于游离虾青素的制备中，显得至关重要。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型酯酶，以及利用该酯酶的水解活性高效催化水解虾青素酯来制备游离虾青素的方法，从而弥补现有技术的不足。

本发明首先提供一种酯酶，该酯酶包含有：

1)氨基酸序列为SEQ ID NO:1的酶；

2)在1)中取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，由1)所衍生的，具有1)中酯酶功能的酶；

编码上述酯酶的基因，其一种核苷酸序列为SEQ ID NO:2；

本发明再一个方面提供一种重组表达载体，该重组表达载体携带有编码上述酯酶的基因；

本发明还提供重组宿主，用于重组表达上述的酯酶；

本发明的酯酶用于制备催化水解虾青素酯来制备游离虾青素。

其一种具体制备方法，是使用酯酶粉水解雨生红球藻油和/或虾油来制备游离虾青素。

本发明的酯酶可催化虾青素酯的水解生成游离虾青素，在催化水解48h后，使大部分的虾青素酯得以水解，水解度可达99％以上，体现了该酯酶在天然游离虾青素制备上的潜能。

附图说明

图1：不同脂类水解酶催化虾青素酯水解的示意图；

图2：本发明的酯酶Est3-14进化树分析及多重序列比对示意图；

图3：本发明的酯酶Est3-14的SDS-PAGE电泳图。泳道0是蛋白Marker，泳道1是表达后菌体破碎液上清，泳道2是表达后菌体破碎液沉淀，泳道3是纯化后的Est3-14；

图4：Est3-14酶学性质研究。图a是Est3-14底物碳链长度的偏好性，图b是Est3-14的最适温度，图c是Est3-14的最适pH，图d是表面活性剂对Est3-14酯酶活力的影响；

图5：Est3-14催化虾青素酯水解的HPLC结果图。

具体实施方式

本发明用到了分子生物学和酶催化领域使用的常规技术和方法，下面将结合实施例和附图对该发明进行详细的描述，但保护范围并不仅限于此。

实施例1：新型酯酶的异源表达及虾青素酯水解酶的筛选

对构建的海洋淤泥宏基因组文库进行测序后，通过序列功能分析，我们从中找到了一些具有假定脂类水解酶活性的目的片段。挑选部分脂类水解酶片段(est3-14，X1，X2，X3，X4，X5，X6)进行异源表达，载体使用pET-28a(+)，宿主采用BL21(DE3)。

对上述宏基因组来源的脂类水解酶工程菌进行诱导发酵，发酵结束后，50mL发酵液离心去除上清，菌体先利用0.9％NaCl溶液进行冲洗，后使用6mLTris-HCl缓冲液(100mM，pH 7.5)进行复溶，并于冰浴下进行超声破碎。破碎液上清用于水解虾青素酯功能的验证，水解反应体系如下：0.5％雨生红球藻油，0.5mL无水乙醇，6mL破碎液上清。将反应混合液置于37℃水浴摇床中震荡孵育48h后，使用萃取液(异丙醇/二氯甲烷＝1:1)进行反复抽提，并进行TLC法检测生成的游离虾青素。TLC结果(图1)显示，脂类水解酶Est3-14具有水解虾青素酯制备游离虾青素的能力，而X1，X2，X3，X4，X5，X6这6种脂类水解酶无法水解虾青素酯。

实施例2：酯酶Est3-14基因序列分析

脂类水解酶Est3-14的家族分类，使用文献已报道的方法来进行，使用MEGA 6.0软件构建Est3-14与其他家族脂类水解酶的进化树，Clustal X软件用于对脂类水解酶进行多序列比对，ESPript 3.0(http://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/)用于比对序列的输出。如图2a所示，Est3-14属于脂类水解酶第V家族，并具有典型的催化三联体Ser(115位)，Asp(237位)，His(363位)(图2b)。该酶与GenBank中已报道蛋白的氨基酸相似度最高仅为51％(Acidimicrobium sp.)。

实施例3：酯酶Est3-14的纯化

重新对酯酶Est3-14进行诱导发酵，发酵结束后，通过离心收集菌体，并使用灭菌生理盐水清洗菌体一次。清洗结束后，使用含有10mM咪唑的Tris-HCl缓冲液(pH 8.0,100mM)复溶菌体，并置于超声波细胞粉碎机上进行超声破碎，破碎液上清用于酯酶Est3-14的纯化。该纯化过程采用镍柱(1mL，Qiagen，Hilden，Germany)来进行，蛋白的梯度洗脱使用含有不同浓度咪唑(20mM-500mM)的Tris-HCl缓冲液(pH 8.0，100mM)。洗脱后的溶液分别进行收集，并使用超滤浓缩管(～10kDa)进行浓缩脱盐，并进行蛋白电泳分析及脂肪酶/酯酶酶活检测。

上述酯酶Est3-14的蛋白凝胶电泳结果如图3所示，条带0是蛋白marker，条带1是菌体破碎液上清，条带2是菌体破碎液沉淀，条带3是纯化后的Est3-14。

实施例4：酯酶Est3-14酶学性质研究

经实施例3纯化后的酯酶Est3-14，用作酶学性质研究。

(1)酯酶Est3-14底物特异性研究

对Est3-14的最适底物进行探索，该过程选用不同碳链长度的pNP酯(C2，C4，C8，C10，C12，C14，C16)：pNP acetate(pNPA)，pNP butyrate(pNPB)，pNP caprylate(pNPC)，pNP decanoate(pNPD)，pNP laurate(pNPL)，pNP myristate(pNPM)和pNP palmitate(pNPP)。最适碳链长度下的活性定义为100％，其他碳链长度下的活性以对最高活性的百分比表示。如图4a所示，Est3-14的底物谱广泛，对C2-C16的pNP酯都有水解活性，其中Est3-14对C4(pNPB)的水解活性最高，对碳链长度>10的pNP酯水解活性较弱，说明Est3-14是一个酯酶。

(2)酯酶Est3-14最适温度

酯酶Est3-14的最适温度，通过在不同温度(20，25，30，35，40，45，50℃)下孵育反应，并检测吸光值A₄₀₅来确定。最适温度下的活性定义为100％，其他温度下的活性以对最高活性的百分比表示。由结果(图4b)可以看出，温度<40℃时，随着温度的升高，酯酶活性逐渐升高，温度>40℃后，随着温度升高，酯酶活性逐渐降低，Est3-14的最适温度为40℃。

(3)酯酶Est3-14最适pH

pH对酯酶Est3-14活性的影响，使用不同pH的不同缓冲液来检测。该过程使用的缓冲液包括：100mM柠檬酸缓冲液(pH 4.0-6.0)，100mM磷酸钠缓冲液(pH 6.0-8.0)，100mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0-9.0)和100mMNa₂CO₃-NaHCO₃缓冲液(pH 9.0-10.0)。最适pH下的活性定义为100％，其他pH下的活性以百分比来表示。结果(图4c)显示，Est3-14在pH为9的Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液中显示出最高的水解活性，并且较之酸性条件，Est3-14在碱性条件下显示出更高的水解活性，说明Est3-14属于一个典型的碱性酯酶。(4)表面活性剂对酯酶Est3-14活性的影响

为了检测表面活性剂对酯酶Est3-14的影响，我们通过向反应液中添加不同的表面活性剂(终浓度0.5％)来测定，其中使用的试剂包括：SDS，TritonX-100，Tween 20，Tween 60和Tween 80。反应液中未添加表面活性剂时测得的活性定义为100％，添加了表面活性剂的以百分比表示。结果如图4d所示，通过与未添加表面活性剂的样品对比，发现Triton X-100、Tween 20、Tween 60和Tween 80都对酯酶酶活的提高具有促进作用，其中Tween 20对酯酶Est3-14水解活性的提高最大，提高了22.7％，SDS则对Est3-14的活性具有显著的抑制效果。

(5)金属离子对酶活的影响

金属离子对酯酶Est3-14活性的影响，通过向反应体系中添加终浓度为1mM和10mM的金属离子(CoCl₂，KCl，LiCl，FeSO₄，FeCl₃，MnCl₂，CaCl₂，MgCl₂，ZnCl₂和NiCl₂)以及Na₂-EDTA来测定。未添加金属离子和Na₂-EDTA的作为对照，其活性定义为100％，结果如下表所示。

外部添加金属离子，并未对Est3-14水解活性的提高起到显著的促进作用，在1mM金属离子的添加量下，Co²⁺和K⁺对酶活的提高有轻微的促进作用，酶活分别提高到107.9％和105.6％，其他金属离子和Na₂-EDTA则对Est3-14的酶活有抑制作用。在10mM金属离子和Na₂-EDTA的添加量下，酯酶Est3-14的水解活性都受到了不同程度的抑制，其中Zn²⁺对酶活的抑制效果最强，活性仅为对照组的23.2％。

(6)有机溶剂对酶活的影响

有机溶剂对酯酶Est3-14活性的影响，通过向反应体系中添加终浓度为25％、50％和100％的有机溶剂来进行检测，选择的有机溶剂包括：甲醇、乙醇、乙腈、正己烷、氯仿、二甲亚砜、丙酮、正丙醇、异丙醇、异辛烷和环己烷。测定前，将酶液与有机溶剂混合后置于30℃下震荡孵育3h，残余的酯酶酶活用比色法进行测定。

对于疏水性有机溶剂，孵育后的混合液通过离心去除有机溶剂后，剩余的酶液水相进行酶活测定；对于亲水性有机溶剂，孵育后的混合液用缓冲液进行稀释，至有机溶剂的浓度为5％后进行测定，消除有机溶剂对酶活测定的影响。

如下表所示，Est3-14在低浓度(25％)的亲水有机溶剂中保持了较好的活性，并且随着浓度提高到50％，酶活呈现明显的下降趋势，但当亲水有机溶剂的浓度提高到100％后，Est3-14在部分亲水有机溶剂中的活性较之50％下的活性，有了明显提高，比如Est3-14在50％乙腈中残留的活性为20.0％，在100％乙腈中的活性为90.2％。Est3-14在疏水性有机溶剂中残留的活性，表现出不规则的变化。其中，Est3-14在无水正己烷中活性较高，经孵育后，残留活性仍可以达到88.2％，这暗示了Est3-14在正己烷中进行非水相催化的潜力。

实施例4：酯酶Est3-14催化水解雨生红球藻油中虾青素酯

重新发酵酯酶Est3-14，离心收集后的大肠杆菌，使用超纯水进行复溶，并置于超声破碎机下进行破碎处理。通过离心去掉破碎液沉淀后，破碎液上清进行冷冻干燥，制得的Est3-14酶粉用于虾青素酯水解的研究。反应体系如下：0.5％雨生红球藻油，0.5mL无水乙醇，6mL Tris-HCl缓冲液，1700U酯酶Est3-14(以对pNPB的水解活性定义)。将反应混合液置于37℃水浴摇床中震荡反应，分别于48h和72h下取样使用HPLC法检测生成的游离虾青素含量。

HPLC结果如图5所示，在HPLC图谱上，峰1为生成的游离虾青素，20min以后出峰的物质为虾青素酯。通过与0h的结果对比，发现在外部添加1700U酯酶Est3-14后，虾青素酯在48h时可以水解比较完全，且水解率达到99％以上，结果表明筛选得到的Est3-14在水解虾青素酯方面具有非常好的潜力。

实施例5：酯酶Est3-14催化虾油中虾青素酯的水解

按照实施例4中的方法，发酵制备Est3-14酶粉，并将其应用于虾油中虾青素酯的水解研究。水解体系如下：1.0％虾油，0.5mL无水乙醇，6mL Tris-HCl缓冲液，2000U酯酶Est3-14(以对pNPB的水解活性定义)。将反应混合液置于37℃水浴摇床中震荡反应48h，并使用HPLC法检测生成的游离虾青素含量。

水解结果显示，在添加2000U酯酶Est3-14的条件下，虾油中的虾青素酯在48h内基本被水解完全，水解率可达99％以上，并且大大降低了虾红素等副产物的产生。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国海洋大学

<120> 一种酯酶及其应用

<130>

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 290

<212> PRT

<213> 1

<400> 1

Met Ser Val Lys Pro Thr Ser Val Met Asp Ile Pro Pro Leu Leu Pro

1 5 1015

Gly Arg Leu Ile Ser Leu Pro Gly Arg Gly Glu Ile Phe Val Arg His

202530

His Gln His Val Asn Pro Asp Ala Pro Thr Leu Leu Leu Leu His Gly

354045

Trp Thr Ala Ser Ser Asp Leu Gln Phe Phe Thr Ala Tyr Glu Glu Leu

505560

Ser Arg Asn Tyr Ser Ile Val Gly Val Asp His Arg Gly His Gly Arg

65707580

Gly Leu Arg Pro Asn His Thr Phe Ser Leu Glu Asp Cys Ala Asp Asp

859095

Ala Ala Ala Val Val Arg Ala Leu Gly Ile Arg Asn Val Ile Thr Val

100 105 110

Gly Tyr Ser Met Gly Gly Pro Ile Ser Leu Leu Val Trp Gln Arg His

115 120 125

Ser Asp Leu Val Thr Gly Met Val Leu Gln Ala Thr Ala Leu Glu Trp

130 135 140

Ser Gly Thr Arg Gln Glu Arg Asn Lys Trp Arg Val Met His Val Ile

145 150 155 160

Asp Pro Leu Phe Arg Arg Ile Asn Ser Pro Arg Leu Thr Arg Trp Tyr

165 170 175

Val Arg Arg Leu Ile Pro Arg Gly His Glu Ile Asn Arg Tyr Leu Pro

180 185 190

Trp Ile Thr Gly Glu Leu Arg Arg Asn Asp Ser Trp Met Ile Ser Glu

195 200 205

Ala Gly Arg Ala Ile Ser Arg Phe Asp Ala Arg Gly Phe Ala His Thr

210 215 220

Val Asn Val Pro Thr Ser Phe Val Leu Thr Thr Leu Asp Lys Leu Val

225 230 235 240

Leu Pro His Lys Gln Gln Ala Leu Ala Asp Ala Val Arg Ala Glu Val

245 250 255

Val Glu Leu Glu Gly Asp His Leu Ala Pro Met Gln Gln Pro Arg Glu

260 265 270

Phe Ser Trp Ala Thr Ala Arg Ala Val Glu Ile Val Val Arg Gln Thr

275 280 285

Asn Gln

290

<210> 2

<211> 873

<212> DNA

<213> 2

<400> 2

atgtcagtaa aaccaacgag cgtgatggac attccaccgc ttttgcccgg ccgtttgatt 60

tcactgcctg gtcgaggcga gatttttgtg cgccatcatc aacatgtaaa ccccgacgcg 120

ccaacgttgc tattgcttca cgggtggaca gcatcatctg atttgcagtt tttcaccgcg 180

tatgaagaac tctcacgtaa ttattcaatt gttggcgtcg accatcgcgg tcatggtcga 240

ggcttacgcc cgaaccacac gttctcgctt gaagattgcg ccgatgatgc agcagcagtt 300

gtgcgagcgc ttggcattcg taacgtcatt acggttggtt actcaatggg tggccccatc 360

agcttgttgg tgtggcaacg acacagtgat ctcgtgaccg gaatggttct gcaagcaaca 420

gcacttgagt ggagcggcac acgtcaagaa cgcaacaagt ggcgcgtcat gcacgtcatt 480

gacccgttat tccgtcgcat caactcacct cgtctgacgc gttggtatgt ccggcgactc 540

attccgcgcg gtcatgaaat caaccgttac ctgccgtgga tcacaggcga gttgcgacgt 600

aatgattcgt ggatgatcag cgaagcaggt cgtgccatct cgcgttttga tgctcgcggg 660

tttgcgcaca ccgtgaatgt gccaacaagt tttgtgttga cgacgctcga caaacttgtc 720

ttgccgcaca aacaacaagc gctcgctgat gctgttcgcg cagaagtggt ggaacttgag 780

ggcgatcact tggcgcccat gcagcaacca cgcgaatttt cgtgggctac tgctcgcgct 840

gtggagattg ttgttcgcca gacgaatcaa tga873

一种酯酶及其应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

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A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。