专利摘要
本发明公开了一种一步法合成L‑肌肽的方法及截短的L‑肌肽合成酶，该方法以β‑丙氨酸、L‑组氨酸、ATP和聚磷酸盐为原料，MgCl2为激活剂，加入L‑肌肽合成酶和聚磷酸盐激酶，在pH6.5‑8.5,30‑45℃温度条件下通过酶促反应偶联催化合成肌肽；本发明利用大肠杆菌分别表达截短的L‑肌肽合成酶(其氨基酸序列如SEQIDNo.3所示)和聚磷酸盐激酶，经纯化后混合形成双酶偶联体系，截短表达的L‑肌肽合成酶催化β‑丙氨酸和L‑组氨酸合成L‑肌肽，同时伴随着ATP去磷酸化形成ADP，聚磷酸盐激酶则催化聚磷酸盐转磷酸基团给ADP形成ATP，从而实现ATP的循环再生；利用双酶偶联体系，在合适的反应条件下反应得到肌肽；本发明的方法具有原料价格低廉、酶转化时间短、操作简便以及生产成本低等优点。
权利要求
1.一种一步法合成L-肌肽的方法，其特征在于:以β-丙氨酸、L-组氨酸、ATP和聚磷酸盐为原料，MgCl
（1）分别构建截短的L-肌肽合成酶基因重组表达载体pET-CARNS1和聚磷酸盐激酶基因重组表达载体pET-Ppk；其中，所述截短的L-肌肽合成酶基因来源于Gallus gallus，将该序列经密码子优化后其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示序列；聚磷酸盐激酶基因来源于E.coli K-12 (MG 1655)，其核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示；截短的L-肌肽合成酶氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；
（2）分别将步骤(1)中的重组表达载体转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，获得基因工程重组菌株E.coli pET-CARNS1和E.coli PET-PPK；
（3）培养步骤(2)中的重组菌株，从而获得表达截短的L-肌肽合成酶和聚磷酸盐激酶的菌体；
（4）破碎步骤(3)中的菌体获得粗酶液，经镍柱纯化后混合；
（5）将步骤(4)中获得的混合酶液加入含有80-150 mMβ-丙氨酸、80-150 mM L-组氨酸、5 mM MgCl
2.根据权利要求1所述的一种一步法合成L-肌肽的方法，其特征在于：所述步骤(3)中重组菌株的培养方法为:重组菌株按体积百分比的1-2%接种至含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃，180-220rpm培养至OD600达到0.6-0.8时，添加终浓度0.2-0.5 mMIPTG，于25-28℃诱导培养8-10h，收集菌体。
3.根据权利要求2所述的一种一步法合成L-肌肽的方法，其特征在于：所述LB液体培养基每升包括10g氯化钠、5g酵母粉、10g蛋白胨，pH值为7.2-7.4。
4.根据权利要求1所述的一种一步法合成L-肌肽的方法，其特征在于：所述催化液为50mM磷酸缓冲液中含有浓度为100 mMβ-丙氨酸、100 mM L-组氨酸、5 mM MgCl
5.一种截短的L-肌肽合成酶，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
说明书
技术领域
本发明涉及一种肌肽的制备方法，具体是一种一步法合成L-肌肽的方法，属于生物生产技术领域。
背景技术
L-肌肽(β-丙氨酰-L-组氨酸)及其类似物(如高肌肽和鹅肌肽)，是广泛存在于哺乳动物的大脑、肌肉和其他重要组织中的天然活性二肽。自该活性肽发现的一百多年来，已有大量的研究发现或者证明L-肌肽具有显著的抗氧化、消除胞内自由基、抗衰老等活性，并且在临床上用于高血压、心脏病、老年性白内障、溃疡、抗肿瘤、促进伤口愈合等方面的辅助治疗。由于其抗氧化的活性强，毒副作用低并具有多种生理活性，该活性肽及其衍生物在医药、保健、卫生、化妆品等领域已有广泛的应用，市场空间广阔。
目前L-肌肽的生产主要采用化学合成法。已有的化学合成方法比较多，主要可以分为两大类：(1)利用β-丙氨酸参与合成。其主要路线是β-丙氨酸经氨基保护、羧基活化后与保护的L-组氨酸缩合，然后脱掉保护基团得到L-肌肽。该路线由于各个保护基团的差异导致合成路线较多。其中常用的方法是利用邻苯二甲酸酐与β-丙氨酸生成邻苯二甲酰-β-丙氨酸保护氨基，羧基与氯化亚砜反应生成邻苯二甲酰-β-丙氨酰氯，再与保护的L-组氨酸形成肽键后脱保护基团得到产品。该路线比较复杂，收率低，肽键形成过程中易消旋，影响产品纯度，并且溶剂消耗大，易造成环境污染；(2)无β-丙氨酸参与的反应：主要原理为L-组氨酸先与不同的β-丙氨酸前体生成肽键，再进一步转换为肌肽。常用的路线是在醇钠作用下，L-组氨酸和氰乙酸乙酯发生酰化反应，得到氰基乙酰-L-组氨酸，经催化氢化还原得L-肌肽。该路线相对简单，省去对不同基团的保护和脱保护的过程，避免消旋反应的发生，但是需要无水操作，要求严格。同时，氰乙酸乙酯为环境毒害物质，易引起水体污染和毒性反应。
目前，已有采用温和环保的酶催化合成取代传统化学合成工艺的报道。如采用氨肽酶催化β-丙氨酸甲酯与L-组氨酸一步合成L-肌肽(申请公布号为CN107217048A的专利文献)。该方法依然需要将β丙氨酸甲酯化，并且反应液中合成的L-肌肽会被氨肽酶降解为β-丙氨酸和L-组氨酸，同时，氨肽酶会形成三肽，导致反应产物复杂、提取纯化困难、L-肌肽得率较低。
发明内容
本发明的目的是提供一种一步法合成L-肌肽的方法，该方法具有原料价格低廉、酶转化时间短、操作简便以及生产成本低等优点，具有较好的工业应用潜力。
为了达到上述技术目的，本发明的技术方案是：
一种一步法合成L-肌肽的方法，该方法以β-丙氨酸、L-组氨酸、ATP和聚磷酸盐为原料，MgCl2为激活剂，加入L-肌肽合成酶和聚磷酸盐激酶，在pH6.5-8.5,30-45℃温度条件下通过酶促反应偶联催化合成肌肽。
具体地，包括以下步骤：
(1)分别构建截短的L-肌肽合成酶基因重组表达载体pET-CARNS1和聚磷酸盐激酶基因重组表达载体pET-Ppk；其中，所述截短的L-肌肽合成酶基因来源于Gallus gallus，将该序列经密码子优化后其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示序列；聚磷酸盐激酶基因来源于E.coli K-12(MG1655)，其核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示；截短的L-肌肽合成酶氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
(2)分别将步骤(1)中的重组表达载体转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，获得基因工程重组菌株E.coli pET-CARNS1和E.coli PET-PPK。
(3)培养步骤(2)中的重组菌株，从而获得表达截短的L-肌肽合成酶和聚磷酸盐激酶的菌体。
重组菌株的培养方法为:重组菌株按体积百分比的1-2％接种至含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃，180-220rpm培养至OD600达到0.6-0.8时，添加终浓度0.2-0.5mM IPTG，于25-28℃诱导培养8-10h，收集菌体。
作为优选，所述LB液体培养基每升包括10g氯化钠、5g酵母粉、10g蛋白胨，pH值为7.2-7.4。
(4)破碎步骤(3)中的菌体获得粗酶液，经镍柱纯化后混合。
(5)将步骤(4)中获得的混合酶液加入含有80-150mMβ-丙氨酸、80-150mM L-组氨酸、5mM MgCl2、3.0-6.0mM ATP和30-50mM六偏磷酸钠的催化液中，在pH值为6.5-8.5,温度为30-45℃条件下进行酶促反应合成肌肽。
所述催化液为50mM磷酸缓冲液中含有浓度为100mMβ-丙氨酸、100mM L-组氨酸、5mM MgCl2、5mM ATP和50mM六偏磷酸钠。
本发明方法利用大肠杆菌分别表达截短的L-肌肽合成酶和聚磷酸盐激酶，经纯化后混合形成双酶偶联体系。截短表达的L-肌肽合成酶催化β-丙氨酸和L-组氨酸合成L-肌肽，同时伴随着ATP去磷酸化形成ADP，聚磷酸盐激酶则催化聚磷酸盐转磷酸基团给ADP形成ATP，从而实现ATP的循环再生。
肌肽的检测方法为：取适量体积反应液于15000g离心10min后，取上清液经适当稀释后，取30μl样品混于pH值为9.0的270μl 0.2M硼酸缓冲液，加入300μl 1.5mg/ml FMOC-Cl乙腈溶液，室温放置10分钟，再加入300μl4mg/ml盐酸金刚烷胺的乙腈溶液，混匀，乙腈与水比例为1:1，0.22μm滤膜过滤，上HPLC进行测定。
本发明的有益效果：
因来源于Gallus gallus的L-肌肽合成酶全酶不能在大肠杆菌中成功表达。本发明的中设计的截短L-肌肽合成酶基因在大肠杆菌中成功获得可溶性表达，并能一步催化β丙氨酸和L-组氨酸合成L-肌肽。与其它已经报道的酶法或者化学法合成L-肌肽方法相比，本发明所需底物无需经过甲酯化或者基团保护；催化反应中所需要的ATP由聚磷酸激酶催化ADP磷酸化不断再生，只需消耗少量的ADP即可实现ATP的循环再生；且再生原料六偏磷酸钠来源广泛，成本低廉，操作简单，易于规模化生产，具有较好的工业应用潜力。
附图说明
图1为双酶偶联反应示意图。
图2为双酶催化反应液的色谱图和肌肽标准品色谱图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
肌肽的制备方法：以β-丙氨酸、L-组氨酸、ATP和聚磷酸盐为原料，MgCl2为激活剂，加入L-肌肽合成酶和聚磷酸盐激酶，在pH 6.5-8.5,30-45℃温度条件下通过酶促反应偶联催化合成肌肽，如图1所示。具体步骤：
一、重组截短L-肌肽合成酶菌株构建
1.1：根据Genbank中基因登录号为GU453679编码的carnosine synthase1的第480到930的氨基酸序列抽提出来，并在氨基酸添加MERKT肽段，形成截短的L-肌肽合成酶氨基酸序列，如SEQ ID NO.3所示，经密码子优化后，在优化序列5’端添加NcoI酶切位点，3’端添加XhoI酶切位点，形成如SEQ ID NO.1所示序列。该序列由生工生物工程(上海)有限公司合成。
1.2：使用限制性内切酶NcoI和XhoI双酶切1.1中的基因片段及pET-28a载体，胶回收目的片段，并用T4DNA连接酶连接两个基因片段，得到重组表达载体pET-CARNS1。
1.3：将1.2中的重组表达载体转化E.coli BL21(DE3)中，获得产截短表达的L-肌肽合成酶菌株E.coli pET-CARNS1。
二、聚磷酸激酶表达菌株构建
2.1：以E.coli K12基因组为模板，用引物对5’-GGATCCATATGGGTCAGGAAAAGCTATAC-3’/5’-CGCGGATCCGGTACCTTATTCAGGTTGTTCGAG-3’扩增ppk基因片段。所述引物分别包含酶切位点NdeI和BamHI，形成如SEQ ID NO.2所示序列。
2.2：使用限制性内切酶NdeI和BamHI双酶切2.1中获得的目的片段及pET-15b载体，胶回收相应目标片段DNA。
2.3：使用T4DNA连接酶连接2.2中的两个基因片段，得到重组载体pET-PPK。
2.4：将2.3获得的重组质粒转化E.coli BL21(DE3)中，获得表达聚磷酸激酶的E.coli PET-PPK。
三、截短L-肌肽合成酶和聚磷酸激酶的制备
将步骤一、二中的菌株分别按照1％或2％(v/v)接种到LB培养基中(含50μg/mL卡那霉素用于E.coli pET-CARNS1，100μg/mL氨苄青霉素用于E.coli pET-PPK)，于37℃，200rpm培养至OD600达到0.8左右，添加终浓度为0.4mM的IPTG，25-28℃诱导培养10h。
将E.coli pET-CARNS1发酵液于8000rpm，4℃离心10分钟，收集菌体。使用pH7.4的PBS缓冲液洗涤2次后，再次用缓冲液重悬，加入1％(v/v)Triton-100，冰浴，超声波破碎4秒停2秒，维持15分钟。4℃，12000rpm离心20分钟，取上清液。
将上清液经0.45微米滤膜过滤后，以1ml/min的流速通过Ni Focurose6FF(IMAC)树脂后，用同样流速的0.5M NaCl，20mM pH7.4PBS缓冲液冲洗，再用0.5M NaCl和250mM咪唑溶液以同样流速洗脱目的蛋白。
将洗脱的蛋白用pH7.4PBS缓冲液4℃透析脱盐，获得纯化酶液。
E.coli pET-PPK的发酵液处理方法按照文献(Artificial Cells,BloodSubstitutes,and Biotechnology,34:515–521,2006,DOI:10.1080/10731190600862886)所述进行处理。
四、双酶偶联催化合成L-肌肽
4.1：配置反应体系，其中pH7.4 50mM磷酸缓冲液中含有浓度为100mMβ-丙氨酸、100mM L-组氨酸、5mM MgCl2、5mM ADP和50mM六偏磷酸钠。
4.2：向4.1中添加纯化的L-肌肽合成酶与聚磷酸激酶，使得终浓度分别为0.2mg/ml和0.4mg/ml。反应体系在37℃水浴振荡反应6h。
反应液中L-肌肽及底物氨基酸的检测：上述的L-肌肽制备方法所得催化体系中L-肌肽的检测方法为：取适量体积反应液于15000g离心10min后，取上清液经适当稀释后，取30μl样品混于270μl 0.2M硼酸缓冲液(pH＝9.0)，加入300μl 1.5mg/ml FMOC-Cl乙腈溶液，室温放置10分钟，再加入300μl4mg/ml盐酸金刚烷胺的乙腈：水(1:1)溶液，混匀，0.22μm滤膜过滤，上HPLC进行测定。
色谱分析条件：Zorbax ODS C18柱，上样量20μl；流动相组成：A：乙腈；B:50mM醋酸钠缓冲液pH4.2；检测波长263nm；流动相总流量1ml/min；柱温30℃；梯度洗脱程序：0-3min，34％A，66％B；3-10min，45％A，55％B；10-20min，60％A，40％B；20-30min，100％A；30-40min，100％A。分析结果如图2所示。
上述实施例不以任何方式限制本发明，凡是采用等同替换或等效变换的方式获得的技术方案均落在本发明的保护范围内。
序列表
<110> 常熟理工学院
<120> 一种一步法合成L-肌肽的方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1376
<212> DNA
<213> 原鸡(Gallus gallus)
<400> 1
ccatggagcg taagaccgtc ccgcgtctgc tggctgagtg tctgctgcac cgtgcacaat 60
gccacctggt cgagggtaag gacatcctgc tgatcggtgc cggtggcgtc tctaaaagct 120
tcgtctggga ggcggcacgt gagtacggcc tgcgtatcca cctggtggag agcgacccgg 180
agcacttcgc agcaggtctg gtggaaacct tcctgccgta cgacagccgt gaacaccgtc 240
gcgacgaaga acacgccgaa cgcgtgctgg aaatgctgcg cgcccgtggt ctgcgcccag 300
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gccgtcgtct gcgttctcac ggtgacgtgg aacgtgcagc tggtgcagtg ccgttcccgg 540
ctgtagctaa actggaattc ggcgcgggtg ctgttggcgt tcgcctggtt gaaaacgcgg 600
gccagtgcca cgctcacgct gctcaactgt ggcacgacct gcgtgctgac gctgaccatc 660
ctggtatcgg cctgggttgg ggtaacgcta tgctgctgat ggaatacgtt ccgggcaccg 720
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aaattaaccc gcgcatgggc ggcttctacc tgcgcgattg gatgcgcgcg gtatatggcc 1020
cggatctgct gctggcggcc gttctgctgg cgctgggtct gccgccggtt ctgccgtctc 1080
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ccctgcgtgg tggtgtaatg gcggccctgc agggtctgca gcgtcgcggt ctggttcgcc 1200
tgaatccgct gtttgaagaa gcgggtggtc gctatgaaga accgtgtctg tctgttgcct 1260
gtgcgggcga tggcccggcg gaagcgtgcg gccgtctgct gggcctgtgc caggccctgg 1320
gcattgattc tccgcagtat ccggtaggcc attttctgtc ccattttaaa ctcgag 1376
<210> 2
<211> 2067
<212> DNA
<213> 大肠杆菌K-12(mg 1655E.coli K-12 MG 1655)
<400> 2
atgggtcagg aaaagctata catcgaaaaa gagctcagtt ggttatcgtt caatgaacgc 60
gtgcttcagg aagcggcgga caaatctaac ccgctgattg aaaggatgcg tttcctgggg 120
atctattcca ataaccttga tgagttctat aaagtccgct tcgctgaact gaagcgacgc 180
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cgttttgttt atcagcgcga tatgcccaat gcgctggttg aagtgttacg cgaaaaactg 840
actatttccc gctacgactc catcgtcccc ggcggtcgtt atcataattt taaagacttt 900
attaatttcc ccaatgtcgg caaagccaat ctggtgaaca aaccactgcc gcgtttacgc 960
catatttggt ttgataaagc ccagttccgc aatggttttg atgccattcg cgaacgcgat 1020
gtgttgctct attatcctta tcacaccttt gagcatgtgc tggaactgct gcgtcaggct 1080
tcgttcgacc cgagcgtact ggcgattaaa attaacattt accgcgtggc gaaagattca 1140
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gagatcgcca acgcgcagca agggctgccc agtggtatca ccctgaagct aaataacctt 1620
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ctgctggttc gcggaatgtg ttcgctgatc cccaatctgg aaggcattag cgacaacatt 1740
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cgtattgaag tggcgacgcc gctgctcgat ccgcgcctga agcagcgggt actggacatc 1920
atcgacatat tgttcagcga tacggtcaaa gcacgttata tcgataaaga actcagtaat 1980
cgctacgttc cccgcggcaa tcgccgcaaa gtacgggcgc agttggcgat ttatgactac 2040
atcaaatcac tcgaacaacc tgaataa 2067
<210> 3
<211> 456
<212> PRT
<213> 原鸡(Gallus gallus)
<400> 3
Met Gly Ala Leu Thr Val Pro Ala Leu Leu Ala Gly Cys Leu Leu His
1 5 1015
Ala Ala Gly Cys His Leu Val Gly Gly Leu Ala Ile Leu Leu Ile Gly
202530
Ala Gly Gly Val Ser Leu Ser Pro Val Thr Gly Ala Ala Ala Gly Thr
354045
Gly Leu Ala Ile His Leu Val Gly Ser Ala Pro Gly His Pro Ala Ala
505560
Gly Leu Val Gly Thr Pro Leu Pro Thr Ala Ser Ala Gly His Ala Ala
65707580
Ala Gly Gly His Ala Gly Ala Val Leu Gly Met Leu Ala Ala Ala Gly
859095
Leu Ala Pro Ala Ala Cys Leu Ser Thr Thr Ala Ala Cys Val Val Leu
100 105 110
Thr Ala Leu Leu Cys Gly Ala Leu Gly Leu Pro Gly Cys Pro Pro Ala
115 120 125
Ala Val Ala Leu Ala Leu Gly Leu Ser Ala Thr His Gly His Leu Gly
130 135 140
Ala Cys Ala Ala Gly Ala Pro Pro Pro Ala Ala Pro Ser Val Pro Cys
145 150 155 160
Ala Ala Leu Ala Ser His Gly Ala Val Gly Ala Ala Ala Gly Ala Val
165 170 175
Pro Pro Pro Ala Val Ala Leu Leu Gly Pro Gly Ala Gly Ala Val Gly
180 185 190
Val Ala Leu Val Gly Ala Ala Gly Gly Cys His Ala His Ala Ala Gly
195 200 205
Leu Thr His Ala Leu Ala Ala Ala Ala Ala His Pro Gly Ile Gly Leu
210 215 220
Gly Thr Gly Ala Ala Met Leu Leu Met Gly Thr Val Pro Gly Thr Gly
225 230 235 240
His Ala Val Ala Leu Val Leu Pro Gly Gly Ala Leu Leu Gly Ala Thr
245 250 255
Val Ser Ala Ala Gly Pro Thr Ala Val Pro Thr Pro Leu Gly Thr Ala
260 265 270
Ala Thr Leu Pro Ser Cys Leu Pro Ala Ala Ala Gly Ala Gly Leu Val
275 280 285
Ala Ala Ala Leu Ala Cys Cys Ala Ala Cys Gly Leu Ala His Gly Val
290 295 300
Pro Ala Val Gly Leu Leu Leu Ser Pro Ala Gly Pro Ala Leu Leu Gly
305 310 315 320
Ile Ala Pro Ala Met Gly Gly Pro Thr Leu Ala Ala Thr Met Ala Ala
325 330 335
Val Thr Gly Pro Ala Leu Leu Leu Ala Ala Val Leu Leu Ala Leu Gly
340 345 350
Leu Pro Pro Val Leu Pro Ser Ala Pro Ala Pro Ala Gly Gly Leu Ala
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Gly Val Met Cys Leu Ala Ser Gly His Gly Ala Ala Leu Ala Gly Gly
370 375 380
Val Met Ala Ala Leu Gly Gly Leu Gly Ala Ala Gly Leu Val Ala Leu
385 390 395 400
Ala Pro Leu Pro Gly Gly Ala Gly Gly Ala Thr Gly Gly Pro Cys Leu
405 410 415
Ser Val Ala Cys Ala Gly Ala Gly Pro Ala Gly Ala Cys Gly Ala Leu
420 425 430
Leu Gly Leu Cys Gly Ala Leu Gly Ile Ala Ser Pro Gly Thr Pro Val
435 440 445
Gly His Pro Leu Ser His Pro Leu
450 455
一种一步法合成L-肌肽的方法及截短的L-肌肽合成酶专利购买费用说明
Q：办理专利转让的流程及所需资料
A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。
1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。
2：按规定缴纳著录项目变更手续费。
3：同时提交相关证明文件原件。
4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。
Q:专利著录项目变更费用如何缴交
A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式
Q：专利转让变更，多久能出结果
A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。
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