专利摘要

本发明公开了蛋白拨动开关的构建及其在混合糖发酵生产木糖酸的应用，属于生物工程技术领域。本发明构建的蛋白水平拨动开关，由于调控发生在蛋白水平，原理是蛋白酶触发的切割和诱导降解，其响应时间短，调控精度高。利用本策略，当底物中葡萄糖与木糖浓度比值大于1时，可以有效缓解碳代谢阻遏现象。当葡萄糖：木糖的比例为2:1时，引入拨动开关可较对照组提高木糖酸产量0.79倍。利用该工具，以廉价纤维素水解液为底物生产高附加值化学品时具有较好的应用前景。

权利要求

1.一种蛋白拨动开关，其特征在于，包括靶蛋白a、靶蛋白b、蛋白酶A和蛋白酶B，所述靶蛋白a的N末端修饰有特异性的蛋白酶A的识别位点和蛋白降解子；所述靶蛋白b的N末端修饰有特异性的蛋白酶B的识别位点和蛋白降解子，所述蛋白酶A的N末端修饰有特异性的蛋白酶B的识别位点和蛋白降解子；其中，所述蛋白酶A切割降解靶蛋白a，所述蛋白酶B切割降解靶蛋白b；靶蛋白a为木酮糖激酶xylB，靶蛋白b为PTS系统的关键酶ptsI；所述蛋白酶A为TVMVp，蛋白酶B为TEVp。

2.一种基因工程菌株，其特征在于，以敲除或沉默编码木糖异构酶的基因XylA、编码木酮糖激酶的基因XylB和编码PTS系统的ptsI基因的E. coli BL21(DE3)为宿主，表达了含有pTet-tev和pTrcHisA-(tvF)CcxylB-(teF)tvmv-(teF)ptsI的过表达质粒。

3.一种在混合糖底物条件下生产木糖酸的方法，其特征在于，是应用权利要求2所述的基因工程菌株进行发酵，所述混合糖为木糖和葡萄糖。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，葡萄糖与木糖的浓度比值不低于1。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，发酵条件为：将基因工程菌接种到LB培养基中，36-38℃，200-220rpm，培养8-14 h；以1-10%的接种量将得到的种子培养液接种于TB培养基中，在36-38℃条件下恒温发酵，200-220 rpm发酵。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，在发酵起始时加入0.1-0.5 mM IPTG诱导，诱导6-10 h，当发酵液中细胞浓度达OD600=0.6-0.8时，再加180-220ng/mL脱水四环素进行诱导。

7.权利要求1所述的蛋白拨动开关或权利要求3所述的基因工程菌在生产木糖中的应用。

说明书

技术领域

本发明涉及蛋白拨动开关的构建及其在混合糖发酵生产木糖酸的应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

拨动开关是一大类代谢调控开关，它们的共同特点是能够随环境(诱导剂或其他感应底物)的改变来控制基因表达。2000年，Gardner等描述了一种构建在质粒上的拨动开关，它可以在两个启动子表达之间来回拨动来应答外部信号。开关由两个抑制子和两个保守的启动子组成。每个启动子都会被另一个启动子表达的抑制子所抑制。这样通过控制诱导剂的有无来控制开关在“开”和“关”之间切换，从而控制下游基因的表达。Kobayashi等设计了一个由PL启动子、Ptrc启动子、lacI基因和λcl基因组成的拨动开关。在Kobayashi等的开关的基础上，Anesiadis等设计出了感应群体密度的拨动开关。细胞间的交流是通过一群信号分子完成的，它们是自诱导物。高丝氨酸内酯(AHL)就是一个这样的自诱导物，它的浓度跟环境中的细胞数量成一定比例。将AHL的表达基因设计到拨动开关中，就构建成了感应群体密度的拨动开关。菌体密度决定AHL浓度，AHL浓度决定LacI表达，进而决定目的基因表达。这实现了基因表达的动态调节，解决了因为基因敲除而影响细胞生长，进而影响产量的问题。例如，Tsuruno等将拨动开关应用于生产3-羟基丙酸，获得了比传统敲除方法更高的产量和产率。

综上所述，拨动开关是一类非常重要的代谢流调控工具，具有广泛的用途。然而，现有的拨动开关的调控方式都集中于在转录水平的上的调节，即通过调节目标路径酶的转录表达水平，控制代谢流的变化。在生产某些特定化学品时，合成路径与菌体中心代谢高度耦合，利用转录水平控制调节目标路径的流量的同时，会对菌株的生理产生很大的影响。为了克服上述问题，需要在不改变目标化合物合成路径转录强度的同时，直接调节路径酶的蛋白浓度水平。蛋白水平的拨动开关具有不影响目标代谢路径的表达的优势，但是目前蛋白水平上的拨动开关工具鲜有报道。

木糖酸是一种重要的化工中间体，可用于pH调节剂、水泥粘结剂等，在美国能源部的报告中，木糖酸被列为了30种最具前景的生物砌块化合物之一。目前利用工程大肠杆菌生物法生产木糖酸，主要使用纯木糖为底物进行发酵。如申请号为CN201210539717.4的发明专利中采用30g/L D-木糖为底物进行发酵，发酵48h可生产27.3g/L木糖酸。采用纯木糖为底物进行发酵，极大地增加了产品的生产成本。然而在使用低价值的纤维素水解液(富含葡萄糖、木糖)发酵生产木糖酸时，底物中高浓度的葡萄糖会极大影响大肠杆菌对木糖的摄取利用。这种现象被称为代谢物阻遏效应(CCR)，即当发酵体系中含有优先利用的碳源(葡萄糖)，菌株会优先利用葡萄糖，阻止次优先利用碳源(木糖)的摄入。目前，有以玉米穗轴水解液为底物生产木糖酸的研究，但是其转化体系中使用的木糖含量远高于葡萄糖含量(40g/L木糖+4g/L葡萄糖)。而文献报道稻壳水解液中含有32.04g/L木糖+51.57g/L葡萄糖(Chang,Z.；Liu,D.；Yang,Z.；Wu,J.；Zhuang,W.；Niu,H.；Ying,H.Efficient XylitolProduction from Cornstalk Hydrolysate Using Engineered Escherichia coli WholeCells.J Agric Food Chem 2018,66(50),13209.)。因此在目前的实际发酵生产中，为了维持细胞稳态，木糖酸发酵体系需要补充葡萄糖，但是葡萄糖的浓度必须控制在较低的浓度，以避免产生CCR现象，影响菌体对木糖的摄入。如在Huaiwei Liu等发表于BioresourceTechnology的研究中(参见文献：Liu,H.；Valdehuesa,K.N.；Nisola,G.M.；Ramos,K.R.；Chung,W.J.High yield production of D-xylonic acid from D-xylose usingengineered Escherichia coli.Bioresour Technol 2012,115,244.)，木糖酸的发酵中会持续补加终浓度为0.4-0.8g/L的葡萄糖，该工艺较复杂，成本较高。因此，开发一种能在木糖、葡萄糖混合糖体系中可人为调节细菌对不同底物利用情况的工具，对以廉价纤维素水解液为底物生产木糖酸的研究具有重要意义。

发明内容

在靶蛋白的N末端利用融合表达的形式添加上蛋白降解子和蛋白酶识别切割短肽，当蛋白酶不表达时，靶蛋白可以在细菌胞内稳定存在，行使生物活性。当蛋白酶表达时，其识别并切割特异性的蛋白酶识别短肽，使原本隐藏的蛋白降解子裸露在靶蛋白的N末端。由于细菌普遍具有N端降解机制，裸露蛋白降解子的靶蛋白将会被胞内的蛋白降解机器识别并最终降解为短肽，无法行使生物活性。

为了构建拨动开关，本发明提出了蛋白酶级联降解的策略，即利用蛋白酶降解蛋白酶的思路来调控胞内蛋白酶及靶蛋白的丰度。具体操作包括：首先，在第一层调控中，靶蛋白a的N末端被修饰上特异性的蛋白酶A的识别位点和蛋白降解子，靶蛋白b的N末端被修饰上特异性的蛋白酶B的识别位点和蛋白降解子，同时在蛋白酶A的N末端被修饰上特异性的蛋白酶B的识别位点和蛋白降解子，当共表达上述三种蛋白质时，靶蛋白a由于被蛋白酶A切割降解，胞内丰度降低。而靶蛋白b保持稳定，具备生物活性。当进一步表达蛋白酶B时，蛋白酶A和靶蛋白b被降解，靶蛋白a得以在胞内积累，重新行使生物活性。

本发明的第一个目的是提供一种蛋白水平拨动开关，包括靶蛋白a、靶蛋白b、蛋白酶A和蛋白酶B，所述靶蛋白a的N末端修饰有特异性的蛋白酶A的识别位点和蛋白降解子；所述靶蛋白b的N末端修饰有特异性的蛋白酶B的识别位点和蛋白降解子，所述蛋白酶A的N末端修饰有特异性的蛋白酶B的识别位点和蛋白降解子；其中，所述蛋白酶A切割降解靶蛋白a，所述蛋白酶B切割降解靶蛋白b。

在本发明的一种实施方式中，所述的蛋白酶包括烟草蚀刻病毒蛋白酶TEVp、烟草静脉斑驳病毒蛋白酶TVMVp、向日葵温和花叶病毒蛋白酶SuMMVp或丙型肝炎病毒蛋白酶HICVp。

在本发明的一种实施方式中，靶蛋白a为木酮糖激酶xylB，靶蛋白b为PTS系统的关键酶ptsI，蛋白酶A为TVMVp，蛋白酶B为TEVp。

本发明的第二个目的是提供一种基因工程菌株，是在敲除或沉默编码木糖异构酶的基因XylA、编码木酮糖激酶的基因XylB和编码PTS系统的ptsI基因的E.coli BL21(DE3)中表达了含有pTet-tev和pTrcHisA-(tvF)CcxylB-(teF)tvmv-(teF)ptsI的过表达质粒。

所述pTet-33tev质粒(GenBank accession number：MK238517)，含有六个突变点(T17S,L56V,N68D,I77V,S135G,S219V)的TEVp突变体，TEVp可降解PTS系统的关键酶ptsI。

所述的pTrcHisA-(tvF)CcxylB-(teF)tvmv-(teF)ptsI质粒(GenBank accessionnumber：MK258728)含有三个基因，依次分别为含有蛋白酶TVMVp识别位点和苯丙氨酸降解子F的来源新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)木糖脱氢酶基因CcxylB、含有蛋白酶TEVp识别位点和苯丙氨酸降解子F的蛋白酶基因tvmv、含有蛋白酶TEVp识别位点和苯丙氨酸降解子F的编码PTS系统的ptsI基因。

本发明的第三个目的是提供一种在混合糖底物条件下生产木糖酸的方法，是应用上述基因工程菌株进行发酵。

在本发明的一种实施方式中，所述的混合糖为木糖和葡萄糖的混合体系，葡萄糖与木糖的浓度比值不低于1，其目的是模拟纤维素水解液中葡萄糖和木糖的比例。

在本发明的一种实施方式中，葡萄糖与木糖的浓度比值为1-5。

在本发明的一种实施方式中，发酵条件为：将基因工程菌接种到LB培养基中，36-38℃，200-220rpm，培养8-14h；以1-10％的接种量将得到的种子培养液接种于TB培养基中，在36-38℃条件下恒温发酵，200-220rpm发酵。

在本发明的一种实施方式中，在发酵起始时加入0.1-0.5mM IPTG诱导，诱导6-10h，当发酵液中细胞浓度达OD600＝0.6-0.8时，再加180-220ng/mL脱水四环素进行诱导。

本发明还提供所述蛋白拨动开关或基因工程菌在食品、制药和化工领域的应用。

有益效果：本发明构建的蛋白水平拨动开关，由于调控发生在蛋白水平，原理是蛋白酶触发的切割和诱导降解，其响应时间短，调控精度高。利用本策略，当底物中葡萄糖与木糖浓度比值大于1时，可以有效缓解碳代谢阻遏现象。当葡萄糖：木糖的比例为2:1时，引入拨动开关可较对照组提高木糖酸产量0.79倍。利用该工具，以廉价纤维素水解液为底物生产高附加值化学品时具有较好的应用前景。

附图说明

图1：蛋白酶TEVp和TVMVp的正交切割测试。

图2：蛋白酶级联降解测试。

图3：蛋白拨动开关应用混合糖发酵生产木糖酸的原理图。

图4：诱导剂添加时间优化。

图5：不同底物比例条件下木糖酸发酵比较。

具体实施方式

发酵样品制备：取发酵液样品，离心机12,000g离心5min，取上清液经一定倍数稀释后，过0.22.m水系膜过滤，滤液作为用来液相色谱分析。

木糖酸含量的测定：戴安高效液相色谱仪(配紫外可见检测器)，采用伯乐AminexHPX-87H(300×7.8mm，9μm)色谱柱，流动相为浓度0.005M的H₂SO₄，流动相经0.22μm滤膜过滤，超声脱气，流速为0.6mL/min，柱温为35℃，在紫外检测波长210nm下检测。

种子培养基成分：LB培养基，成分包含蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L。

发酵培养基成分：TB培养基，具体成分包括酵母提取物24g/L，蛋白胨12g/L，磷酸氢二钾9.4g/L，磷酸二氢钾2.2g/L。灭菌后添加葡萄糖10-20g/L、木糖10g/L。

E.coli BL21(DE3)中编码木糖异构酶的基因XylA、编码木酮糖激酶的基因XylB和编码PTS系统的ptsI基因的整段敲除通过CRISPR-Cas9技术实现。

实施例1：蛋白酶正交实验

分别在报告基因的N末端添加蛋白酶TEVp和TVMVp的识别位点和苯丙氨酸降解子。将上述报告质粒分别与蛋白酶TEVp和TVMVp进行共表达，共构建出四种菌株。

在LB培养基中，分别培养上述菌株，当菌体细胞浓度达到0.8时，添加诱导剂。继续培养12h后，使用SpectraMax M3微孔板酶标仪进行荧光测定。如图1所示，仅当蛋白酶与相应的还有蛋白酶识别位点的报告蛋白共表达时，荧光强度才会出现显著下降，说明蛋白酶的切割作用具有特异性。

实施例2：蛋白酶级联降解实验

为了验证蛋白酶是否具有级联降解能力，以mCherry红色荧光蛋白为报告蛋白，在其N末端融合表达含有TVMVp蛋白识别切割短肽和苯丙氨酸降解子F，获得(tvF)mCherry。同时，构建N末端含有TEVp蛋白识别切割短肽和苯丙氨酸降解子F的蛋白酶TVMVp，获得(teF)TVMVp及N末端无基因修饰的蛋白酶TEVp。将上述检测菌株置于LB培养基中培养，使用SpectraMax M3微孔板酶标仪进行连续荧光测定。如图2所示，当共表达(tvF)mCherry和(teF)TVMVp时，荧光强度低，说明报告蛋白被有效切割降解。进一步地，当共表达TEVp，(tvF)mCherry和(teF)TVMVp时，荧光出现了积累，表明(teF)TVMVp被TEVp降解，原本被切割降解的(tvF)mCherry得以重新积累表达。

实施例3：木糖酸底盘生产菌株的构建

如图3所示，以E.coli BL21(DE3)为底盘微生物，组合敲除编码木糖异构酶的基因XylA和编码木酮糖激酶的基因XylB。工程菌株无法利用单一木糖为碳源进行生长。进一步地，在上述工程菌株的基础上，敲除PtsI基因，该菌株由于阻断了葡萄糖转运系统，不能以葡萄糖或木糖为碳源进行生长。以敲除编码木糖异构酶的基因XylA、编码木酮糖激酶的基因XylB和编码PTS系统的ptsI基因的E.coli BL21(DE3)为宿主。

蛋白拨动开关应用混合糖发酵生产木糖酸的原理是在混合糖(葡萄糖和木糖)为底物的条件下，首先添加IPTG诱导剂，在宿主中表达pTrcHisA-(tvF)CcxylB-(teF)tvmv-(teF)ptsI，TVMVp被表达，保证PTS系统的关键酶ptsI稳定存在，木糖脱氢酶被降解，使细胞仅利用葡萄糖进行生物量合成，不进行产物的合成。当菌株的生物量增加到一定阶段后，添加诱导剂脱水四环素，表达pTet-33tev，另外一种蛋白酶TEVp被表达，使ptsI开始降解，木糖脱氢酶积累。葡萄糖的利用途径被阻断，木糖进入细胞开始进行产物合成。

实施例4：引入蛋白拨动开关测试混合糖发酵木糖酸

首先优化诱导剂脱水四环素的添加时间。如图4所示，分别在菌株培养4h，6h，8h和10h后添加终浓度为200ng/mL脱水四环素。结果表明当菌株培养6h后添加诱导剂，木糖酸的产量最高。

在不同葡萄糖和木糖比例条件下，分别测试了引入拨动开关的实验组和不引入拨动开关的对照组发酵木糖酸的情况。如图5所示，当葡萄糖：木糖＝0.5时，实验组由于存在多个蛋白酶表达，菌株产生了代谢负荷，木糖酸的积累量低于对照组。然而随着葡萄糖：木糖的比例增大，碳代谢阻遏效应开始变得显著，在相同木糖浓度情况下，对照组的木糖酸的产量出现了显著的下降。相反，实验组由于消除了碳代谢阻遏效应，木糖酸的产量基本维持不变。最终当发酵培养基中葡萄糖：木糖＝2时，对照组发酵48h仅能积累2.37g/L木糖酸，而实验组可以积累4.25g/L木糖酸，产量提高了79％。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

蛋白拨动开关的构建及其在混合糖发酵生产木糖酸的应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。