专利摘要

本发明公开一种蛋白突变体及含有该蛋白突变体编码基因的重组菌株，是通过在MviN蛋白的氨基酸序列的特定位点引入氨基酸突变，改善了棒杆菌产谷氨酸、赖氨酸的能力，葡萄糖转化率大大提高。

权利要求

1.一种跨膜脂质II翻转酶（MviN）蛋白突变体，其特征在于，所述蛋白突变体的氨基酸序列是仅在对应于SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO: 8任一所示氨基酸序列的第346位脯氨酸被亮氨酸取代，或者仅在对应于SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO: 8任一所示氨基酸序列的第599位缬氨酸被苯丙氨酸取代。

2.如权利要求1所述MviN蛋白突变体的编码基因。

3.包含权利要求2所述的编码基因的表达载体。

4.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞表达权利要求1所述的MviN蛋白突变体，或者含有权利要求2所述的编码基因。

5.根据权利要求4所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有所述MviN蛋白突变体编码基因的表达载体, 或者在所述宿主细胞的基因组中整合有编码所述MviN蛋白突变体的基因。

6.根据权利要求4或5所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞来源于棒状杆菌属。

7.如权利要求1所述的MviN蛋白突变体、权利要求2所述的编码基因、权利要求3所述的表达载体、权利要求4或权利要求5所述的宿主细胞在生产谷氨酸或赖氨酸中的应用。

8.一种制备谷氨酸或赖氨酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：

a)将MviN蛋白突变体的编码基因导入到产谷氨酸的谷氨酸棒杆菌中，或者导入到产赖氨酸的谷氨酸棒杆菌中，构建权利要求4-6任一所述的宿主细胞；

b)培养步骤a构建的宿主细胞，使之产生含谷氨酸或赖氨酸的培养液；和

c)任选从步骤b的培养液中分离产生的谷氨酸或赖氨酸。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体地涉及跨膜脂质II翻转酶（MviN）的突变体，以及突变体在生产谷氨酸、赖氨酸方面的应用。

背景技术

谷氨酸、赖氨酸是人类和动物的重要营养物质，在医药、健康、食品、动物饲料等行业中有着十分重要的地位，主要采用微生物发酵法来生产。近年来，作为发酵工业的核心，发酵菌种的改造技术不断开发，在某一化合物的合成过程中人们通常对其代谢直接相关途径（包括底物运输、产物运输、能量产生等）进行改造。已有大量研究报道了与氨基酸合成途径密切相关的模块改造，例如解除关键酶的产物反馈抑制、弱化竞争性途径、加强底物或产物运输等，工业生产菌株的产酸能力也因而得到了大幅提高。尽管当前谷氨酸、赖氨酸工业菌株已达到高水平，然而进一步提高菌株产酸水平，特别是提高转化率（原料转化为产物的百分比），降低生产成本的需求仍然很迫切。可是在高水平的谷氨酸、赖氨酸生产菌株上进一步提升，甚至是小幅提升都已经十分困难。

目前针对与氨基酸合成不明显相关的基因的改造比较少。其原因在于，众所周知细胞是一个复杂的代谢网络集合体，对不相关基因的改造对菌株造成的影响是不可预知的；另外从众多的基因中挖掘出与谷氨酸、赖氨酸生产可能相关的改造靶点的难度巨大。

跨膜脂质II翻转酶(MviN)，催化肽聚糖（PG）合成的最后一步，将脂质II从胞质内膜转运到细胞周质间隙，使新生PG交联形成成熟的PG。目前对于棒状杆菌属来源的MviN研究较少，仅有一篇专利（JP2010161970A）公开了该蛋白中的3个氨基酸残基（197位、260位、181位）突变可以提高谷氨酸棒杆菌的谷氨酸产量，但其谷氨酸产量提高幅度很低，与出发菌株相比仅仅提高了1-5%（产物百分比），而对转化率的影响则没有报道。

发明内容

本发明的目的在于提供新的MviN蛋白突变体，以及利用该蛋白突变体显著提高宿主菌株生产谷氨酸、赖氨酸的转化率的方法。

第一方面，本发明提供了一种跨膜脂质II翻转酶（MviN）蛋白突变体，其氨基酸序列包括选自以下的组：

a）所述氨基酸序列在对应于SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO:6或SEQID NO: 8任一所示氨基酸序列的第346位脯氨酸被亮氨酸取代，或被其他脂肪烃侧链氨基酸例如异亮氨酸、缬氨酸或丙氨酸中的任一种所取代；或者

b)所述氨基酸序列在对应于SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO:6或SEQID NO: 8任一所示氨基酸序列的第599位缬氨酸被苯丙氨酸或色氨酸取代。

在一个实施方式中，所述MviN蛋白突变体进一步包括或不包括其他位点的突变。例如，所述MviN蛋白突变体包括来自于上述氨基酸序列的保守性突变，并且所述MviN蛋白突变体保持脂质II从胞质内膜转运到细胞周质间隙的活性。

第二方面，本发明提供了第一方面所述的MviN蛋白突变体的编码基因。

第三方面，本发明提供了包括第二方面所述的MviN蛋白突变体编码基因的表达载体；在一个实施方式中，所述表达载体是将编码基因的核苷酸序列与质粒相连构建而成，例如所述质粒选自pEC-XK99E。

第四方面，本发明提供了一种表达第一方面所述的MviN蛋白突变体的宿主细胞。

在优选的实施方式中，表达所述突变体的宿主细胞包含第三方面所述的表达载体或在其基因组中整合有第二方面所述的编码基因的核苷酸序列。在一个实施方式中，将所述表达载体导入原始宿主细胞中，形成含有所述突变体编码基因的宿主细胞。

在进一步优选的实施方式中，所述原始宿主细胞来自埃希氏菌属(Escherichia)、棒状杆菌属（Corynebacterium）、泛菌属（Pantoea）、短杆菌属（Brevibacterium sp）、芽孢杆菌属（Bacillus）、克雷伯氏菌属（Klebsiella）、沙雷氏菌属（Serratia）或弧菌属（Vibrio）。优选大肠杆菌（E. Coli）或谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum），更优选谷氨酸棒状杆菌（Corynebacteriumglutamicum）。

第五方面，本发明提供第一方面所述的MviN蛋白突变体、或第二方面所述的编码基因、或第三方面所述的表达载体、或第四方面所述的宿主细胞在生产谷氨酸、赖氨酸中的应用。

在第六方面，本发明提供一种制备谷氨酸或赖氨酸的方法，所述方法包括以下步骤：

a. 构建第四方面所述的宿主细胞；

b. 培养步骤a构建的宿主细胞，使之产生含谷氨酸或赖氨酸的培养液；和

c. 任选从步骤b的培养液中分离产生的谷氨酸或赖氨酸。

本发明的有益效果

1.本发明提供了新的MviN蛋白突变体，所述突变体经特定位点的氨基酸突变，能提高谷氨酸、赖氨酸的产量并显著提高葡萄糖转化率。

本发明提供了新的MviN蛋白的改造靶点，能提高菌株的生长速度，降低谷氨酸、赖氨酸的生产成本。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册（New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）中所述的条件，或按照设备制造厂商所建议的条件。

定义与说明：

本文所用的术语“跨膜脂质II翻转酶”和“膜蛋白”、“murein biosynthesisprotein”、“MviN蛋白”、“本发明的蛋白”、“本发明的多肽”可互换使用，并具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

本发明的“MviN蛋白”是指一种跨膜脂质II翻转酶，催化肽聚糖（PG）合成的最后一步，将脂质II从胞质内膜转运到细胞周质间隙。MviN蛋白可以来源于各种物种，包括但不限于埃希氏菌属（Escherichia）、棒状杆菌属（Corynebacterium）、泛菌属（Pantoea）、短杆菌属（Brevibacterium）、芽孢杆菌属（Bacillus）、克雷伯氏菌属（Klebsiella）、沙雷氏菌属（Serratia）或弧菌属（Vibrio）。关于本发明，MviN蛋白来源于棒状杆菌属，如SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO: 8所示任一氨基酸序列对应的蛋白；也可以是含有SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO: 8所示任一氨基酸序列且具有将脂质II从胞质内膜转运到细胞周质间隙活性的多肽；还可以是与SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO: 8所示任一氨基酸序列同源性大于90%，优选95%，更优选98%以上来源于棒状杆菌属且具有将脂质II从胞质内膜转运到细胞周质间隙活性的多肽。

本发明的“MviN蛋白突变体”是指通过对氨基酸序列如SEQ ID NO: 2或SEQ IDNO: 4或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO: 8所示任一氨基酸序列进行突变获得。具体地说，本发明的MviN蛋白突变体是氨基酸序列在对应于SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO: 8所示任一氨基酸序列的第346位脯氨酸被亮氨酸取代，或者在对应于SEQID NO: 2或SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO: 8所示任一氨基酸序列的第599位缬氨酸被苯丙氨酸取代；或者本发明的MviN蛋白突变体是包括上述突变位点的氨基酸序列的片段。关于本发明，也可以是含有SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO:6或SEQ IDNO: 8所示任一氨基酸序列且具有将脂质II从胞质内膜转运到细胞周质间隙活性的多肽；还可以包括与SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO: 8所示任一氨基酸序列同源性大于90%，优选95%，最优选98%以上来源于谷氨酸棒杆菌且具有将脂质II从胞质内膜转运到胞质周间隙活性的多肽，只要其在对应于SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO: 8所示任一氨基酸序列的第346位脯氨酸被亮氨酸取代，或在对应于SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO: 8所示任一氨基酸序列的第599位缬氨酸被苯丙氨酸取代，也在本发明的范围内。

目前，NCBI数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中已经公布的来源于谷氨酸棒杆菌的“跨膜脂质II翻转酶”（数据库中部分序列注释为假定蛋白或者膜蛋白）的氨基酸序列共有22条，其中仅一条序列与本发明的SEQ ID NO: 2所示序列的同源性为93%，其余21条序列与本发明的SEQ ID NO: 2所示序列的同源性均大于98%；并且，全部的22条序列在对应于SEQ ID NO: 2所示序列的第346位均为脯氨酸，在对应于SEQ ID NO: 2所述序列的第599位均为缬氨酸。可见，在谷氨酸棒杆菌中，跨膜脂质II翻转酶是高度保守的，且在对应于SEQ ID NO: 2所示序列的第346位或第599位也是高度保守的。进一步，本发明对来源于谷氨酸棒杆菌的4条“跨膜脂质II翻转酶”序列进行了改造，结果显示，将这4条中的任一条序列的第346位脯氨酸突变为亮氨酸，或将第599位缬氨酸突变为苯丙氨酸，均能够提高谷氨酸、赖氨酸的产量并显著提高葡萄糖转化率。因此，基于以上原因，其他与SEQ ID NO: 2所示序列同源性大于98%且来源于谷氨酸棒杆菌的多肽，只要其在对应于SEQ ID NO: 2所示序列的第346位的脯氨酸被亮氨酸取代，或者在对应于SEQ ID NO: 2所示序列的第599位的缬氨酸被苯丙氨酸取代，均在本发明的保护范围内。

本文所用的术语“宿主细胞”是具有本领域普通技术人员通常理解的含义，即，含有本发明所述MviN蛋白或其突变体的细胞。换言之，本发明可以利用任何宿主细胞，只要所述细胞中含有本发明所述的MviN蛋白或其突变体且能够生产氨基酸的细胞。所述宿主细胞可以来自埃希氏菌属（Escherichia）、棒状杆菌属（Corynebacterium）、泛菌属（Pantoea）、短杆菌属（Brevibacterium sp）、芽孢杆菌属（Bacillus）、克雷伯氏菌属（Klebsiella）、沙雷氏菌属（Serratia）或弧菌属（Vibrio）。优选大肠杆菌（E. Coli）或谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum），最优选谷氨酸棒状杆菌（Corynebacteriumglutamicum）。具体地，本发明所述的宿主是指能够生产谷氨酸、赖氨酸的菌株。

本文所用的术语“含有本发明的MviN”具有本领域技术人员常规理解的含义，并且可以通过本领域已知的方法实施，包括但不限于，如：将包含编码蛋白的多核苷酸序列的多核苷酸插入到染色体上，或将多核苷酸克隆到载体上引入微生物，或在染色体上直接增加该多核苷酸的拷贝等方法来实现，也可以非限制性地包括任何已知的可以引入蛋白活性的方法。

本文所用的术语“具有MviN蛋白的活性”与本领域技术人员常规理解的含义相同或相似，均是指某一片段的氨基酸序列是完整蛋白或多肽的氨基酸序列的一部分，具备与完整蛋白或多肽相同或相似的功能或活性。具体地说，在本发明中，表示从本发明的MviN蛋白获得的具有MviN蛋白具有相同功能的任意氨基酸片段。本领域普通技术人员应当理解，在多肽的某些区域，例如非重要区域改变少数氨基酸残基基本上不会改变生物活性，例如，适当替换某些氨基酸得到的序列并不会影响其活性（可参见Watson等，Molecular Biologyof The Gene，第四版，1987，The Benjamin/Cummings Pub. Co. P224）。因此，本领域普通技术人员能够实施这种替换并且确保所得分子仍具有所需生物活性。因此，对本发明的MviN作进一步突变而得到仍具备MviN功能的进一步突变体是显而易见的。例如，本领域技术人员公知在多肽的任一端增加或减少数个氨基酸残基，例如优选1-20个、更优选1-15个、更优选1-10个、更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基不会影响得到的突变体的功能。例如，为便于纯化，技术人员往往在得到的蛋白的任一端带上6×His标签，而这种蛋白与不具备6×His标签的蛋白具有相同的功能。此外，本发明应包括本发明的MviN的保守性突变体。这些保守性突变体可以根据，例如下表所示进行氨基酸替换而产生。

本发明还提供了编码本发明多肽的多核苷酸。术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

编码MviN蛋白的基因可以是在严格的条件下与SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO:5或SEQ ID NO: 7所示任一核苷酸序列制备的探针，例如与SEQ ID NO: 1或SEQID NO: 3或SEQ ID NO:5或SEQ ID NO: 7所示任一核苷酸序列的部分或者整个序列互补的序列杂交的DNA，只要保持其初始功能即可。所述“严格的条件”是指可形成所谓的特异性杂交且未形成非特异性杂交的条件。例如，同源性较高的DNA，例如具有90%以上同源性的DNA彼此杂交，同源性低于90%的DNA彼此不杂交的条件，或者通常的Southern杂交的清洗条件，即在相当于60℃、1*SSC、0.1%SDS、优选60℃、0.1*SSC、0.1%SDS，更优选68℃、0.1*SSC、0.1%SDS的盐浓度及温度下清洗1次、优选2-3次的条件。

此外，由于密码子的简并性因宿主而异，MviN蛋白的基因中的任意密码子可以用相应的等价密码子替换，也就是说，MviN蛋白基因可以是由于遗传密码的简并性而在上面例如的任何MviN蛋白基因的突变。例如，MviN蛋白基因可以是经修饰的基因，使得其具有根据要使用的宿主中密码子频率的最佳密码子。

在具体的实施方式中，所述MviN蛋白基因可以是与编码SEQ ID NO: 2或SEQ IDNO: 4或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO: 8所示任一氨基酸序列的DNA同源性或序列相同性在90%以上，优选95%以上，更优选99%的DNA。

因此，基于本发明的教导和本发明具体得到的MviN蛋白，本领域技术人员不难得到具有相同或相似活性或功能的活性片段，这样的活性片段可以是将本发明的突变位点（对应于SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO: 8的第346位、第599位）突变成为其他氨基酸残基得到的活性片段，也可以是对本发明所述突变位点（对应于SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO: 8的第346位、第599位）的相邻或相近位点进行突变而得到的活性片段，这样的活性片段应该视为本发明的等同权利而落入本发明的保护范围内。

本文所用的术语“对应于”具有本领域普通技术人员通常理解的意义。具体地说，“对应于”表示两条序列经同源性或序列相同性比对后，一条序列与另一条序列中的指定位置相对应的位置。因此，例如，就“对应于SEQ ID NO:2或SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO:6或SEQID NO: 8所示任一氨基酸序列的第40位的氨基酸残基”而言，如果在SEQ ID NO: 2或SEQID NO: 4或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO: 8所示任一氨基酸序列的一端加上6×His标签，那么所得突变体中对应于SEQ ID NO:2或SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO: 8所示任一氨基酸序列的第40位就可能是第46位。

在具体的实施方式中，所述同源性或序列相同性可以是90%以上，优选95%以上，更优选98%的同源性且来源于棒状杆菌属。

本领域普通技术人员公知的测定序列同源性或相同性的方法包括但不限于：计算机分子生物学（Computational Molecular Biology），Lesk，A.M.编，牛津大学出版社，纽约，1988；生物计算：信息学和基因组项目（Biocomputing:Informatics and GenomeProjects），Smith，D.W.编，学术出版社，纽约，1993；序列数据的计算机分析（ComputerAnalysis of Sequence Data），第一部分，Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编，HumanaPress，新泽西，1994；分子生物学中的序列分析（Sequence Analysis in MolecularBiology），von Heinje，G.，学术出版社，1987；序列分析引物（Sequence AnalysisPrimer），Gribskov，M.与Devereux，J.编M Stockton Press，纽约，1991；和Carillo，H.与Lipman，D.，SIAM J. Applied Math.，48:1073（1988）。测定相同性的优选方法要在测试的序列之间得到最大的匹配。测定相同性的方法编译在公众可获得的计算机程序中。优选的测定两条序列之间相同性的计算机程序方法包括但不限于：GCG程序包（Devereux，J.等，1984）、BLASTP、BLASTN和FASTA（Altschul，S，F.等，1990）。公众可从NCBI和其它来源得到BLASTX程序（BLAST手册，Altschul，S.等，NCBI NLM NIH Bethesda，Md.20894；Altschul，S.等，1990）。熟知的Smith Waterman算法也可用于测定相同性。

实施例：

实施例1、在谷氨酸棒杆菌菌株Z188和B253基因组中引入MviN基因突变

在对产谷氨酸的谷氨酸棒杆菌Z188（GenBank Accession number：NZ_AKXP00000000）进行诱变筛选时，我们获得两株突变菌，基因组测序分析发现，一株突变株对应于Z188的MviN基因核苷酸序列第1037位点的C突变为T（对应的氨基酸在第346位点的P突变为L），另一株突变株对应于其MviN基因核苷酸序列第1795位点的G突变为T（对应的氨基酸在第599位点的V突变为F）。为了测试不同来源MviN的P346L和V599F突变对Z188产谷氨酸和B253（GeneBank accession number CP010451）产赖氨酸的影响，选择了来源于谷氨酸棒杆菌Z188的MviN（命名为MviNZ，核苷酸和氨基酸序列分别为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2），来源于谷氨酸棒杆菌B253的MviN（命名为MviNB，核苷酸和氨基酸序列分别为SEQ IDNO:3和SEQ ID NO:4），来源于谷氨酸棒杆菌ATCC 13869（GeneBank accession numberCP016335）的MviN（命名为MviN9，核苷酸和氨基酸序列分别为SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6），来源于谷氨酸棒杆菌ATCC 13032（GeneBank accession number CP025533）的MviN（命名为MviN2，核苷酸和氨基酸序列分别为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8）。

利用同源重组的方法对Z188和B253的MviN基因进行突变。利用引物MF （SEQ IDNO:9 CCTCGAATTCATGAATGGTCAACAAGTGAGTTCTTC）和引物MR1 （SEQ ID NO:10 TCTACTGCAGTTACCAACCAACGAGTTGTACTTCAG），分别以Z188，B253，ATCC 13869基因组为模板，进行PCR扩增；利用引物MF和引物MR2 （SEQ ID NO:11 TCTACTGCAGTTACCAACCAACAAGTTGTACTTCAG），以ATCC 13032基因组为模板，进行PCR扩增。利用限制性内切酶EcoRI和PstI对PCR片段分别进行双酶切后，分别连接到同样双酶切的质粒pK18mobsacB（GenBank Accession number：FJ437239）上，获得相应质粒pK18-MviNZ，pK18-MviNB，pK18-MviN9，pK18-MviN2。利用引物ATGCTGCGCCGTTTATTTAT（SEQ ID NO:12）和ATAAATAAACGGCGCAGCAT（SEQ ID NO:13），分别以pK18-MviNZ，pK18-MviN9和pK18-MviN2为模板，PCR扩增；利用引物TGATGCTGCACCGTTTATTT（SEQ ID NO:14）和AAATAAACGGTGCAGCATCA（SEQ ID NO:15），以pK18-MviNB为模板，PCR扩增。利用一步法定向克隆试剂盒（The ClonExpress II One Step Cloning kit，南京诺唯赞生物科技有限公司，中国)，将PCR产物分别自连，获得相应质粒上MviN的P346L突变，突变后的质粒分别命名为pK18-MviNZ^P346L，pK18-MviNB^P346L，pK18-MviN9^P346L，pK18-MviN2^P346L。利用引物TCTGCCAGAGGTCCAAAACT（SEQ ID NO:16）和AGTTTTGGACCTCTGGCAGA（SEQ ID NO:17），分别以pK18-MviNZ，pK18-MviNB和pK18-MviN9为模板，PCR扩增；利用引物TTTGCCGGAGGTCCAAAACT（SEQ ID NO:18）和AGTTTTGGACCTCCGGCAAA（SEQ ID NO:19），以pK18-MviN2为模板，PCR扩增。利用一步法定向克隆试剂盒（The ClonExpress II One StepCloning kit，南京诺唯赞生物科技有限公司，中国)，将PCR产物分别自连，获得相应质粒上MviN的V599F突变，突变后的质粒分别命名为pK18-MviNZ^V599F，pK18-MviNB^V599F，pK18-MviN9^V599F，pK18-MviN2^V599F。

将质粒pK18-MviNZ，pK18-MviNB，pK18-MviN9，pK18-MviN2，pK18-MviNZ^P346L，pK18-MviNB^P346L，pK18-MviN9^P346L，pK18-MviN2^P346L，pK18-MviNZ^V599F，pK18-MviNB^V599F，pK18-MviN9^V599F，pK18-MviN2^V599F分别导入Z188和B253感受态中（其中，pK18-MviNZ无需导入Z188中，pK18-MviNB无需导入B253中），利用LBG培养基（葡萄糖10g/L，酵母粉 5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠 10g/L）过夜培养后，在含有卡那霉素（25 mg/L）的LBG固体平板上挑选具有卡那霉素抗性的克隆。挑取克隆后，在含有10 g/L蔗糖的LBG液体培养基中过夜培养，涂布含有10 g/L蔗糖的LBG固体平板，挑选能够生长的克隆，并利用含有卡那霉素（25 mg/L）的LBG固体平板验证其丢失了卡那霉素抗性基因从而无法生长。利用MF和MR1扩增所获克隆的基因，通过测序选择Z188或B253基因组上原有的MviN基因被相应不同来源的MviN及其突变体完全替换的克隆，从而获得菌株Z188-MviNB，Z188-MviN9，Z188-MviN2，Z188-MviNZ^P346L，Z188-MviNB^P346L，Z188-MviN9^P346L，Z188-MviN2^P346L，Z188-MviNZ^V599F，Z188-MviNB^V599F，Z188-MviN9^V599F Z188-MviN2^V599F，以及菌株B253-MviNZ，B253-MviN9，B253-MviN2，B253-MviNZ^P346L，B253-MviNB^P346L，B253-MviN9^P346L，B253-MviN2^P346L，B253-MviNZ^V599F，B253-MviNB^V599F，B253-MviN9^V599F，B253-MviN2^V599F。

实施例2、在谷氨酸棒杆菌菌株Z188和B253中利用质粒过表达不同MviN基因突变体

首先从不同菌株中克隆MviN基因及其突变体。利用引物MV-F （SEQ ID NO:20 CTCGATGGAATTCCGTTAAGGCGCGCACTCGTACATGAATGGTC）和MV-R（SEQ ID NO:21 CGCGGGATCCTTACCAACCAACGAGTTGTACTTCAGCGATC），分别以Z188-MviNZ^P346L，Z188-MviNZ^V599F，B253-MviNB^P346L，B253-MviNB^V599F基因组为模板，PCR扩增，扩增产物分别用EcoRI和BamHI双酶切，然后分别连接到同样用EcoRI和BamHI双酶切的质粒pEC-XK99E 【Kirchner O, Tauch A. JBiotechnol. 2003, 104(1-3): 287-299】上，分别获得pEC-MviNZ^P346L和pEC-MviNZ^V599F，以及pEC-MviNB^P346L和pEC-MviNB^V599F。另外，将EcoRI和BamHI双酶切的质粒pEC-XK99E末端补平后自连，获得不含MviN基因的对照质粒，命名为pEC。将质粒pEC，pEC-MviNZ^P346L和pEC-MviNZ^V599F分别转化到Z188中，获得菌株Z188(pEC)，Z188(pEC-MviNZ^P346L)和Z188 (pEC-MviNZ^V599F)。将质粒pEC，pEC-MviNB^P346L和pEC-MviNB^V599F分别转化到B253中，分别获得菌株B253(pEC)，B253(pEC-MviNB^P346L)和B253(pEC-MviNB^V599F)。

实施例3、谷氨酸棒杆菌Z188及其MviN基因突变菌株发酵产谷氨酸测试

利用96孔板测试Z188菌株，基因组上MviN突变的菌株Z188-MviNB，Z188-MviN9，Z188-MviN2，Z188-MviNZ^P346L，Z188-MviNB^P346L，Z188-MviN9^P346L，Z188-MviN2^P346L，Z188-MviNZ^V599F，Z188-MviNB^V599F，Z188-MviN9^V599F，Z188-MviN2^V599F，以及利用质粒过表达MviNZ突变体的菌株Z188 (pEC-MviNZ^P346L)和Z188 (pEC-MviNZ^V599F)和其对照菌株Z188 (pEC)，发酵产谷氨酸水平。种子培养基为：葡萄糖 50 g/L，磷酸 0.7 g/L，七水硫酸镁 0.8 g/L，硫酸铵 10 g/L，3-(N-玛琳代)丙磺酸 84 g/L，玉米浆粉 3 g/L，尿素 10 g/L，蛋白胨 1 g/L，酵母粉 0.5 g/L，用氢氧化钠调pH为7.0。发酵培养基与种子培养基的区别为发酵培养基中不添加蛋白胨和酵母粉。培养Z188(pEC)，Z188 (pEC-MviNZ^P346L)和Z188 (pEC-MviNZ^V599F)时，加入终浓度为0.1 mM的异丙基硫代半乳糖苷（IPTG），以及终浓度为25 μg/L的卡那霉素。菌株在种子培养基中过夜培养后，以10%的接种量接种到发酵培养基中，96孔板的每个孔中含有150 μL发酵培养基，每个菌株3个平行实验，培养温度为30摄氏度，孔板摇床转速为800 rpm，培养33小时后检测谷氨酸产量和从葡萄糖到谷氨酸的转化率，部分结果如表1和表2所示。由表1和表2可以看出，通过在基因组上引入带有P346L或V599F突变位点的不同来源MviN，以及通过质粒过表达带有P346L或V599F突变位点的MviN，都能够提高菌株产谷氨酸的水平，转化率相对提高15.77-22.29%。另外，相对于Z188、Z188-MviNB，Z188-MviN9以及Z188-MviN2，在基因组上引入含有P346L或V599F点突变的菌株，其产谷氨酸的转化率相对提高9.06-22.18%。

表1 Z188基因组不同突变体的发酵产谷氨酸水平

表2 菌株Z188 (pEC)，Z188 (pEC-MviNZ^P346L)和Z188 (pEC-MviNZ^V599F)发酵产谷氨酸水

平

实施例4、谷氨酸棒杆菌B253及其MviN基因突变菌株发酵产赖氨酸测试

利用96孔板测试B253菌株，基因组上MviN突变的菌株B253-MviNZ，B253-MviN9，B253-MviN2，B253-MviNZ^P346L，B253-MviNB^P346L，B253-MviN9^P346L，B253-MviN2^P346L，B253-MviNZ^V599F，B253-MviNB^V599F，B253-MviN9^V599F，B253-MviN2^V599F，以及利用质粒过表达MviNB突变体的菌株B253 (pEC-MviNB^P346L)、B253 (pEC-MviNB^V599F)和其对照菌株B253 (pEC)发酵产赖氨酸水平。利用LBG作为种子培养基，发酵培养基成份为：葡萄糖 80 g/L；酵母粉 8 g/L；尿素 9 g/L；K₂HPO₄ 1.5 g/L；MnSO₄ 0.01 g/L；MgSO₄ 0.6 g/L；FeSO₄ 0.01 g/L；MOPS 42g/L。培养时B253 (pEC)，B253 (pEC-MviNB^P346L)和B253 (pEC-MviNB^V599F)时加入终浓度为0.1 mM的IPTG，以及终浓度为25 μg/L的卡那霉素。首先将菌株接种到LBG培养基中过夜培养，培养物作为种子接种到每孔含有150 μL发酵培养基的96孔深孔板中，接种量为5%，30℃培养48小时，孔板摇床转速为800 rpm，每个菌株3个平行实验，发酵结束后检测赖氨酸产量和从葡萄糖到赖氨酸的转化率。质粒过表达MviNB突变体菌株测试结果如表3和表4所示。可以看出，通过质粒过表达带有P346L或V599F突变位点的MviN，能够提高菌株产赖氨酸的水平，转化率相对提高7.48%。相对于B253，B253-MviNZ，B253-MviN9以及B253-MviN2，在基因组上引入含有P346L或V599F点突变的菌株，其产赖氨酸的转化率相对提高5.23-8.22%。

表3 B253 (pEC)，B253 (pEC-MviNB^P346L)和B253 (pEC-MviNB^V599F)发酵产赖氨酸水平

表4 B253基因组不同突变体的发酵产赖氨酸水平

以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所

<120> MviN蛋白突变体、含有该突变体的表达载体和宿主细胞及其应用

<130> CPCN19111016

<141> 2019-08-13

<160> 21

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3345

<212> DNA

<213> Corynebacterium

<400> 1

atgaatggtc aacaagtgag ttcttcgctt tcgaataatt cggagcagtc cggcctgcgt 60

agcaggatcg ttgctccagc accgccggcg cctgtgcccg aggcgcgcaa gaaggctgtc 120

gcacgcacgg atggtgatcg ctcgagtttg aaaaactcgc ctacggcatc cgccacccag 180

gcagcccaga cgcgcccggc agaaccggaa ccagaaaagc acacctccga ttctgatgtg 240

gtgcgctcga ctggctccat ggcaatagcc acgctgctga gtcgtatcac cggtttcctg 300

cgcaccgtga tgattggtgc ggcgctgtcg ccggctatcg cgtcggcgtt caacactgcc 360

aacacgctgc ccaacctgat cactgaaatc gtgttgggtg cggtgctgac atcgctggtt 420

attccggtgc ttacccgcgc ggaaaaggaa gacgccgacg gcggttccgg gttcttcagg 480

cggctgctca ccctgtcggt gacgctgctg ggtggtgtca ccatcctgtc gattatcggc 540

gcgccgctgc tgacacggat gatgctgtcc tctgagggac aagtcaacgt ggtcatgtcc 600

acggcctttg cgtattggct gctgccacag attttcttct acggcctgtt tgccctgttc 660

atggctgtgt tgaacacccg tgaagtgttc aaacccggcg cgtgggcacc tgttgtcaac 720

aatgtgatca ccttgaccgt gctgggcgtg tacatggtgc tgcctgcgcg tttgcacccg 780

catgagcagg tgggcatttt tgatccgcag atcgttttcc tcggcgtggg caccaccctt 840

ggtgtggttg cacagtgtct aatcatgatt ccgtacctgc gtcgcgcggg cattgatatg 900

cgcccactgt ggggtatcga tgcgcgtttg aagcagttcg gtggcatggc catggcgatc 960

atcgtgtacg tggcgatctc ccagttcggt tacatcatca ccactcgtat tgcctcactg 1020

gcagacgatg ctgcgccgtt tatttatcag cagcactgga tgttgctgca agttccttat 1080

ggcatcatcg gcgtcacctt gctcaccgcg attatgccgc gactgtcccg caacgcggca 1140

gacggcgatg atagggcagt agtctctgac cttcagttgg gttctaagct aaccttcatc 1200

gcactgatcc ccatcgtggt gtttttcacc gccttcggtg tccctattgc caatggcctt 1260

tttgcctacg gccaattcga tgccaacgcc gccaacatcc ttggttggac tctgagcttc 1320

tctgctttca cgctgattcc ttacgctttg gtgctgctac atctgcgtgt gttttatgcg 1380

cgtgaagagg tctggacccc aaccttcatc atcgccggca tcaccgccac caaggtcgtg 1440

ctgtccctgt tggcaccgct gctctcgagc tccccagagc gcgtagtagt tcttcttggt 1500

gcggccaacg gcttcagttt catcaccggc gcggtcatcg gcgcgtatct gttacgcaag 1560

aaactcggcc tgttgggtat gcgctctttg gctaaaacct ccctgtgggc gttgggctct 1620

gcggcggttg gtgcagcagc agcatgggcg ttggggtggc tgattcaagc cgtcgtgggc 1680

gatttcttgc tgggcactct aagctccgta ggctacttgt tgtacctggc tgtgctgggt 1740

gtcttcttca tcatcgtcac cggcatcgtg ctgtcacgtt ctggtctgcc agaggtccaa 1800

aacttaggcc aggcactgac ccgcatcccg ggtatgggtc gctttattcg cccgaacacc 1860

aagatctctt tggatgtcgg cgaagtctcc cagcaggatt tctccaccca gctggtcgca 1920

ccaagcgagt tctccgcaac ccctgttccg ccaccaatgt ctgccggtat tgtccgcgga 1980

cctcgcctgg ttccgggtgc cccagtcagc gacggtcgct tccgcttgct cgccgatcac 2040

ggcggcgtcc agggtgcgcg tttctggcag gcccgcgaga tcgccaccgg caaggaagtc 2100

gcgctgatct ttgtggatac ttccggcaac gccccatttg cgccactgtc ttcggcagcc 2160

gcagcgggca tcgcctacga ggtgcagcgc cgcaccaaga agctggccag cttgggcagc 2220

ttggcggtgg cccccaatat ccactccgag gcgtaccgca acggttgcct cattgtggcc 2280

gattgggtgc ctggctccag cttgagcgcc gtcgcggaat ccggtgccga tccccgcgcc 2340

gccgcgttcg cgctcgcgga actaactgaa accatcggcg aggcccacga gatgggtatc 2400

ccggccggct tggacaacaa gtgccgcatc cgcatcaaca ccgacggcca tgccgtcctc 2460

gccttcccgg cgattttgcc caatgcctca gagctccgcg acgccaagtc cctggcctcg 2520

gccgccgaga tgcttatcga cgcgaccctc gctcccagcg acgtcaaggc aatggtcact 2580

gaagcccagg ggctagctac agaagacaat cccgattacg catcacttgc catggcgatg 2640

cgcacctgcg gactgttcac cgaggaacca acccaccttg tggtgaagaa ggaaaagaca 2700

ccaaagcctg cgacacgtga tggtttcggt gcctccgact acaccgtcaa gggcatggca 2760

gccatcgccg ctgtggtgat catcttggtc tccctggtgg ctgccggtac cgcgttcctc 2820

accagcttct tcggcagcag caccaacgaa caatccccgt tggcctctgt tgaagccacc 2880

acttctgcaa caccagaacc tgtggggcca ccggtctacc tggatctgga tcaagcccgc 2940

acgtgggatg acggtgcagg aacagatgtc accgacgtca ccgacggcaa cacctccacc 3000

gcatggacct ccaccggcgg cgacggcctc ctagttgacc tgtccacgcc tgcccgcctc 3060

gaccgcgtca tcttgaccac cggcaccggc tccgacagca acgtgacctc gaccgtgaag 3120

atctacgcat tcaacgacgc ctcaccacac tccctgtcgg aaggcatcga gatcggcacc 3180

gtggattatt ccggccgcag tctcagccac agcatccgtg attcctccaa gcttccgggt 3240

caggtggaat ccgtggtgat tctggtcgat gaggttcatt cctcacaaac ctcagacacc 3300

aatccacaga tgcagatcgc tgaagtacaa ctcgttggtt ggtaa 3345

<210> 2

<211> 1114

<212> PRT

<213> Corynebacterium

<400> 2

Met Asn Gly Gln Gln Val Ser Ser Ser Leu Ser Asn Asn Ser Glu Gln

1 5 10 15

Ser Gly Leu Arg Ser Arg Ile Val Ala Pro Ala Pro Pro Ala Pro Val

20 25 30

Pro Glu Ala Arg Lys Lys Ala Val Ala Arg Thr Asp Gly Asp Arg Ser

35 40 45

Ser Leu Lys Asn Ser Pro Thr Ala Ser Ala Thr Gln Ala Ala Gln Thr

50 55 60

Arg Pro Ala Glu Pro Glu Pro Glu Lys His Thr Ser Asp Ser Asp Val

65 70 75 80

Val Arg Ser Thr Gly Ser Met Ala Ile Ala Thr Leu Leu Ser Arg Ile

85 90 95

Thr Gly Phe Leu Arg Thr Val Met Ile Gly Ala Ala Leu Ser Pro Ala

100 105 110

Ile Ala Ser Ala Phe Asn Thr Ala Asn Thr Leu Pro Asn Leu Ile Thr

115 120 125

Glu Ile Val Leu Gly Ala Val Leu Thr Ser Leu Val Ile Pro Val Leu

130 135 140

Thr Arg Ala Glu Lys Glu Asp Ala Asp Gly Gly Ser Gly Phe Phe Arg

145 150 155 160

Arg Leu Leu Thr Leu Ser Val Thr Leu Leu Gly Gly Val Thr Ile Leu

165 170 175

Ser Ile Ile Gly Ala Pro Leu Leu Thr Arg Met Met Leu Ser Ser Glu

180 185 190

Gly Gln Val Asn Val Val Met Ser Thr Ala Phe Ala Tyr Trp Leu Leu

195 200 205

Pro Gln Ile Phe Phe Tyr Gly Leu Phe Ala Leu Phe Met Ala Val Leu

210 215 220

Asn Thr Arg Glu Val Phe Lys Pro Gly Ala Trp Ala Pro Val Val Asn

225 230 235 240

Asn Val Ile Thr Leu Thr Val Leu Gly Val Tyr Met Val Leu Pro Ala

245 250 255

Arg Leu His Pro His Glu Gln Val Gly Ile Phe Asp Pro Gln Ile Val

260 265 270

Phe Leu Gly Val Gly Thr Thr Leu Gly Val Val Ala Gln Cys Leu Ile

275 280 285

Met Ile Pro Tyr Leu Arg Arg Ala Gly Ile Asp Met Arg Pro Leu Trp

290 295 300

Gly Ile Asp Ala Arg Leu Lys Gln Phe Gly Gly Met Ala Met Ala Ile

305 310 315 320

Ile Val Tyr Val Ala Ile Ser Gln Phe Gly Tyr Ile Ile Thr Thr Arg

325 330 335

Ile Ala Ser Leu Ala Asp Asp Ala Ala Pro Phe Ile Tyr Gln Gln His

340 345 350

Trp Met Leu Leu Gln Val Pro Tyr Gly Ile Ile Gly Val Thr Leu Leu

355 360 365

Thr Ala Ile Met Pro Arg Leu Ser Arg Asn Ala Ala Asp Gly Asp Asp

370 375 380

Arg Ala Val Val Ser Asp Leu Gln Leu Gly Ser Lys Leu Thr Phe Ile

385 390 395 400

Ala Leu Ile Pro Ile Val Val Phe Phe Thr Ala Phe Gly Val Pro Ile

405 410 415

Ala Asn Gly Leu Phe Ala Tyr Gly Gln Phe Asp Ala Asn Ala Ala Asn

420 425 430

Ile Leu Gly Trp Thr Leu Ser Phe Ser Ala Phe Thr Leu Ile Pro Tyr

435 440 445

Ala Leu Val Leu Leu His Leu Arg Val Phe Tyr Ala Arg Glu Glu Val

450 455 460

Trp Thr Pro Thr Phe Ile Ile Ala Gly Ile Thr Ala Thr Lys Val Val

465 470 475 480

Leu Ser Leu Leu Ala Pro Leu Leu Ser Ser Ser Pro Glu Arg Val Val

485 490 495

Val Leu Leu Gly Ala Ala Asn Gly Phe Ser Phe Ile Thr Gly Ala Val

500 505 510

Ile Gly Ala Tyr Leu Leu Arg Lys Lys Leu Gly Leu Leu Gly Met Arg

515 520 525

Ser Leu Ala Lys Thr Ser Leu Trp Ala Leu Gly Ser Ala Ala Val Gly

530 535 540

Ala Ala Ala Ala Trp Ala Leu Gly Trp Leu Ile Gln Ala Val Val Gly

545 550 555 560

Asp Phe Leu Leu Gly Thr Leu Ser Ser Val Gly Tyr Leu Leu Tyr Leu

565 570 575

Ala Val Leu Gly Val Phe Phe Ile Ile Val Thr Gly Ile Val Leu Ser

580 585 590

Arg Ser Gly Leu Pro Glu Val Gln Asn Leu Gly Gln Ala Leu Thr Arg

595 600 605

Ile Pro Gly Met Gly Arg Phe Ile Arg Pro Asn Thr Lys Ile Ser Leu

610 615 620

Asp Val Gly Glu Val Ser Gln Gln Asp Phe Ser Thr Gln Leu Val Ala

625 630 635 640

Pro Ser Glu Phe Ser Ala Thr Pro Val Pro Pro Pro Met Ser Ala Gly

645 650 655

Ile Val Arg Gly Pro Arg Leu Val Pro Gly Ala Pro Val Ser Asp Gly

660 665 670

Arg Phe Arg Leu Leu Ala Asp His Gly Gly Val Gln Gly Ala Arg Phe

675 680 685

Trp Gln Ala Arg Glu Ile Ala Thr Gly Lys Glu Val Ala Leu Ile Phe

690 695 700

Val Asp Thr Ser Gly Asn Ala Pro Phe Ala Pro Leu Ser Ser Ala Ala

705 710 715 720

Ala Ala Gly Ile Ala Tyr Glu Val Gln Arg Arg Thr Lys Lys Leu Ala

725 730 735

Ser Leu Gly Ser Leu Ala Val Ala Pro Asn Ile His Ser Glu Ala Tyr

740 745 750

Arg Asn Gly Cys Leu Ile Val Ala Asp Trp Val Pro Gly Ser Ser Leu

755 760 765

Ser Ala Val Ala Glu Ser Gly Ala Asp Pro Arg Ala Ala Ala Phe Ala

770 775 780

Leu Ala Glu Leu Thr Glu Thr Ile Gly Glu Ala His Glu Met Gly Ile

785 790 795 800

Pro Ala Gly Leu Asp Asn Lys Cys Arg Ile Arg Ile Asn Thr Asp Gly

805 810 815

His Ala Val Leu Ala Phe Pro Ala Ile Leu Pro Asn Ala Ser Glu Leu

820 825 830

Arg Asp Ala Lys Ser Leu Ala Ser Ala Ala Glu Met Leu Ile Asp Ala

835 840 845

Thr Leu Ala Pro Ser Asp Val Lys Ala Met Val Thr Glu Ala Gln Gly

850 855 860

Leu Ala Thr Glu Asp Asn Pro Asp Tyr Ala Ser Leu Ala Met Ala Met

865 870 875 880

Arg Thr Cys Gly Leu Phe Thr Glu Glu Pro Thr His Leu Val Val Lys

885 890 895

Lys Glu Lys Thr Pro Lys Pro Ala Thr Arg Asp Gly Phe Gly Ala Ser

900 905 910

Asp Tyr Thr Val Lys Gly Met Ala Ala Ile Ala Ala Val Val Ile Ile

915 920 925

Leu Val Ser Leu Val Ala Ala Gly Thr Ala Phe Leu Thr Ser Phe Phe

930 935 940

Gly Ser Ser Thr Asn Glu Gln Ser Pro Leu Ala Ser Val Glu Ala Thr

945 950 955 960

Thr Ser Ala Thr Pro Glu Pro Val Gly Pro Pro Val Tyr Leu Asp Leu

965 970 975

Asp Gln Ala Arg Thr Trp Asp Asp Gly Ala Gly Thr Asp Val Thr Asp

980 985 990

Val Thr Asp Gly Asn Thr Ser Thr Ala Trp Thr Ser Thr Gly Gly Asp

995 1000 1005

Gly Leu Leu Val Asp Leu Ser Thr Pro Ala Arg Leu Asp Arg Val Ile

1010 1015 1020

Leu Thr Thr Gly Thr Gly Ser Asp Ser Asn Val Thr Ser Thr Val Lys

1025 1030 1035 1040

Ile Tyr Ala Phe Asn Asp Ala Ser Pro His Ser Leu Ser Glu Gly Ile

1045 1050 1055

Glu Ile Gly Thr Val Asp Tyr Ser Gly Arg Ser Leu Ser His Ser Ile

1060 1065 1070

Arg Asp Ser Ser Lys Leu Pro Gly Gln Val Glu Ser Val Val Ile Leu

1075 1080 1085

Val Asp Glu Val His Ser Ser Gln Thr Ser Asp Thr Asn Pro Gln Met

1090 1095 1100

Gln Ile Ala Glu Val Gln Leu Val Gly Trp

1105 1110

<210> 3

<211> 3345

<212> DNA

<213> Corynebacterium

<400> 3

atgaatggtc aacaagtgag ttcttcgctt tcgaataatt cggagcagtc cggcctgcgt

MviN蛋白突变体、含有该突变体的表达载体和宿主细胞及其应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。