专利摘要
公开了检测样品中靶核酸的方法。所述方法包括在聚合酶和核酸内切酶的存在下使所述样品与在足以减少非特异性背景信号扩增的选择位置处具有锁核酸的序列转换寡核苷酸接触。还公开了检测样品中靶核酸的方法，其中在聚合酶和核酸内切酶的存在下使所述样品与序列转换寡核苷酸和信号扩增寡核苷酸接触，序列转换寡核苷酸和信号扩增寡核苷酸二者均在足以减少非特异性背景信号扩增的选择位置处具有锁核酸。本文还提供了包含这种序列转换和信号扩增寡核苷酸的组合物和试剂盒。
权利要求
1.一种试剂在制备用于检测样品中靶核酸的组合物中的用途，所述试剂包含：
第一寡核苷酸，所述第一寡核苷酸在5'至3'方向上包含信号DNA产生序列、核酸内切酶识别位点和包含锁核酸且与所述靶核酸的3'端互补的序列；
第二寡核苷酸，所述第二寡核苷酸在5'至3'方向上包含与所述第一寡核苷酸的信号DNA产生序列同源的信号DNA产生序列、核酸内切酶识别位点和包含锁核酸且与所述第一寡核苷酸的信号DNA产生序列同源的序列；
聚合酶；和
用于切口反应的核酸内切酶；
其中所述锁核酸位于从所述第二寡核苷酸的3'端的位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或其组合处。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述第二寡核苷酸包含2、3或4个锁核酸。
3.根据权利要求2所述的用途，其中所述锁核酸位于从所述第二寡核苷酸的3’端的位置3和6处。
4.根据权利要求1所述的用途，其中所述锁核酸位于发夹结构的茎中。
5.根据权利要求4所述的用途，其中所述茎包含2至10个碱基对。
6.根据权利要求1所述的用途，其中所述与所述靶核酸的3'端互补的序列还包含锁核酸。
7.根据权利要求1所述的用途，其中当将所述组合物用于检测所述靶核酸的方法中时，所述方法在基本恒定的温度下进行，并且其中所述基本恒定的温度在+/-5℃的范围内波动。
8.根据权利要求1所述的用途，其中当将所述组合物用于检测所述靶核酸的方法中时，所述方法在20℃至42℃的温度下进行。
9.根据权利要求1所述的用途，其中所述聚合酶具有链置换活性。
10.根据权利要求1所述的用途，其中所述聚合酶是3'至5'核酸外切酶缺乏的、5'至3'核酸外切酶缺乏的或者二者。
11.根据权利要求1所述的用途，其中所述聚合酶包含选自由如下组成的组中的DNA聚合酶：从大肠杆菌获得的DNA聚合酶I的Klenow片段、从嗜热脂肪芽孢杆菌获得的5'至3'核酸外切酶缺乏型Bst DNA聚合酶、和从热坚芽孢杆菌获得的5'至3'核酸外切酶缺乏型BcaDNA聚合酶。
12.根据权利要求1所述的用途，其中所述核酸内切酶是选自由Nb.BbvCI、Nt. AlwI、Nt.BbvCI和Nt.BsmAI所组成的组中的酶。
13.根据权利要求1所述的用途，其中所述靶核酸是微RNA。
14.根据权利要求1所述的用途，其中所述靶核酸来源于感染物。
15.一种用于检测样品中靶核酸的组合物，所述组合物包含：
第一寡核苷酸，所述第一寡核苷酸在5’至3’方向上包含信号DNA产生序列、核酸内切酶识别位点和包含锁核酸且与所述靶核酸的3’端互补的序列；
第二寡核苷酸，所述第二寡核苷酸在5’至3’方向上包含与所述第一寡核苷酸的信号DNA产生序列同源的信号DNA产生序列、核酸内切酶识别位点和包含锁核酸且与所述第一寡核苷酸的信号DNA产生序列同源的序列；
其中所述锁核酸位于从所述第二寡核苷酸的3’端的位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或其组合处。
16.根据权利要求15所述的组合物，其中所述锁核酸位于从所述第二寡核苷酸的3’端的位置3和6处。
17.根据权利要求15所述的组合物，其中所述锁核酸位于发夹结构的茎中。
18.根据权利要求17所述的组合物，其中所述茎包含2至10个碱基对。
19.根据权利要求15所述的组合物，其中所述与所述靶核酸的3’端互补的序列还包含锁核酸。
20.根据权利要求15所述的组合物，其还包含聚合酶和用于切口反应的核酸内切酶。
21.根据权利要求20所述的组合物，其中所述聚合酶具有链置换活性。
22.根据权利要求20所述的组合物，其中所述聚合酶是3’至5’核酸外切酶缺乏的、5’至3’核酸外切酶缺乏的或者二者。
23.根据权利要求20所述的组合物，其中所述聚合酶包含选自由如下组成的组中的DNA聚合酶：从大肠杆菌获得的DNA聚合酶I的Klenow片段、从嗜热脂肪芽孢杆菌获得的5’至3’核酸外切酶缺乏型Bst DNA聚合酶、和从热坚芽孢杆菌获得的5’至3’核酸外切酶缺乏型BcaDNA聚合酶。
24.根据权利要求20所述的组合物，其中所述核酸内切酶是选自由Nb.BbvCI、Nt.AlwI、Nt.BbvCI和Nt.BsmAI所组成的组中的酶。
25.根据权利要求15所述的组合物，其中所述靶核酸是微RNA。
26.根据权利要求15所述的组合物，其中所述靶核酸来源于感染物。
27.一种用于检测样品中靶核酸的试剂盒，所述试剂盒包含：
第一寡核苷酸，所述第一寡核苷酸在5’至3’方向上包含信号DNA产生序列、核酸内切酶识别位点和包含锁核酸且与所述靶核酸的3’端互补的序列；和
第二寡核苷酸，所述第二寡核苷酸在5’至3’方向上包含与所述第一寡核苷酸的信号DNA产生序列同源的信号DNA产生序列、核酸内切酶识别位点和包含锁核酸且与所述第一寡核苷酸的信号DNA产生序列同源的序列；
其中所述锁核酸位于从所述第二寡核苷酸的3’端的位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或其组合处。
28.根据权利要求27所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包含聚合酶。
29.根据权利要求27或28所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包含用于切口反应的核酸内切酶。
30.根据权利要求27所述的试剂盒，其中所述第二寡核苷酸包含两个位于从所述第二寡核苷酸的3’端的位置3和6处的锁核酸。
31.根据权利要求27所述的试剂盒，其中所述锁核酸位于发夹结构的茎中。
32.根据权利要求31所述的试剂盒，其中所述茎包含2至10个碱基对。
33.根据权利要求27所述的试剂盒，其中所述与所述靶核酸的3’端互补的序列还包含锁核酸。
34.根据权利要求28所述的试剂盒，其中所述聚合酶是具有链置换活性的DNA 聚合酶。
35.根据权利要求28所述的试剂盒，其中所述聚合酶是3’至5’核酸外切酶缺乏的、5’至3’核酸外切酶缺乏的或者二者。
36.根据权利要求28所述的试剂盒，其中所述聚合酶选自由如下组成的组中：从大肠杆菌获得的DNA聚合酶I的Klenow片段、从嗜热脂肪芽孢杆菌获得的5’至3’核酸外切酶缺乏型Bst DNA聚合酶、和从热坚芽孢杆菌获得的5’至3’核酸外切酶缺乏型Bca DNA聚合酶。
37.根据权利要求29所述的试剂盒，其中所述核酸内切酶是选自由Nb.BbvCI、Nt.AlwI、Nt.BbvCI和Nt.BsmAI所组成的组中的酶。
38.根据权利要求27所述的试剂盒，其中所述靶核酸是微RNA。
39.根据权利要求27所述的试剂盒，其中所述靶核酸来源于感染物。
40.根据权利要求27所述的试剂盒，其还包含使用说明书。
41.一种化学修饰的寡核苷酸，其在5'至3'方向上包含与已知的信号DNA序列互补的第一序列、核酸内切酶识别位点和与第一序列相同的已知信号DNA序列互补的第二序列，其中第二序列包含锁核酸，所述锁核酸位于从所述寡核苷酸的3’端的位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或其组合处。
42.根据权利要求41所述的化学修饰的寡核苷酸，其中所述锁核酸位于从所述寡核苷酸的3’端的位置3和6处。
43.根据权利要求41所述的化学修饰的寡核苷酸，其中所述锁核酸位于发夹结构的茎中。
44.根据权利要求43所述的化学修饰的寡核苷酸，其中所述茎包含2至10个碱基对。
45.根据权利要求41所述的化学修饰的寡核苷酸，其在选自由如下组成的组中的位置处包含锁核酸：
a) 从所述寡核苷酸的3’端的位置6与任何其它位置1-5和7-10组合；
b) 从所述寡核苷酸的3’端的位置1和2；
c) 从所述寡核苷酸的3’端的位置1和10；
d) 从所述寡核苷酸的3’端的位置2和10；
e) 从所述寡核苷酸的3’端的位置4和8；
f) 从所述寡核苷酸的3’端的位置5和9；
g) 从所述寡核苷酸的3’端的位置1和8；
h) 从所述寡核苷酸的3’端的位置2和8；
i) 从所述寡核苷酸的3’端的位置3和8；和
j) 从所述寡核苷酸的3’端的位置2和7。
46.根据权利要求41所述的化学修饰的寡核苷酸，其中所述第二序列包含3个锁核酸。
47.根据权利要求46所述的化学修饰的寡核苷酸，其中所述锁核酸位于选自由如下组成的组中的位置处：
a) 从所述寡核苷酸的3’端的位置6与任何其它位置1-5和7-10组合；和
b) 从所述寡核苷酸的3’端的位置1、2和10。
48.根据权利要求41所述的化学修饰的寡核苷酸，其中所述第二序列包含4个锁核酸。
49.根据权利要求48所述的化学修饰的寡核苷酸，其中所述锁核酸位于从所述寡核苷酸的3’端的位置6与任何其它位置1-5和7-10组合处。
50.根据权利要求41-49中任一项所述的化学修饰的寡核苷酸，其还包含3'端修饰。
说明书
相关申请的交叉引用
[不适用]
序列表
本申请包含一个序列表，其通过引用并入，并且以作为名称为“12350USLl_SeqList.TXT”的文本文件的方式与本申请一起提交。序列表文件是在2014年10月7日创建的，大小为17464字节。
基金
本文所披露的研究中至少有一部分得到了日本政府机构的日本科技机构(JST)的资助。
具有锁核酸的序列转换和信号扩增DNA以及使用其的检测方法专利购买费用说明
Q：办理专利转让的流程及所需资料
A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。
1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。
2：按规定缴纳著录项目变更手续费。
3：同时提交相关证明文件原件。
4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。
Q:专利著录项目变更费用如何缴交
A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式
Q：专利转让变更，多久能出结果
A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。
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