专利摘要

提供了用于对基因组编辑进行定量的方法、组合物和试剂盒。在一个方面中，本发明提供了一种同时对细胞样品中同源定向修复(HDR)和非同源末端连接(NHEJ)基因组编辑产物定量的方法，其中所述细胞样品已经与设置成切割或切开靶基因组区中的DNA的位点的特异性基因组编辑试剂和HDR模板核酸接触。

权利要求

1.一种对细胞样品中同源定向修复(HDR)和非同源末端连接(NHEJ)基因组编辑产物同时定量的非诊断治疗用途的方法，其中所述细胞样品包含已经与设置成切割或切开靶基因组区中的DNA的位点特异性基因组编辑试剂和HDR模板核酸接触的细胞，所述方法包括：

a)形成多个具有平均体积的混合物划分产物，其中混合物划分产物包含：

i)靶基因组区；

ii)DNA-依赖性DNA聚合酶；

iii)正向和反相寡核苷酸扩增引物，其中所述正向和反应引物与靶基因组区的相反链杂交并侧接靶基因组区，并且其中引物设置成在聚合酶存在下扩增靶基因组区；

iv)可检测标记的寡核苷酸参考探针，其中参考探针杂交至野生型靶基因组区、含有通过对来自位点特异性基因组编辑试剂的DNA破坏的同源定向修复引入的HDR突变的靶基因组区，和含有通过对来自位点特异性基因组编辑试剂的DNA破坏的NHEJ修复引入的NHEJ突变的靶基因组区；

v)可检测标记的寡核苷酸HDR探针，其中HDR探针与含有HDR突变的靶基因组区杂交；和

vi)可检测标记的寡核苷酸NHEJ脱落探针，其中所述NHEJ脱落探针与野生型靶基因组区杂交，并且其中所述NHEJ脱落探针不与含有NHEJ突变的靶基因组区杂交；

b)扩增多个混合物划分产物中的靶基因组区；并且

c)通过检测多个混合物划分产物中标记的探针与靶基因组区的杂交来确定野生型靶基因组区的量、含有HDR突变的靶基因组区的量，和含有NHEJ突变的靶基因组区的量，

其中所述定量包括液滴数字核酸扩增。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述参考和HDR探针包含相同的可检测标记物。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述HDR探针不与野生型靶基因组区杂交。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述NHEJ脱落探针不与含有HDR突变的靶基因组区杂交。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述NHEJ脱落探针与含有HDR突变的靶基因组区杂交。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述DNA依赖性DNA聚合酶包含5’至3’外切核酸酶活性，和c)包括检测多个混合物划分产物中由对杂交的标记的探针的5’至3’外切核酸酶消化导致的荧光增加。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述多个混合物划分产物还包含HDR暗寡核苷酸探针，其中该HDR暗探针包含不可由DNA聚合酶延伸的3’末端，并且其中所述HDR暗探针与所述HDR探针竞争杂交野生型靶基因组区。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述NHEJ脱落探针与所述HDR探针竞争杂交野生型靶基因组区。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述位点特异性基因组编辑试剂是CRISPR-Cas9试剂、TALEN、或锌指核酸酶。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述位点特异性基因组编辑试剂包括2种位点特异性基因组缺刻酶，其中各缺刻酶设置成在其他缺刻酶的1kb以内切开细胞基因组中的靶DNA。

11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括，在形成多个混合物划分产物之前，提供细胞样品并提取靶基因组区。

12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述提供包括使多个细胞与位点特异性基因组编辑试剂接触。

13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述提供还包括使所述多个细胞与HDR模板核酸接触，其中所述HDR模板核酸包含靶基因组区的部分的突变并且设置成在对靶基因组区的同源定向修复期间发挥模板作用，从而将HDR突变引入靶基因组区。

14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述HDR模板核酸包括DNA。

15.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述HDR模板核酸是单链DNA寡核苷酸。

16.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述多个混合物划分产物包含多个结构上不同的可检测标记的寡核苷酸NHEJ脱落探针，其中所述多个结构上不同的NHEJ脱落探针与野生型靶基因组区的不同亚区杂交。

17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述多个结构上不同的NHEJ脱落探针不与NHEJ突变的亚区杂交。

18.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述多个结构上不同的NHEJ脱落探针不与NHEJ突变的亚区杂交并且不与HDR突变的亚区杂交。

19.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述多个结构上不同的NHEJ脱落探针不与NHEJ突变的亚区杂交并且与含有HDR突变的靶基因组区杂交。

20.如权利要求1所述的方法，其特征在于，c)包括通过对以下进行检测并计数来确定样品中具有NHEJ突变的靶基因组区的浓度：

i)不含靶基因组区的混合物划分产物的总数；和

ii)以下部分的总数：

-其中仅检测到含NHEJ突变的靶基因组区的混合物划分产物；和

-不含靶基因组区的混合物划分产物，

其中浓度计算为多个混合物划分部分的平均体积的倒数与i)除以ii)的比率的负自然对数的乘积。

21.如权利要求1所述的方法，其特征在于，c)包括通过对以下进行检测和计数来确定样品中具有HDR突变的靶基因组区的浓度：

i)以下的总数：

-不含靶基因组区的混合物划分产物；

-其中仅检测到含有NHEJ突变的靶基因组区的混合物划分产物；

-其中仅检测到野生型靶基因组区的混合物划分产物；和

-其中仅检测到野生型靶基因组区和含有NHEJ突变的靶基因组区的混合物划分产物；和

ii)以下的总数：

-i)；和

-其中检测到HDR突变的混合物划分产物，其中浓度计算为多个混合物划分产物的平均体积的倒数与i)除以ii)的比率的负自然对数的乘积。

22.如权利要求1所述的方法，其特征在于，c)包括通过对以下进行检测和计数来确定样品中野生型靶基因组区的浓度：

i)以下的总数：

-不含靶基因组区的混合物划分产物；和

-其中仅检测到含有NHEJ突变的靶基因组区的混合物划分产物；和

ii)以下的总数：

-i)；

-其中仅检测到野生型靶基因组区的混合物划分产物；和

-其中仅检测到野生型靶基因组区和含有NHEJ突变的靶基因组区的混合物划分产物；

并且其中浓度计算为多个混合物划分产物的平均体积的倒数与i)除以ii)的比率的负自然对数的乘积。

23.一种鉴定细胞的基因组编辑的优化条件的方法，所述方法包括：

a)在第一组条件下对多个细胞进行位点特异性基因组编辑以提供第一细胞样品；

b)在第二组条件下对多个细胞进行位点特异性基因组编辑以提供第二细胞样品；

c)进行如权利要求1-10或16-22中任一项所述的方法中的任一种以对第一和第二细胞样品中NHEJ编辑的靶基因组区和HDR编辑的靶基因组区的数量进行定量以确定第一和第二组条件的基因组编辑效率；

d)比较第一和第二组条件的基因组编辑效率以鉴定提供较高基因组编辑效率的一组条件；和

e)选择提供较高基因组编辑效率的一组条件作为基因组编辑的优化条件。

24.如权利要求23所述的方法，其特征在于，

a)包括使第一细胞样品与第一浓度的基因组编辑试剂接触；和

b)包括使第二细胞样品与第二浓度的基因组编辑试剂接触。

25.如权利要求23所述的方法，其特征在于，

a)包括使第一细胞样品与第一基因组编辑试剂接触；和

b)包括使第二细胞样品与第二结构不同的基因组编辑试剂接触。

26.如权利要求23所述的方法，其特征在于，

c)包括确定第一组条件的HDR基因组编辑效率并确定第二组条件的HDR基因组编辑效率；

d)包括比较第一和第二组条件的HDR基因组编辑效率以鉴定提供较高HDR基因组编辑效率的一组条件；和

e)包括选择提供较高HDR基因组编辑效率的一组条件作为基因组编辑的优化条件。

27.如权利要求26所述的方法，其特征在于，

c)包括确定第一组条件的NHEJ基因组编辑效率并确定第二组条件的NHEJ基因组编辑效率；

d)包括比较第一和第二组条件的NHEJ基因组编辑效率以鉴定提供较低NHEJ基因组编辑效率的一组条件；和

e)包括选择提供较高HDR基因组编辑效率和较低NHEJ基因组编辑效率的一组条件作为基因组编辑的优化条件。

28.如权利要求1-22中任一项所述的方法，其特征在于，细胞样品来自已经向其给予基因组编辑的细胞的患者。

29.如权利要求1中所述的组分ii)-vi)在制备用于一种监测患者中细胞群的方法的检测试剂中的用途，其中所述细胞包括编辑的基因组的克隆群，所述方法包括：

提供来自已经向其给予包含编辑的基因组的克隆群的细胞的个体的样品作为治疗的部分；

分析所述样品以确定所述样品中编辑的基因组或其片段的数量；并且

从所述样品中编辑的基因组或其片段的数量估计所述患者中包含编辑的基因组的克隆群的细胞的数量。

30.如权利要求29所述的用途，其特征在于，分析所述样品以确定编辑的基因组或其片段的数量包括使用如权利要求1-21中任一项所述的方法定量同源定向修复(HDR)和非同源末端连接基因组编辑产物。

31.如权利要求29所述的用途，其特征在于，分析所述样品以确定编辑的基因组或其片段的数量包括对含有通过基因组编辑诱导的多态性的基因组的数量进行定量。

32.如权利要求31所述的用途，其特征在于，所述定量包括液滴数字核酸扩增。

33.如权利要求29所述的用途，其特征在于，分析所述样品以确定编辑的基因组或其片段的数量包括大规模平行测序。

34.如权利要求29所述的用途，其特征在于，所述方法包括基于所述患者中包含编辑的基因组的克隆群的细胞的估计数量确定是否向所述患者给予包含编辑的基因组的克隆群的额外的细胞。

35.如权利要求29所述的用途，其特征在于，所述方法还包括比较患者中编辑的基因组的克隆群的细胞的估计数量与已经给予患者的基因组编辑的细胞的数量。

36.如权利要求35所述的用途，其特征在于，所述患者中包含编辑的基因组的克隆群的细胞的数量和已经给予患者的细胞的数量之间的差表示治疗是否成功或是否将要成功。

37.如权利要求35所述的用途，其特征在于，所述方法包括基于从给予细胞到从患者获得样品的过程中患者中包含编辑的基因组的克隆群的细胞数量的变化确定治疗成功或失败的风险因数。

38.如权利要求37所述的用途，其特征在于，所述风险因数是让步比。

39.如权利要求35所述的用途，其特征在于，所述方法包括基于从给予细胞到从患者获得样品的过程中患者中包含编辑的基因组的克隆群的细胞的数量的变化确定是否向所述患者给予包含编辑的基因组的克隆群的额外的细胞。

40.如权利要求39所述的用途，其特征在于，从给予细胞到从患者获得样品的过程中，患者中包含编辑的基因组的克隆群的细胞的数量的减少表明需要向所述患者给予包含编辑的基因组的克隆群的额外的细胞。

41.如权利要求35所述的用途，其特征在于，所述方法包括，基于从给予细胞到从患者获得样品的过程中患者中包含编辑的基因组的克隆群的细胞的数量的变化确定是否向所述患者给予包含替代编辑的基因组的第二克隆群的细胞。

42.如权利要求29所述的用途，其特征在于，所述方法还包括：

分析第二样品以估计所述患者中包含编辑的基因组的克隆群的细胞的第二数量，其中第二样品是在较晚的时间点从所述患者获取的样品；并且

比较来自第一与第二样品的患者中包含编辑的基因组的克隆群的细胞的数量变化。

43.如权利要求42所述的用途，其特征在于，所述细胞的数量变化指示治疗是否成功或是否将会成功。

44.如权利要求42所述的用途，其特征在于，从所述第一到第二样品，在患者中包含编辑的基因组的克隆群的细胞的数量减少表明治疗不成功或将不成功。

45.如权利要求42所述的用途，其特征在于，所述方法包括从所述第一到第二样品，基于患者中包含编辑的基因组的克隆群的细胞的数量的变化确定治疗成功或失败的风险因数。

46.如权利要求45所述的用途，其特征在于，所述风险因数是让步比。

47.如权利要求42所述的用途，其特征在于，所述方法包括从所述第一到第二样品，基于所述患者中包含编辑的基因组的克隆群的细胞的数量的变化确定是否向所述患者给予包含编辑的基因组的克隆群的额外的细胞。

48.如权利要求47所述的用途，其特征在于，从第一到第二样品，患者中包含编辑的基因组的克隆群的细胞的数量的减少表明需要向所述患者给予包含编辑的基因组的克隆群的额外的细胞。

49.如权利要求42所述的用途，其特征在于，所述方法包括从所述第一到第二样品，基于所述患者中包含编辑的基因组的克隆群的细胞的数量的变化确定是否向所述患者给予包含替代编辑的基因组的第二克隆群的细胞。

说明书

相关申请的交叉参考

本申请要求2015年1月9日提交的美国临时专利申请62/101,828，2015 年8月5日提交的美国临时专利申请62/201,446的优先权，这两份申请的内容被纳入本文作为参考。

联邦资助的研究与开发下作出发明的权利声明

本发明是在政府支持下由国家卫生研究院(National Institutes of Health)授予的基金号HL100406和HL098179资助完成。政府享有本发明的某些权利。

序列表提交的引用

本申请包括2016年1月8日生成的名为“0968442_ ST25.txt”的文本文件的序列表并且含有9,073个字节。该文本文件中含有的内容通过引用全文纳入本文用于所有目的。

检测基因组编辑专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。