专利摘要

本发明涉及一种组织修复用可降解纳米短纤维材料，所述纳米短纤维材料由纳米短纤维组成，所述纳米短纤维的直径为200～800nm，长度不超过500μm；且所述纳米短纤维材料中至少有93%的纳米短纤维的长度分布在20～200μm之间，所述纳米短纤维材料的堆叠密度为0.001~0.099g/cm3。本发明提供的纳米短纤维材料缩短了纳米纤维的长度，提高了纳米纤维的分散性能和修复性能，且拓宽了纳米短纤维材料的应用范围。

权利要求

1.一种组织修复用可降解纳米短纤维材料，其特征在于，所述纳米短纤维材料由纳米短纤维组成，所述纳米短纤维的直径为200～800nm，长度不超过500μm；且所述纳米短纤维材料中至少有93%的纳米短纤维的长度分布在20～200μm之间，所述纳米短纤维材料的堆叠密度为0.001~0.099g/cm³。

2.根据权利要求1所述组织修复用可降解纳米短纤维材料，其特征在于，所述纳米短纤维材料中有65~75%的纳米短纤维的长度分布在50～100μm之间。

3.根据权利要求1所述组织修复用可降解纳米短纤维材料，其特征在于，所述纳米短纤维材料的堆叠密度为0.02~0.06g/cm³。

4.根据权利要求1所述组织修复用可降解纳米短纤维材料，其特征在于，所述纳米短纤维由聚乳酸、聚ε-己内酯、聚乳酸-聚乙醇酸共聚物、聚乳酸-聚乙二醇共聚物、聚ε-己内酯-聚乳酸共聚物、聚ε-己内酯-聚乙二醇共聚物、聚二氧六环酮、聚酸酐、明胶、胶原、透明质酸、壳聚糖、丝素、纤维蛋白、果胶、淀粉及其衍生物、纤维素及其醚化物、聚氧乙烯、聚乙烯醇、聚乙二醇中的一种或几种材料制成。

5.权利要求1～4任一项所述组织修复用可降解纳米短纤维材料的制备方法，其特征在于，所述制备方法的步骤如下：

S1：采用可降解材料制备纳米纤维；

S2：将步骤S1中的纳米纤维置于固型液体内部浸泡；

S3：将步骤S2中的纳米纤维转移至低温环境中冷冻固化、粉碎、研磨，干燥即得纳米短纤维材料。

6.根据权利要求5所述制备方法，其特征在于，步骤S2中所述固型液体为水、甲醇、乙醇、甘油、聚乙烯醇水溶液、明胶水溶液、无机盐水溶液中的一种或几种。

7.根据权利要求5所述制备方法，其特征在于，步骤S3中所述低温环境为冰箱、干冰或液氮环境中的一种或几种。

8.根据权利要求5所述制备方法，其特征在于，步骤S1中的纳米纤维的制备方法如下：

S11：将可降解材料溶于溶剂A中，制成纺丝液；

S12：以纺丝液为原料进行静电纺丝，利用干态或湿态接收装置收集，即得到静电纺丝制备的纳米纤维。

9.根据权利要求8所述制备方法，其特征在于，步骤S12中所述湿态接收装置为接地的凝固浴。

10.根据权利要求9所述制备方法，其特征在于，所述凝固浴的液体为水、甲醇、乙醇、丙三醇、室温等离子体中的一种或几种。

11.一种可注射的组织修复用可降解纳米短纤维材料，其特征在于，所述可注射的组织修复用可降解纳米短纤维材料包含权利要求1～4任一项所述组织修复用可降解纳米短纤维材料和分散液。

12.权利要求1～4任一项所述组织修复用可降解纳米短纤维材料在组织填充或组织修复制品中的应用。

13.根据权利要求12所述应用，其特征在于，所述可降解纳米短纤维材料在较小、较深的缺损部位或微创手术制品中的应用。

说明书

技术领域

本发明涉及组织修复支架技术领域，具体涉及一种组织修复用可降解纳米短纤维材料及其制备方法和应用。

背景技术

人体的各种组织、器官都有可能发生异常或损伤，目前主要依靠组织、器官的移植来恢复其功能。但可供移植的组织器官十分缺乏，即使成功移植，后期还必须进行长期的免疫抑制治疗。1960年以来，研究者试图利用各种生物材料构建可用于组织修复的支架；1984年Wolter（Wolter J R, Meyer R F. Sessile macrophages forming clear endothelium-like membrane on inside of successful keratoprosthesis.[J]. Transactions of the American Ophthalmological Society, 1984,82:187.）首次提出了“组织工程”一词。“组织工程”是利用具有良好生物相容性和生物可降解性的材料制成相应的支架并植入人体，促进缺损周边细胞在支架上增殖。随着细胞的进一步增殖和分化以及支架材料的降解、吸收，最终形成新的功能组织，达到修复缺损组织的目的。

近年来，研究者将生物材料制成具有纳米尺度的支架，取得了良好的修复效果。其中，利用静电纺丝技术将材料制备成具有纳米直径、连续长度的纳米纤维获得了长足的发展，大量应用于组织工程、组织修复领域（Baker B M, Gee A O, Metter R B, et al. The potential to improve cell infiltration in composite fiber-aligned electrospun scaffolds by the selective removal of sacrificial fibers[J]. Biomaterials, 2008,29(15):2348-2358.）。纳米纤维很好地模拟了细胞外基质的形貌，在促进细胞粘附、迁移、生长方面具有巨大的优势。研究者还发现，具有纳米直径的纤维会在植入早期造成轻微的异物炎症反应，促使巨噬细胞以及其他炎症细胞浸润，但纳米纤维在长度上大于巨噬细胞，巨噬细胞无法将其吞噬，促使了更多细胞的浸润和相关细胞环境的建立，其中同时浸润的成纤维细胞、纤维母细胞等最终完成了新生组织的生成，而纳米纤维材料逐渐降解成小的纳米纤维片段，被巨噬细胞吞噬并排除（Ishii D, Ying T H, Mahara A, et al. In vivo tissue response and degradation behavior of PLLA and stereocomplexed PLA nanofibers[J]. Biomacromolecules, 2008, 10(2): 237-242.）。巨噬细胞所能吞噬的异物尺寸大致与细胞自身尺寸相当，所以理论上一般长度大于巨噬细胞的纳米纤维即可由上述机理促进组织修复。但是静电纺丝制备的纳米纤维在长度上一般为连续的，无法分散或分散性差，在较小、较深的缺损部位或微创手术中难以应用；因此，有必要研究一种分散性好的能够应用在较小或较深的缺损部位或微创手术中的纳米短纤维。

目前纳米短纤维的制备方法一般有模板法、水热生长法、化学气相沉积法等直接方法，或静电纺丝加煅烧的后处理法（Law M, Goldberger J, Yang P. Semiconductor nanowires and nanotubes[J]. Annu. Rev. Mater. Res., 2004, 34: 83-122.）等，但是这些方法主要用于金属、无机非金属材料的研究以及生物传感器领域，并且它们在制备过程中会采用高温或过多有机试剂，不利于生物材料的生物相容性的保持，无法用于制备组织修复领域用纳米短纤维。因此，仍需研究一种新型的适用于制备组织修复用纳米短纤维的制备方法。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种组织修复用可降解纳米短纤维材料，所述纳米短纤维材料缩短了纳米纤维的长度，提高了纳米纤维的分散性并拓宽了纳米短纤维材料的应用范围。

本发明的另一目的在于提供上述组织修复用可降解纳米短纤维材料的制备方法。

本发明的另一目的在于提供上述组织修复用可降解纳米短纤维材料在组织填充或组织修复制品中的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种组织修复用可降解纳米短纤维材料，所述纳米短纤维材料由纳米短纤维组成，所述纳米短纤维的直径为200～800nm，长度不超过500μm；且所述纳米短纤维材料中至少有93%的纳米短纤维的长度分布在20～200μm之间，所述纳米短纤维材料的堆叠密度为0.001~0.099g/cm³。

与现有的纳米纤维材料相比，本发明提供的纳米短纤维材料缩短了纳米纤维的长度，长度主要分布在20～200μm之间，而且所述纳米短纤维材料至少有93%的纳米短纤维分布在该区间内，本发明提供的纳米短纤维材料具有较好的分散性能和修复性能，但又不至于被巨噬细胞所吞噬，特别适用于对小面积、深层缺损的组织进行修复。所述纳米短纤维材料可制成膜状、块状甚至可注射流体，同时本发明提供的纳米短纤维材料可以与其他材料充分混合，并与其他材料具有较好的复合能力。

在本发明中，所述纳米短纤维材料中长度分布在50～100μm之间的纳米短纤维占比达到65~75%。

优选地，所述纳米短纤维材料的堆叠密度为0.02~0.06g/cm³。本发明所述纳米短纤维材料的堆叠密度，是参照国家标准GB/T 31057.1-2014《颗粒材料 物理性能测试 第1部分：松装密度的测量》，采用震动漏斗法测定纳米短纤维的堆叠密度。

优选地，所述纳米短纤维由聚乳酸、聚ε-己内酯、聚乳酸-聚乙醇酸共聚物、聚乳酸-聚乙二醇共聚物、聚ε-己内酯-聚乳酸共聚物、聚ε-己内酯-聚乙二醇共聚物、聚二氧六环酮、聚酸酐、明胶、胶原、透明质酸、壳聚糖、丝素、纤维蛋白、果胶、淀粉及其衍生物、纤维素及其醚化物、聚氧乙烯、聚乙烯醇、聚乙二醇中的一种或几种制备而成。这些材料具有良好的生物相容性和组织修复能力，同时具有良好的可纺性，可以方便地由静电纺丝技术制成纳米纤维。

上述组织修复用可降解纳米短纤维材料的制备方法，所述制备方法的步骤如下：

S1：采用可降解材料制备纳米纤维；

S2：将步骤S1中的纳米纤维置于固型液体内部浸泡；

S3：将步骤S2中的纳米纤维转移至低温环境中冷冻固化、粉碎、研磨，干燥即得纳米短纤维材料。

本发明所述的纳米纤维为连续的或长度大于直径2000倍以上的纳米纤维，所述纳米纤维可以通过静电纺丝、离心纺丝、熔融纺丝或者其他方法制得，优选通过静电纺丝制得。

优选地，所述纳米纤维由静电纺丝制备得到，所述纳米纤维可以是但不限于单相静电纺丝的纳米纤维、多相静电纺丝的纳米纤维、同轴静电纺丝或乳液静电纺丝的皮芯结构的纳米纤维等。

作为一种优选的方案，可以在静电纺丝后对纳米纤维进行矿化或涂层处理，也可以在粉碎后进行矿化或涂层处理，使纳米短纤维具有各种功能化的涂层，如骨传导性涂层、电子传输涂层、热传导涂层等，常见的矿化或涂层液有：各倍率的模拟体液、磷酸三钙、磷酸八钙、羟基磷灰石、二氧化硅、二氧化钛、石墨烯、碳纳米管等。矿化或涂层的方法可采用现有技术，在此不进行特别限定。

在对所述纳米纤维进行常规粉碎时发现，若直接对纳米纤维进行粉碎例如机械粉碎或液氮脆断，无法充分破碎纤维，即便能够获得较短长度的纳米纤维，但是纳米短纤维的占比极少，无法将其应用在较小面积和深层缺损的组织修复中。常规的粉碎方法无法充分破碎纳米纤维可能是因为纳米纤维在长度方向上具有极其良好的延展能力，同时纳米纤维之间充满了孔洞，若使用常规的粉碎方法只能使纤维变形或纤维之间的孔洞消失，导致无法充分破碎纤维。

本发明提供的制备方法在对纳米纤维进行粉碎之前，先使用固型液体填充纳米纤维间的孔洞，再将其冷冻固化并于低温环境中进行粉碎，然后再研磨、干燥去除纳米纤维间孔洞内的固型液体得到纳米短纤维；本发明提供的方法能够有效避免纳米纤维之间的孔洞消失以及纳米纤维变形，进而充分粉碎纳米纤维。本发明提供的粉碎方法缩短了纳米纤维的长度，同时能够获得较高数量占比的纳米短纤维，并且得到的纳米短纤维具有较好的分散性能和修复性能，特别适用于较小面积或深层缺损的组织修复。

本发明对所述纳米纤维进行粉碎和研磨的步骤都是在低温环境下进行的，以防止填充在纳米纤维间孔洞内的固型液体融化，并且本发明中没有引入对纳米纤维造成过多破坏的试剂，从而最大程度的保持了材料的生物相容性。

在本发明中，所述固型液体具有如下特点：一是所述纳米短纤维不溶于固型液体，二是固型液体具有合适的固化温度，根据可选冷冻条件，其固化温度不应低于-196℃；三是冷冻固化后的固型液体易于被破碎和研磨，并且可以通过可选的干燥条件被去除。

步骤S2中所述固型液体为纯溶液或任意比例可选液体的混合物；优选地，步骤S2中所述固型液体为水、甲醇、乙醇、甘油、聚乙烯醇水溶液、明胶水溶液、无机盐水溶液中的一种或几种。冷冻固化时，固型液体完整地填充了纳米纤维之间的孔洞，在冷冻粉碎时，纳米纤维随固型液体的粉碎而粉碎，纳米短纤维的长度可由得到的颗粒的大小初步限定，而后通过过筛进一步优选纳米短纤维的长度。

优选地，步骤S3中所述低温环境为冰箱（-20℃~-80℃）、干冰（-78.5℃）或液氮（-196℃）环境中的一种或几种；更为优选地，步骤S3中所述低温环境为液氮环境，本发明使用液氮（-196℃）可以大幅减少冷冻固化时间，并且使所述冷冻的固体内部的冰晶更加细小，冷冻固体脆性更大，更易被粉碎。

优选地，步骤S3中所述粉碎为机械粉碎和/或手工粉碎。

优选地，步骤S3中所述研磨为机械研磨和/或手工研磨。

优选地，步骤S3中所述干燥为冷冻干燥、常温干燥、加热干燥或负压干燥中的一种或几种。

优选地，步骤S1中的纳米纤维的制备方法如下：

S11：将可降解材料溶于溶剂A中，制成纺丝液；

S12：以纺丝液为原料进行静电纺丝，利用干态或湿态接收装置收集，即得到静电纺丝制备的纳米纤维。

优选地，步骤S11中所述纺丝液的浓度为1%~20%（w/v）。

优选地，步骤S11中所述溶剂A选自水、乙醇、甲醇、六氟异丙醇、丙酮、四氢呋喃、甲酸、醋酸、二氧六环、三氟乙酸中的一种或几种。

步骤S12中所述静电纺丝的工艺参数可以参考现有技术，优选地，针头采用18G~23G，更优选为18G~20G；设定纺丝距离优选为5~15cm，更优选为10~15cm；调整纺丝流率优选为0.3~5ml/h，更优选为1~3ml/h；静电电压优选为3~30kv，更优选为18~25kv；步骤S12中，所述纳米纤维为连续的或长度大于直径2000倍以上的纳米纤维。

优选地，步骤S12中所述干态接收装置为接地的平板、滚筒或金属网。

优选地，步骤S12中所述湿态接收装置为接地的凝固浴。

优选地，所述凝固浴的液体为水、甲醇、乙醇、丙三醇、室温等离子体中的一种或几种。

优选地，所述凝固浴可以加热，所述凝固浴的加热温度区间下限为凝固浴室温温度，上限为玻璃化温度与凝固浴溶液沸点之间较低的一个。

本发明还提供了一种可注射的组织修复用可降解纳米短纤维材料，所述可注射的组织修复用可降解纳米短纤维材料包含本发明的组织修复用可降解纳米短纤维材料和分散液。所述分散液可以是水、甘油、聚乙烯醇水溶液、明胶水溶液、无机盐水溶液、透明质酸水溶液以及PEG基水凝胶、血小板凝胶中的任意一种或几种的混合溶液。

作为一种优选方案，所述分散液中还含有药物，可通过在分散液中加入一定量功能性药物来达到局部给药的目的。

所述药物包括但不限于：（1）镇痛药物，如吗啡、哌替啶、美沙酮、芬太尼、喷他佐辛、曲马多、布桂嗪、罗通定、纳洛酮等；（2）解热药物，如对乙酰氨基酚、对乙酰水杨酸、吲哚美辛、布洛芬、复方氨基比林、塞来昔布等；（3）止血药物，如血凝酶、酚磺乙胺、二乙酰氨乙酸乙二胺、凝血酶原复合物、氨甲苯酸、维生素K1等；（4）扩充血容量药物，如右旋糖酐－40、白蛋白等 ；（5）局部麻醉药物，如利多卡因、普鲁卡因等；（6）抗生素，如青霉素、阿莫西林、氨苄西林、哌拉西林、头孢氨苄、头孢唑啉、头孢呋辛、头孢哌酮、头孢噻肟、头孢他定、头孢哌酮－舒巴坦钠、头孢哌酮－他唑巴坦钠、头孢克肟、头孢曲松、阿米卡星、庆大霉素、万古霉素、去甲万古霉素、甲硝唑、异烟肼等；（7）抗肿瘤药物，如阿霉素、依托泊苷、环磷酰胺、氟脲嘧啶、多烯紫杉醇、顺铂、碳铂、托泊替康、伊立替康等药物中的一种或几种的混合物。

上述组织修复用可降解纳米短纤维材料在组织填充或组织修复制品中的应用。

优选地，所述应用为可降解纳米短纤维材料在较小、较深的缺损部位或微创手术制品中的应用。

本发明同时提供了上述纳米短纤维材料的应用方式，具体如下：

A1：将制得的纳米短纤维材料直接应用于组织缺损部位，或压制成膜、块等形状后应用于组织缺损部位；

A2：将制得的纳米短纤维材料分散在合适的分散液中，形成稳定的注射液，利用注射器注射到缺损部位；

A3：将制得的纳米短纤维材料充分分散后与其他材料进行复合，得到复合材料后应用于组织缺损部位。

上述A1中，所述压制过程可以在一定温度和压力下进行，为保持可降解生物材料的生物性能，温度和压力需在一定范围内调节，温度一般为-196℃~60℃，优选为-196℃~37℃，压力一般为0.5MPa～10 MPa，优选为1 MPa～5MPa。

上述A2中，所述分散液可以是水、甘油、聚乙烯醇水溶液、明胶水溶液、无机盐水溶液、透明质酸水溶液、PEG基水凝胶以及血小板凝胶中的任意一种或几种按任意比例混合的混合溶液；在此范围内的分散液同时具有一定的极性和粘度，可使纳米短纤维均匀地分散在分散液中，并且这些分散液也具有很好的生物相容性，可以随纳米短纤维一起直接应用。

上述A3中，所述复合方式可以是将纳米短纤维材料与其他材料一起压制、热合或复合填充等方式。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供的纳米短纤维材料缩短了纳米纤维的长度，具有较好的分散性能，并且所述纳米短纤维材料由具有良好生物相容性和组织修复性能的可降解生物材料制成，无须去除，无需二次手术，特别适用于较小面积或深层缺损的组织修复。另外，本发明提供的纳米短纤维材料不仅可以制备成粉体、注射液等，在结合微创、腹腔镜、注射等手术方式中单独应用，还可以和其他材料进行复合使用。本发明提供的纳米短纤维材料的制备方法解决了粉碎过程中纳米纤维膜或纳米纤维团团聚较为严重的技术问题。该方法在低温环境下和环境友好型溶剂环境下进行，避免了高温、有机溶剂对生物材料本身的破坏作用，保持了纳米短纤维材料的生物相容性和组织修复性能。

附图说明

图1为实施例1中的纳米短纤维材料的光学显微镜照片；

图2为实施例2中的纳米短纤维材料的光学照片；

图3为实施例3中的纳米短纤维材料注射液的光学照片；

图4为实施例1中的纳米短纤维材料的长度分布图；

图5为实施例4中A3的光学照片及左上角的光学显微镜照片；

图6 为实施例5中解剖实验照片和病理实验结果图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的描述。这些实施例仅是对本发明的典型描述，但本发明不限于此。下述实施例中所用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法，所使用的原料、试剂等，如无特殊说明，均为可从常规市购等商业途径得到的原料和试剂。

在本发明中，所述纳米短纤维材料的堆叠密度，是按照以下方法进行测定：参照国家标准GB/T 31057.1-2014《颗粒材料 物理性能测试 第1部分:松装密度的测量》，采用震动漏斗法测定纳米短纤维材料的堆叠密度，具体步骤如下：

1.将震动漏斗置于已称量质量M₀的量筒上方40mm处，量筒体积为V；

2.将纳米短纤维材料加入震动漏斗上口，打开震动漏斗，以50Hz的频率震动，使纳米短纤维自然落入下方的量筒中直至填满；

3.用刮板刮去超过量筒高度的部分纳米短纤维，称量此时量筒总重M₁；

4.根据下列公式计算： ，即得到堆叠密度。

另外，采用取样法测定纳米短纤维的长度，具体步骤如下：

1.将纳米短纤维材料分散于适量水中，滴加到载玻片上，盖上盖玻片并于37℃烘箱中去除水分；

2.采用光学显微镜观察纳米短纤维，放大倍数为400X，随机取3个视野拍照；

3.利用Image Pro软件测量照片中纳米短纤维的长度，每张照片随机测量50个点；

4.同一材质的纳米短纤维材料选择3个不同批次，每个批次随机取3份样品，每份样品随机取3个视野拍照，每个视野随机取50个点测量，则每种材质的纳米短纤维材料可得到1350个数据，具有统计学意义；将这1350个数据进行统计学分析，即得上述纳米短纤维的长度及分布。

实施例1 聚乳酸纳米短纤维材料的制备

S1. 将0.8g聚乳酸加入10ml的六氟异丙醇溶液中，常温搅拌直至溶解，制成8%（w/v）的纺丝液；以去离子水为固型液体；

S2. 将纺丝液加入注射器中，注射器前端加上延长管并连接20G的针头，注射器放置于微量注射泵上，针头垂直于接收平板，接收板下部接地；设置注射速率为2ml/h，当针尖有溶液挤出时，在针尖上加载22kv的电压；此时有纳米纤维喷出并收集于接收板上，形成纳米纤维膜；

S3. 将纳米纤维膜真空干燥48h去除六氟异丙醇，然后转移至固型液体中，反复抽真空至其沉入固型液体底部，浸泡5min后捞出；

S4. 将纳米纤维-固型液体复合物转移到低温冰箱（-80℃）中冷冻固化，利用陶瓷研钵粉碎并研磨成细粉，研磨过程中持续加入一定量的干冰防止固型液体融化，再冷冻干燥成聚乳酸纳米短纤维材料。

得到的聚乳酸纳米短纤维材料为粉状，微观结构如图1所示。其纳米短纤维的直径为300~600nm，长度不超过500μm；且至少95%纳米短纤维长度分布于20~200μm之间，纳米短纤维材料的堆叠密度为0.0325g/cm³。

实施例2 丝素纳米短纤维材料的制备

S1. 将1g丝素蛋白加入10ml的甲酸溶液中，常温搅拌直至溶解，制成10%（w/v）的纺丝液；以乙醇为固型液体和凝固浴；

S2. 将纺丝液加入注射器中，注射器前端加上延长管并连接20G的针头，注射器放置于微量注射泵上，针头垂直于结晶皿，结晶皿内注满凝固浴，下部接地；设置注射速率为1ml/h，当针尖有溶液挤出时，在针尖上加载18kv的电压；此时有纳米纤维喷出并收集于凝固浴中，形成纳米纤维团；

S3. 在每12h更换1次乙醇的情况下将纳米纤维团在凝固浴中浸泡48h去除甲酸，然后转移至固型液体中，因凝固浴和固型液体是同一液体，所以无需抽真空，浸泡5min后捞出；

S4. 将纳米纤维-固型液体复合物转移到液氮（-196℃）中冷冻固化，将固体转移到球磨器中，根据所用球磨机型号和所需颗粒大小加入不同配比的钢球将纳米纤维团球磨成合适大小，同时每隔30s停机加入适量液氮防止颗粒融化，再负压干燥成丝素蛋白纳米短纤维材料。

得到的丝素蛋白纳米短纤维材料为粉状，表观结构如图2所示。其纳米短纤维的直径为400~700nm，长度不超过500μm；且至少94%纳米短纤维长度分布于20~200μm，所述纳米短纤维材料的堆叠密度为0.0449g/cm³。

实施例3 聚乙烯醇纳米短纤维材料的制备

S1. 将1g的聚乙烯醇加入10ml的去离子水中，90℃搅拌直至溶解，制成10%（w/v）的纺丝液；以甲醇作为固型液体；

S2. 将纺丝液加入注射器中，注射器前端加上延长管并连接20G的针头，注射器放置于微量注射泵上，针头垂直于接收板，接收板接地；设置注射速率为1ml/h，当针尖有溶液挤出时，在针尖上加载25kv的电压；此时有纳米纤维喷出并收集于接收板上，形成纳米纤维膜；

S3. 因聚乙烯醇的溶剂为水，无需额外去除，直接转移至固型液体中，抽真空，浸泡5min后捞出；

S4. 将纳米纤维-固型液体复合物转移到液氮（-196℃）中冷冻固化，将固体转移到陶瓷研钵中粉碎并研磨成细粉，研磨过程中持续加入一定量的液氮防止固型液体融化，再加热干燥成聚乙烯醇纳米短纤维材料。

得到的聚乙烯醇纳米短纤维材料其纳米短纤维的直径为270~450nm，长度不超过500μm；且至少97%纳米短纤维长度分布于20~200μm之间，所述纳米短纤维材料的堆叠密度为0.0253g/cm³。

本发明可选用的可降解生物材料较多，可选择的冷冻方式和粉碎方式也较多，在此仅列出其中三组作为范例，本发明所罗列的材料之组合均在本发明的保护范围之内。

实施例4 实施例1~3中制备得到的纳米短纤维材料的应用方式

为表明本发明中所制纳米短纤维材料的应用方式，特在此举例说明，具体如下：

A1：取实施例1中所制备的聚乳酸纳米短纤维材料，将其直接填塞、涂抹在组织缺损处直至填满，将创口缝合或直接覆盖纱布。

A2：取实施例2中所制备的丝素纳米短纤维材料0.5g，将其加入10ml的1%（w/v）的透明质酸水溶液，制成丝素纳米短纤维-透明质酸注射液，如图3所示；将注射液转移至5ml注射器中，选用23G针头，将注射液缓慢地注射至组织缺损处，一边注射一边揉动缺损处周围组织促使注射液均匀分布，直至注射液填满缺损。

A3：取实施例3中所制备的聚乙烯醇纳米短纤维材料，将其分散于甲醇溶液中，利用PP网片将部分纳米短纤维捞出，并在50℃及2MPa条件下热压，此时纳米短纤维包裹了PP网片的网格部分，可以提高网片的生物相容性，同时保留了网片的大孔结构，如图5所示。

实施例5 动物实验

为验证纳米短纤维材料的实际组织修复效果，选择肌肉植入的方式进行动物实验，参考国家标准《GB/T 16886.6-1997 医疗器械生物学评价 第6部分：植入后局部反应试验》，以实施例1中所制备的纳米短纤维材料为实验样品，市售组织修复膜为对照样品，具体过程如下：

1.取健康SD大鼠6只，麻醉、备皮，俯卧固定；

2.用碘伏酒精消毒大鼠臀部，在大鼠两侧臀肌分别做长3cm、宽1cm、深2cm的缺损各一；

3.在一侧缺损内植入适量纳米短纤维材料，另一侧缺损植入对照样品；

4.缝合肌肉和皮肤；

5.正常饲养，视情况给予一定量抗生素；2周后处死并解剖观察，随机取其中一只大鼠的植入部位及其周围组织，利用HE染色法进行病理分析。

解剖观察结果如图6（a）和图6（b）所示，其中图6（a）为实验组（纳米短纤维材料）的解剖照片，图6（b）为对照组（市售组织修复膜）的解剖照片。解剖后发现，实验组和对照组可见明显的细胞浸润，其中实验组材料见明显新生毛细血管结构，如图6（a）所示；二者均沿肌肉方向均有一定形变，对照组的形变明显大于实验组，如图6（b）所示。

病理实验结果如图6（c）和图6（d）所示，其中图6（c）为实验组（纳米短纤维材料）的病理实验结果，图6（d）为对照组（市售组织修复膜）的病理实验结果。二者病理结果类似，病理结果均显示：1、植入材料呈细丝状，内部疏松，可见少量成纤维细胞长入材料内部。残留材料面积百分比约为：40-50%，与周围组织之间未见明显空隙。2、植入材料周边可见较多纤维组织增生，其间可见少量淋巴细胞浸润（≤25个/HPF），少量浆细胞浸润（≤25个/HPF），少量巨噬细胞浸润（1-4个/HPF），大量多核巨细胞浸润（>5个/HPF）。其中，实验组伴有大量毛细血管增生（8-20个/HPF），对照组伴有毛细血管增生（4-7个/HPF），对照组为还伴有局部脂肪细胞浸润（<20%）。

从上述结果可知，在植入初期，实验组和对照组都表现了良好的生物活性，显示了组织刺激性，促使炎性细胞浸润材料，建立相关细胞环境，促使成纤维细胞长入，出现纤维组织增生和毛细血管增生，可见组织修复过程已经启动，可以预见最终材料可完成组织修复过程，实验组结果略好于对照组。同时，解剖照片显示，与对照组相比，实验组具有更好的抗形变能力和支撑性能。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

一种组织修复用可降解纳米短纤维材料及其制备方法和应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。