专利摘要

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及布氏白僵菌BRNS50206及其应用。本发明的布氏白僵菌(Beaveria brongniartii)BRNS50206作为生物杀虫剂，对靶标害虫毒力高，可以达到良好控制作用，有助于在植物保护中减少化学农药使用，同时本发明的菌株对人畜无毒害，对环境友好无污染，保障作物安全和生态安全。

权利要求

1.布氏白僵菌(Beauveria brongniartii)BRNS50206，其特征在于，所述布氏白僵菌BRNS50206的保藏编号为CGMCC No.15993。

2.权利要求1所述的布氏白僵菌BRNS50206的孢子粉的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

(1)液体种子培养：将布氏白僵菌BRNS50206的孢子接种到液体种子培养基中进行培养，得到液体种子；

(2)液体放大培养：将步骤(1)所得的液体种子接种到含液体放大培养基的发酵罐中进行放大培养，得到液体培养物；

(3)固体发酵培养：将步骤(2)所得的液体培养物接种到固体培养基中，培养5～9天后，干燥分离，得到菌种孢子粉。

3.根据权利要求2所述的布氏白僵菌BRNS50206的孢子粉的制备方法，其特征在于，所述液体种子培养基含蔗糖3％、蛋白胨1％、酵母浸出粉0.25％、硫酸镁0.01％，余量为水。

4.根据权利要求2所述的布氏白僵菌BRNS50206的孢子粉的制备方法，其特征在于，所述液体放大培养基含蔗糖2％、可溶性淀粉1％、啤酒酵母1％、胡萝卜干粉0.4-0.6％、磷酸氢二钾0.1％、硫酸镁0.05％，余量为水。

5.根据权利要求2所述的布氏白僵菌BRNS50206的孢子粉的制备方法，其特征在于，所述固体培养基含谷物皮壳35～60％、麦麸35～60％、玉米粉5～10％。

6.一种生物杀菌剂，其特征在于，所述生物杀菌剂中含有权利要求1所述的布氏白僵菌BRNS50206的菌体或孢子粉。

7.权利要求1所述的布氏白僵菌BRNS50206在防治金龟甲类或象甲类害虫中的应用。

说明书

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及布氏白僵菌BRNS50206及应用。

背景技术

金龟甲类、象甲类害虫对农业、林业造成严重危害。长期以来，我国主要依赖化学农药防治害虫，由于连年大量施用化学杀虫剂，且缺乏高效的治理方法，导致害虫抗药性增强，使得用药量、防治费用不断增加，有益天敌生物被大量损伤，生态环境遭到严重破坏，而害虫依然猖獗。与此同时，农产品、土壤和水域均受到农药残留污染，人类健康也受到严重威胁和损害。

随着人民生活水平的不断提高，人们对食品安全和环境污染问题也越来越关注，对食品质量的要求也越来越高。为保护生态环境，保证食品和饲料的产量、品质和安全性，应用生物防治技术大面积控制农业害虫，采取害虫可持续治理措施势在必行。

发明内容

为了解决现有技术中存在的化学农药防治害虫导致的生态破坏、环境污染等问题，本发明提供一种高效杀虫的布氏白僵菌，其具有对特定的病虫害的特效控制作用、对非靶生物安全性高、无污染无残留、环境友好的特点。

本发明的目的在于提供一种高效杀虫的布氏白僵菌BRNS50206。

本发明的再一目的在于提供布氏白僵菌BRNS50206的孢子粉的制备方法。

本发明的再一目的在于提供含有上述菌株的杀菌剂。

本发明的再一目的在于提供上述菌株的应用。

本发明的布氏白僵菌(Beauveria brongniartii)BRNS50206菌株的保藏编号为CGMCC No.15993，该菌株于2018年07月17日保存于中国普通微生物菌种保藏中心，保藏中心地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所。

根据本发明的具体实施方式，布氏白僵菌BRNS50206的孢子粉的制备方法包括以下步骤：

(1)液体种子培养：将布氏白僵菌孢子接种到含有液体种子培养基的摇瓶中培养，得到液体种子；

(2)液体放大培养：将步骤(1)所得的液体种子接种到发酵罐中进行放大培养，得到液体培养物；

(3)固体发酵培养：将步骤(2)所得的液体培养物接种到固体培养基中，培养5～9天后，干燥分离，得到菌种孢子粉。

根据本发明具体实施方式的布氏白僵菌BRNS50206的孢子粉的制备方法，其中，所述液体种子培养所用的培养基含蔗糖3％、蛋白胨1％、酵母浸出粉0.25％、硫酸镁0.01％，余量为水。

根据本发明具体实施方式的布氏白僵菌BRNS50206的孢子粉的制备方法，其中，所述液体放大培养所用的培养基含蔗糖2％、可溶性淀粉1％、啤酒酵母1％、胡萝卜干粉0.4-0.6％、磷酸氢二钾0.1％、硫酸镁0.05％，余量为水。

本发明的PPDA培养基的组分为1000mL中含马铃薯200g(煮汁)、葡萄糖20g、蛋白胨10g，琼脂18g。

根据本发明的具体实施方式的布氏白僵菌BRNS50206的孢子粉的制备方法，其中，固体发酵培养所用的培养基含谷物皮壳35～60％、麦麸35～60％、玉米粉5～10％。

本发明还提供了一种生物杀菌剂，其含有上述布氏白僵菌的菌体或孢子粉。

根据本发明的具体实施方式的生物杀菌剂，优选的，将上述菌株孢子粉用土、沙土或工业无机填充料如硅藻土、高岭土等进行稀释分散，制成含孢量每克5-20亿孢子的粉剂，然后投撒到害虫发生的区域。

根据本发明的具体实施方式的生物杀菌剂，优选的，将孢子粉按照可湿性粉剂配方和加工方法，制成含孢量每克20-100亿孢子的可湿性粉剂，使用时兑水，喷洒或喷雾到害虫发生的区域。

根据本发明的具体实施方式的生物杀菌剂，优选的，将孢子粉按照颗粒剂配方和加工方法，制成含孢量每克2-10亿孢子的颗粒剂，然后投撒到害虫发生的区域。

本发明还提供布氏白僵菌BRNS50206在防治金龟甲类、象甲类害虫中的应用。

本发明的有益效果：

本发明的布氏白僵菌BRNS50206源于自然、与环境友好兼容、无污染无残留，对金龟甲类、象甲类害虫有独特的高效控制作用，可作为无公害新型农药，用于农作物、果树、林木、草坪等的无害化处理。通过田间防治试验证明，本发明的菌株对金龟甲类、象甲类幼虫防效达到60-80％，防治效果良好。

本发明的菌株可利用工业发酵技术进行规模化生产，极具市场开发潜力。本发明菌株的孢子粉可加工制成粉剂、可湿性粉剂和颗粒剂的形式，便于喷撒、喷洒或投撒到虫害发生区。

附图说明

图1为本发明菌株在PPDA培养基上的菌落形态，左图为培养7天后的菌落形态，右图为培养9天后的菌落形态；

图2为本发明的菌株在电子显微镜下的形态；

图3显示被本发明菌株侵染的金龟子幼虫；

图4显示被本发明菌株侵染的苜蓿叶象甲成虫和幼虫。

布氏白僵菌(Beauveria brongniartii)BRNS50206的保藏编号CGMCC No.15993，该菌株于2018年07月17日保存于中国普通微生物菌种保藏中心，保藏中心地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所。

具体实施方式

实施例1 获取布氏白僵菌

1.获取高效菌株

本发明分别从山东、江苏、河北、云南、四川、北京、内蒙等地采集感染白僵病症的虫尸，在实验室内进行微生物分离、纯化。

小心挑取虫尸上的菌体，接种到选择性培养基上，在25℃温度下培养7天，分辨菌落并转移到新的选择性培养基平皿上，在25℃温度下培养14天以上，待菌落完全产孢后，转移到菌种培养基试管中，在25℃温度下培养14天后，于4℃冰箱冷藏保存。

将纯化的63个菌株对大黑鳃金龟幼虫进行生物测定，具体的方法步骤为：分别将各菌株的孢子与土壤混拌均匀，使最终每克土壤含2×10⁷孢子，含水量13.5％。将含菌土壤装入饲养盒，每盒接入1头试虫，25℃室内饲养至14天，每菌株处理30头(盒)。检查试虫死亡率，选取高死亡率的菌株进入复筛。经过单孢分离和3轮生物测定复筛，复筛时每菌株设置3组重复，每组重复30头(盒)，最终筛选出高效菌株BRNS50206。

2.高效菌株的形态学鉴定特征

配制PPDA培养基并制成平板，接种菌株BRNS50206，25℃培养2天，肉眼观察可见白色小菌落，继续培养7天，如图1所示，可见菌落扩大生长，菌落呈白色绒毛状，表面有白色孢子产生，呈现粉状或小团状。

在凹型载玻片的小室内滴一滴灭菌的PPDA培养基，接种分生孢子，25℃培养5d，于环境扫描电子显微镜下观察，如图2所示，可见分生孢子梗着生于营养菌丝上，单生；产孢细胞簇生，呈瓶状，颈部产孢轴呈膝状弯曲；孢子粘着在孢梗上；分生孢子椭圆形2-4.5×1.5-2.5μm。

3.鉴定菌株品系特征

配制LM培养基，其组分和配制方法为称取蔗糖20g、蛋白胨5g，加水至1000mL，分装至三角瓶，置于高压蒸气灭菌器中121℃保持30min，放凉至室温备用。

接种分生孢子至上述培养基中，接种量为2-3×10⁵孢子/mL，于25±1℃、200rpm摇床上培养48h，用滤纸过滤后留菌丝，挤干水分备用。基于菌株ITS的核苷酸序列、延长因子EF-α的核苷酸序列，并结合生理性状，确定高效菌株BRNS50206为布氏白僵菌。

实施例2 菌株的培养方法

本发明菌株的培养方法，包括以下步骤：

(1)液体种子培养：培养基含蔗糖3％，蛋白胨1％，酵母浸出粉0.25％，硫酸镁0.01％，余量为水。将试验管菌种孢子接种到装有培养基的摇瓶中，接种量为5×10⁴孢子/mL，于摇床上振荡培养25±1℃、200rpm 48h；

(2)液体二级培养：培养基含蔗糖2％，可溶性淀粉1％，啤酒酵母1％，胡萝卜干粉0.4-0.6％，磷酸氢二钾0.1％，硫酸镁0.05％，余量为水。将液体种子接种发酵罐中，按体积比接种量为3-5％，控制温度25±1℃、转速50-200rpm，通气量0.5～0.8，发酵培养36-54h。

(3)固体发酵培养：培养基含谷壳或碎花生壳或碎玉米芯或碎麦秸40-60％，麦麸40-60％，玉米粉5-10％，各组分之和为100％，将液体培养物接种到的固体培养基中，接种比为体积∶重量0.4-0.8:1，基料适宜厚度5-8cm，于25±1℃培养6-8天后，转至16-20℃培养5-9天，干燥后用振筛法或旋风法分离收集孢子粉，即得到分生孢子粉产品。

实施例3 验证菌株杀虫能力

1.验证菌株孢子粉的杀虫能力

(1)对金龟子幼虫的杀灭能力

将发酵培养得到的孢子粉定量加入到土壤中，混拌均匀，形成每克土壤含1×10⁷、5×10⁷、10×10⁷孢子的不同浓度混合菌土，分装到小塑料饲养盒中，每盒放入野外捕获的蛴螬1只，加土豆块作饲料，每浓度处理20只蛴螬，3次重复，以不加菌粉的空白土壤为对照，23-26℃培养20天，每3天检查一次，根据蛴螬最终死亡率比较确定菌株的作用。实验中观察到死亡虫体变得僵硬，将死亡虫体转移到干净培养皿中保湿3天，如图3所示，可见到虫体表面生长出菌丝，之后产生白色孢子。

具体实验结果如表1所示：

表1 不同浓度菌剂处理蛴螬的死亡率

实验结果表明，试虫在1×10⁷、5×10⁷、10×10⁷三种浓度孢子处理下的校正死亡率分别是55.2％，70.7％和86.2％，证明菌株能高效侵染金龟子幼虫，且金龟子幼虫死亡率随着孢子浓度增加而增加。

(2)对丽金龟幼虫的杀灭能力

将野外采集的丽金龟成虫在实验室内饲养，待其产卵孵化，饲养到1龄、2龄和3龄幼虫期时进行试验测定。

将发酵培养得到的孢子粉定量加入到土壤中，混拌均匀，形成每克土壤含0.08×10⁷、0.4×10⁷、2×10⁷、10×10⁷、50×10⁷孢子的梯度浓度混合菌土，分装到花盆中。1龄幼虫处理每盆放入蛴螬30只，3次重复；2龄和3龄幼虫处理每盆分别放入蛴螬20只，4次重复。加草根作饲料。以不加菌粉的空白土壤为对照。25-28℃培养25天，每5天检查一次，根据蛴螬最终死亡率比较菌株不同浓度处理的作用。实验中观察到死亡虫体变得僵硬，转移到干净培养皿中保湿3天，可见到虫体表面生长出菌丝，之后产生白色孢子。

结果表明，试虫在5种浓度孢子处理下的校正死亡率分别是35.0％，40.6％，58.3％，76.7％和84.6％，证明菌株能有效侵染丽金龟幼虫。

(3)对暗黑鳃金龟子幼虫的作用效果

野外采集暗黑鳃金龟成虫，在实验室内饲养，待其产卵、孵化，饲养到1龄、2龄、3龄幼虫期时进行生物测定。

将发酵培养得到的孢子粉定量加入到土壤中，混拌均匀，形成每克土壤含5×10⁷孢子的混合菌土，分装到小塑料盒中，每盒放入蛴螬1只，加土豆块作饲料。每龄期幼虫处理30只蛴螬，3次重复，以不加菌粉的空白土壤为对照，23-26℃室温培养21天，根据蛴螬最终死亡率确定菌株的作用。实验中观察到死亡虫体变得僵硬，转移到干净培养皿中保湿3天，可见到虫体表面生长出菌丝，之后产生白色孢子。

结果表明，1龄、2龄、3龄幼虫的死亡率分别为97.3％，84.5％，76.7％，证明本发明菌株能有效侵染暗黑鳃金龟子各龄期幼虫，对低龄幼虫的侵染率较高。

(4)对苜蓿叶甲虫的作用效果

从苜蓿田中采集苜蓿叶象甲成虫和幼虫，在实验室内进行生物测定。

将孢子粉配制成每克25亿孢子的可湿性粉剂，使用时取1克加水100mL配制成悬浮液，用喷雾器接种到试虫体表，置于塑料饲养盒中，每盒试虫50头以上，以新鲜苜蓿苗为饲料，3盒重复，以喷雾清水为空白对照，24-26℃室温饲养3周，每天更换饲料，第4天起每日捡出死亡虫体，最终根据死亡率和死亡速率评价菌株的作用。如图4所示，实验中观察到死亡虫体变得僵硬，转移到干净培养皿中保湿5天，可见到虫体表面生长出菌丝并有白色孢子产生。

结果表明，苜蓿叶象甲死亡率达到为86.6％，证明菌株对苜蓿叶象甲有高毒力作用，可防控其对苜蓿的危害。

(5)对金龟子幼虫作用的田间效果

将大约5亩的花生地划分为3×6的18个小区，分别为三种施菌量(低、中、高菌量分别为1×10¹¹、5×10¹¹、10×10¹¹孢子/亩)、一种菌剂加20％常量化学农药、常量化学农药(辛硫磷乳油剂，辛硫磷常量为40％乳油1000倍稀释液，20％常量为5000倍稀释液)和空白对照处理，每处理设3小区重复，随机排列。处理方法为在花生开花初期，将菌株孢子的可湿性粉剂兑水后喷淋到花生植株基部，然后培土覆盖。在花生收获时每小区内抽取1m²样方3次重复，调查花生虫果率和产量，评价菌株防治害虫蛴螬的作用效果，结果如表2所示。

表2 布氏白僵菌BRNS50206防治花生田间蛴螬效果

表2的结果表明，田间使用本发明的布氏白僵菌BRNS50206后，虫口减退率均较对照组有较大幅度的提高。因此，田间应用布氏白僵菌BRNS50206后能够减少蛴螬危害，从而降低虫果率，增加花生产量。

布氏白僵菌BRNS50206及其应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。