专利摘要
本发明属于食品、医药和化妆品等技术领域，尤其涉及一种植物甾醇多元酸肌醇酯及其制备方法，本发明在有机相中使用脂肪酶催化合成了植物甾醇琥珀酸肌醇酯，得到植物甾醇琥珀酸肌醇酯的产率为64.7％，纯度为80.5％，本发明方法使用的酶法生产反应条件温和、步骤简单、所得产物纯度和收率高等特点，无需官能团保护，选用的原料、催化剂和溶剂也都可安全应用于食品中，对环境友好，产品安全性高。
权利要求
1.一种植物甾醇多元酸肌醇酯的制备方法，其特征在于：通过植物甾醇琥珀酸单酯制备植物甾醇琥珀酸乙烯酯，植物甾醇琥珀酸乙烯酯与肌醇反应生成植物甾醇琥珀酸肌醇酯；
所述的植物甾醇琥珀酸乙烯酯的制备步骤为：将植物甾醇琥珀酸单酯与乙酸乙烯酯混合，再加入有机溶剂b，并加入弱碱性金属盐作为催化剂b，在惰性气体下反应一段时间后加入强酸启动反应，升温进行反应，反应结束停止加热，冷却至室温，加入过量的弱酸盐中和并停止反应，取出样品除去溶剂得到反应产物；
植物甾醇琥珀酸肌醇酯的制备步骤为：将植物甾醇琥珀酸乙烯酯、肌醇、生物催化剂分别加入到预先经过脱水处理的溶剂的反应瓶中，密闭，并将反应瓶震荡，并且控制反应温度，定期取样检测反应的进程，反应结束后，停止加热，冷却至室温，取出样品除去溶剂得到反应产物植物甾醇琥珀酸肌醇酯；
所述生物催化剂为脂肪酶类催化剂，具体为诺维信固定化脂肪酶Novozyme 435、固定化脂肪酶RM IMLipozyme RM IM或褶皱假丝酵母脂肪酶Candida Rugosa；
所述的植物甾醇琥珀酸乙烯酯的制备步骤中植物甾醇琥珀酸单酯和乙酸乙烯酯的摩尔比为1.0：20，反应温度为50℃，反应时间为12h，所述催化剂b为乙酸汞，乙酸汞的含量为5％，植物甾醇琥珀酸单酯浓度为0.6mmol/mL；
所述的植物甾醇琥珀酸肌醇酯的制备步骤中脂肪酶的添加量为80g/L，反应温度为45℃，反应时间为120h，植物甾醇琥珀酸乙烯酯与肌醇的摩尔比为1.0:3.0，植物甾醇琥珀酸乙烯酯浓度为0.025mmol/L；
所述的植物甾醇琥珀酸肌醇酯的结构通式如下：
其中，n＝2；
其中，R为
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述植物甾醇琥珀酸单酯的制备步骤为：将植物甾醇和琥珀酸酐、催化剂a混合，加入有机溶剂a，通过控制温度，实时监测反应进程，经过充分反应之后停止加热，冷却至室温，取出样品除去有机溶剂a得到反应产物植物甾醇琥珀酸单酯。
说明书
技术领域
本发明属于食品、医药和化妆品技术领域，尤其涉及一种植物甾醇多元酸肌醇酯及其制备方法。
背景技术
植物甾醇是一类来源丰富并且具有多种生理功能的天然产物，以环戊烷全氢菲为主体骨架的甾体类化合物。植物甾醇具有很多重要的生理功能，被誉为“生命的钥匙”，其最显著的功能是降低血清中的胆固醇和低密度脂蛋白的含量，有效预防心血管疾病的发生。此外，还具有抗氧化衰老、抗癌、消炎、防治前列腺疾病、抗病毒、提高免疫力等多种重要的生理功能，是一类重要的食品功能因子，广泛应用于食品、医药、化工和化妆品等领域。
植物甾醇分子C-3位连有一个羟基，C-17位连着一个9-10个碳原子组成的疏水侧链，植物甾醇独特的化学结构决定了其水不溶性和低油溶性，人体内对游离植物甾醇的吸收率仅为3％，限制了其在食品工业中的应用，所以如何提高植物甾醇的溶解度和生物利用率是首要问题。在不影响植物甾醇生理功能的前提下对其进行改性，提高其生物利用度成为研究的热点。甾醇酯化后称为甾醇酯，是植物甾醇衍生物中研究最多的一类，相比于植物甾醇，化学结构的变化并不影响其生理功能，有的还有一定的增强作用。
近年来有不少文献报道以改善甾醇的溶解度为目的对植物甾醇进行改性研究，如将甾醇与月桂酸、谷氨酸等进行酯化或者制备微胶囊等。但这些方法大多存在能耗高，步骤繁琐，安全性未知等问题，使其实际应用受到了限制。因此，若能选择一些可安全应用于食品领域的功能性物质与植物甾醇进行温和的一步反应，不但可以改善各自理化性质上的缺陷，提高其生物利用度，而且又可保留各自的功能或者发生协同作用，从而实现改性增效提质。
肌醇是人类和动物维持正常生理功能不可缺少的低分子有机物，其用途广泛。其显著的功能是降低血清中的胆固醇和低密度脂蛋白的含量，有效预防心血管疾病的发生。肌醇具有促进细胞的新陈代谢、改善细胞营养、防治肝脏中脂肪堆积、助长发育、增进食欲和恢复体力等作用，可用于维生素类及降血脂药等药物并广泛应用于食品及饮料添加剂方面。
植物甾醇和肌醇显著的功能都是降低血清中的胆固醇和低密度脂蛋白的含量，有效预防心血管疾病的发生。如能够开发一种植物甾醇多元酸肌醇酯的合成方法，将大大有益于提高植物甾醇和肌醇的利用度，但目前还没有关于植物甾醇多元酸肌醇酯合成的相关报道。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明的目的是提出一种植物甾醇多元酸肌醇酯及其制备方法，制得的植物甾醇多元酸肌醇酯经人体吸收可分解为游离的植物甾醇和肌醇，在人体内同时发挥这两种物质的功能，起到协同增效的作用，并对人体不会产生副作用，植物甾醇多元酸肌醇酯能够增加植物甾醇和肌醇的溶解度，提高生物利用率，可以更加方便的加入到各种体系的食品中且不影响食品本身的质构和风味。
本发明的第一个目的是提供一种植物甾醇多元酸肌醇酯，结构通式如下：
其中，n＝0～6；。
或者，其结构通式为：
或者，其结构通式为：
或者，其结构通式为：
或者，其结构通式为：
其中，R包括
本发明的第二个目的是提供上述植物甾醇多元酸肌醇酯的制备方法，通过植物甾醇多元酸单酯制备植物甾醇多元酸乙烯酯，植物甾醇多元酸乙烯酯与肌醇反应生成植物甾醇多元酸肌醇酯。
在本发明的一种实施方式中，所述植物甾醇多元酸单酯的制备步骤为：将植物甾醇和多元有机酸或其酸酐、催化剂a混合，加入有机溶剂a，通过控制温度，实时监测反应进程，经过充分反应之后停止加热，冷却至室温，取出样品除去有机溶剂a得到反应产物植物甾醇多元酸单酯。
在本发明的一种实施方式中，所述植物甾醇包括豆甾醇、菜油甾醇、β-谷甾醇和菜籽甾醇中的一种或多种。
在本发明的一种实施方式中，植物甾醇多元酸单酯的制备步骤中的植物甾醇的浓度为0.5-0.7mmol/mL。
在本发明的一种实施方式中，植物甾醇多元酸单酯的制备步骤中的所述多元有机酸包括柠檬酸、苹果酸、酒石酸、丁烯二酸、草酸、丙二酸、丁二酸、戊二酸、己二酸、庚二酸、辛二酸中的一种或多种，所述多元有机酸酐包括所述多元有机酸对应的酸酐中的一种或多种，植物甾醇与多元有机酸或酸酐的摩尔比为1.0:1.2～1.0:1.7。
在本发明的一种实施方式中，植物甾醇多元酸单酯的制备步骤中的催化剂a包括二甲氨基吡啶、吡啶、二乙胺、十二烷基硫酸钠、十二烷基硫酸铜中的一种或者几种，植物甾醇与二甲氨基吡啶的摩尔比为1.0:0.1～1.0:0.5。
在本发明的一种实施方式中，植物甾醇多元酸单酯的制备步骤中的有机溶剂a包括甲苯、二氯甲烷、苯、二甲甲苯、吡啶中的一种或多种。
在本发明的一种实施方式中，植物甾醇多元酸单酯的制备步骤中的反应温度为100～110℃。
在本发明的一种实施方式中，植物甾醇多元酸单酯的制备步骤中的反应时间为9～10h。
在本发明的一种实施方式中，植物甾醇多元酸乙烯酯的制备步骤为：将植物甾醇多元酸单酯与乙酸乙烯酯混合，再加入有机溶剂b，并加入弱碱性金属盐作为催化剂b，在惰性气体下反应一段时间后加入强酸启动反应，升温进行反应，反应结束停止加热，冷却至室温，加入过量的弱酸盐中和并停止反应，取出样品除去溶剂得到反应产物。
在本发明的一种实施方式中，植物甾醇多元酸乙烯酯的制备步骤中的催化剂b为醋酸金属盐或碳酸金属盐。
在本发明的一种实施方式中，植物甾醇多元酸乙烯酯的制备步骤中的催化剂b为醋酸汞或碳酸汞。
在本发明的一种实施方式中，植物甾醇多元酸乙烯酯的制备步骤中的催化剂b为的添加量为植物甾醇多元酸单酯用量的2％～10％(w/w)。
在本发明的一种实施方式中，植物甾醇多元酸乙烯酯的制备步骤中的催化剂b为的添加量为植物甾醇多元酸单酯用量的4％～6％(w/w)。
在本发明的一种实施方式中，植物甾醇多元酸乙烯酯的制备步骤中的植物甾醇多元酸单酯和乙酸乙烯酯的摩尔比为1.0：1.0～0.5：1.0。
在本发明的一种实施方式中，植物甾醇多元酸乙烯酯的制备步骤中的植物甾醇多元酸单酯的初始浓度为100～200mmol/L。
在本发明的一种实施方式中，植物甾醇多元酸乙烯酯的制备步骤中的植物甾醇多元酸单酯和乙酸乙烯酯的摩尔比为0.2～0.3:1.0。
在本发明的一种实施方式中，植物甾醇多元酸乙烯酯的制备步骤中的有机溶剂b包括四氢呋喃、吡啶、N，N-二甲基甲酰胺中的一种或者多种。
在本发明的一种实施方式中，植物甾醇多元酸乙烯酯的制备步骤中的反应温度为40～50℃。
在本发明的一种实施方式中，植物甾醇多元酸乙烯酯的制备步骤中的在氮气下搅拌反应30～60min，然后加入强酸，加入强酸后反应时间为10～12h。
在本发明的一种实施方式中，植物甾醇多元酸乙烯酯的制备步骤中的强酸物质为浓硫酸，其添加量为2～5μL/10mL有机溶剂b。
在本发明的一种实施方式中，植物甾醇多元酸乙烯酯的制备步骤中的弱酸盐为醋酸钠。
在本发明的一种实施方式中，植物甾醇多元酸肌醇酯的制备步骤为：将植物甾醇多元酸乙烯酯、肌醇、生物催化剂分别加入到预先经过脱水处理的溶剂的反应瓶中，密闭，并将反应瓶震荡，并且控制反应温度，定期取样检测反应的进程，反应结束后，停止加热，冷却至室温，取出样品除去溶剂得到反应产物植物甾醇多元酸肌醇酯。
在本发明的一种实施方式中，所述生物催化剂为脂肪酶类催化剂。
在本发明的一种实施方式中，所述脂肪酶类催化剂为诺维信固定化脂肪酶(Novozyme435)、固定化脂肪酶RM IM(Lipozyme RM IM)或褶皱假丝酵母脂肪酶(CandidaRugosa)。在本发明的一种实施方式中，所述生物催化剂的添加量为植物甾醇多元酸乙烯酯质量的8％～12％。
在本发明的一种实施方式中，所述溶剂的脱水处理方式为添加分子筛，所述分子筛的添加量为10g/L，所述分子筛为4A分子筛。
在本发明的一种实施方式中，所述溶剂包括正己烷、2-丁酮、二氯甲烷、丙酮中的一种或多种。
在本发明的一种实施方式中，植物甾醇多元酸乙烯酯的浓度为100～200mmol/L。
在本发明的一种实施方式中，所述植物甾醇多元酸乙烯酯和肌醇的摩尔比为1.0:2.0～1.0:4.0。
在本发明的一种实施方式中，植物甾醇多元酸肌醇酯的制备步骤中，反应温度为40～50℃。
在本发明的一种实施方式中，植物甾醇多元酸肌醇酯的制备步骤中，震荡速度为150rpm～200rpm。
在本发明的一种实施方式中，植物甾醇多元酸肌醇酯的制备步骤中，反应时间为120～168h。
本发明的第三个目的是提供一种植物甾醇多元酸肌醇酯的分离纯化方法，所述方法具体为：先除去催化剂，使用旋转蒸发仪去除溶剂后，用薄层色谱的展开剂溶解溶质，再经硅胶柱层析后，通过薄层色谱检测，收集不同段的组分，即可得到纯化的植物甾醇多元酸肌醇酯。
在本发明的一种实施方式中，所述硅胶柱层析流动相包括石油醚、乙酸乙酯、环己烷、甲醇中的一种或者几种的混合物。
在本发明的一种实施方式中，植物甾醇多元酸肌醇酯的制备方法通过以下反应式进行，其中多元酸酐以琥珀酸苷为例：
第一步反应：
第二步反应：
第三步反应：
本发明的第四个目的是提出一种上述方法制得的植物甾醇多元酸肌醇酯在食品、医药、化工和化妆品领域的应用。
本发明的有益效果：
(1)本发明合成了一种植物甾醇多元酸肌醇酯，改善了甾醇的溶解度，提高了甾醇和肌醇的生物利用度，极大地拓宽了植物甾醇和肌醇的应用范围。
(2)采用本发明在有机溶剂中利用化学-酶法反应制备植物甾醇酯的方法，可以大大提高酯的酯化率，酯化率超过64.7％，纯度为80.5％以上。
(3)本发明工艺简单，每一步的反应条件要求低，易实现工业化生产，其中酶法生产反应条件温和、步骤简单、所得产物纯度和收率高等特点。
附图说明
图1为豆甾醇琥珀酸单酯和豆甾醇琥珀酸乙烯酯的HPLC图谱。
图2为豆甾醇琥珀酸乙烯酯的红外光谱图。
图3为豆甾醇琥珀酸乙烯酯的质谱图。
图4为豆甾醇琥珀酸肌醇酯的HPLC图谱。
图5为豆甾醇琥珀酸肌醇酯的红外光谱图。
图6为豆甾醇琥珀酸肌醇酯的质谱图。
具体实施方式
产物的鉴定方法：采用傅里叶变换红外光谱和质谱鉴定植物甾醇多元酸肌醇酯的结构。FT-IR分析采用Thermo Scientific Nicolet i S10傅里叶变换红外光谱仪，选用KBr压片法，扫描次数：32次，分辨率：4cm
酯化率和产物纯度的计算方法：本发明采用HPLC测定植物甾醇多元酸肌醇酯的纯度和产率，HPLC-ELSD分析系统包括Waters1525高效液相色谱仪、Alltech3300蒸发光散射检测器(ELSD)和Empower数据处理软件。色谱柱为Waters symmetry C18反相柱(4.6×150mm，5μL)，柱温：45℃，流动相∶甲醇/甲酸(1000/1，v/v)，流速：1mL/min，等速洗脱，进样量：10μL；ELSD参数：温度为55℃，载气为氮气，流速为1.5L/min，增益为1。
具体酯化率的计算方法为：将分离纯化的植物甾醇多元酸乙烯酯和植物甾醇多元酸肌醇酯分别配制一系列不同浓度的溶液，利用HPLC测定各峰面积，根据样品峰面积的对数值与浓度的对数值的线性关系制作标准曲线。将酯化后的反应液进样后，再根据峰面积计算出反应液中植物甾醇多元酸乙烯酯和植物甾醇多元酸肌醇酯的浓度，再根据下列公式即可算出酯化率。
XPSE2(％)＝CPSE2/CPSE1×100 (1)
XPSE3(％)＝CPSE3/CPSE2×100 (2)
式(1)中XPSE2为植物甾醇多元酸乙烯酯的酯化率，CPSE2为植物甾醇多元酸乙烯酯的浓度(mol/L)，CPSE1为反应开始植物甾醇多元酸单酯的浓度(mol/L)。
式(2)中XPSE3为植物甾醇多元酸肌醇酯的酯化率，CPSE3为植物甾醇多元酸肌醇酯的浓度(mol/L)，CPSE2为反应开始植物甾醇多元酸乙烯酯的浓度(mol/L)。
植物甾醇多元酸肌醇酯的纯度(％)＝植物甾醇多元酸肌醇酯的峰面积/所有样品的总峰面积×100
实施例1 中间产物1植物甾醇琥珀酸单酯的制备
称取植物甾醇(纯度>97％，63％的β-谷甾醇和37％的豆甾醇)2.00g、琥珀酸酐0.7506g，4-二甲氨基吡啶(DMAP)0.12217g，量取甲苯10mL，加入到125mL的锥形瓶中，加入搅拌子，装好冷凝回流装置，油浴加热，在110℃下反应10小时，停止加热，冷却至室温，取出样品经旋转蒸发除去溶剂得到反应产物植物甾醇琥珀酸单酯。
实施例2 中间产物2植物甾醇琥珀酸乙烯酯的制备及鉴定
植物甾醇多元酸乙烯酯的制备与分析以植物甾醇琥珀酸乙烯酯为例。称取分离纯化后的植物甾醇琥珀酸单酯5.12g、乙酸汞0.2g，量取乙酸乙烯酯0.15moL、四氢呋喃10mL，加入到125mL的锥形瓶中，在通氮气的情况下室温搅拌反应30min，然后加入2uL浓硫酸，然后在40℃下反应，每间隔2小时取样用薄层层析硅胶板点样检测反应进程，反应12小时，停止加热，冷却至室温，加入20mg的醋酸钠中和并停止反应，取出样品经旋转蒸发除去溶剂得到反应产物植物甾醇琥珀酸乙烯酯。
植物甾醇琥珀酸乙烯酯的液相图分析以豆甾醇琥珀酸乙烯酯为例。将植物甾醇琥珀酸乙烯酯进行高效液相色谱分析，其中，豆甾醇琥珀酸乙烯酯(图1中b)的出峰时间为16.473，豆甾醇琥珀酸单酯(图1中a)的出峰时间为12.223，如图1所示。
植物甾醇琥珀酸乙烯酯的红外谱图分析以豆甾醇琥珀酸乙烯酯为例。豆甾醇琥珀酸乙烯酯的红外光谱如图2所示，分析如下：2924.38cm
植物甾醇琥珀酸乙烯酯的质谱分析以豆甾醇琥珀酸乙烯酯为例。豆甾醇琥珀酸乙烯酯的质谱图谱如图3所示，分析如下：豆甾醇单酯的相对分子质量为512，乙酸乙烯酯的相对分子质量为86，因此豆甾醇琥珀酸乙烯酯的相对分子质量为538。豆甾醇琥珀酸乙烯酯在ES+电离下，可能存在豆甾醇琥珀酸乙烯酯的[M+H]+、[M+NH4]+和[M+Na]+的分子离子峰，图3中561.5为豆甾醇琥珀酸乙烯酯的[M+Na]+的质谱信号。因此，产物为豆甾醇琥珀酸乙烯酯。
实施例3 终产物植物甾醇琥珀酸肌醇酯的制备及鉴定
植物甾醇多元酸肌醇酯的制备与分析以植物甾醇琥珀酸肌醇酯为例。称取分离纯化后的植物甾醇琥珀酸乙烯酯0.16g、肌醇0.25g、褶皱假丝酵母(Candida Rugosa)0.1g，分别加入到预先经过分子筛脱水处理的正己烷和2-丁酮的混合溶液(85/15,V/V)10mL的反应瓶中，密闭，并将反应瓶放入恒温振荡器中200rpm的震荡速度震荡，并且控制反应温度为45℃，定期取样检测反应的进程，经过120h的反应，停止加热，冷却至室温，取出样品经旋转蒸发除去溶剂得到反应产物。
植物甾醇琥珀酸肌醇酯的液相图分析以豆甾醇琥珀酸肌醇酯为例。通过高效液相色谱分析，植物甾醇琥珀酸肌醇酯中豆甾醇琥珀酸肌醇酯的出峰时间为11.299，如图4所示。
植物甾醇琥珀酸肌醇酯的红外谱图分析以豆甾醇琥珀酸肌醇酯为例。豆甾醇琥珀酸肌醇酯的红外光谱如图5所示，分析如下：3385.02cm
植物甾醇琥珀酸肌醇酯的质谱分析以豆甾醇琥珀酸肌醇酯为例。植物甾醇珀酸肌醇酯的分析以豆甾醇琥珀酸肌醇酯为例。豆甾醇琥珀酸肌醇酯的质谱图谱如图6所示，分析如下：豆甾醇琥珀酸乙烯酯的相对分子质量为538，肌醇的相对分子质量为180，因此豆甾醇琥珀酸肌醇酯的相对分子质量为674。豆甾醇琥珀酸肌醇酯在ES+电离下，可能存在豆甾醇琥珀酸肌醇酯的[M+H]+、[M+NH4]+和[M+Na]+的分子离子峰，图6中697为豆甾醇琥珀酸肌醇酯的[M+Na]+的质谱信号。因此，产物为豆甾醇琥珀酸肌醇酯。
实施例4 中间产物2植物甾醇琥珀酸乙烯酯反应参数优化过程
1)反应温度对合成中间产物2植物甾醇琥珀酸乙烯酯的影响
在实施例2的基础上，将反应温度设置为变量，其他反应条件不变，分别控制反应温度为20℃、30℃、40℃、50℃、60℃，当反应达到12小时的时候，进行采样检测，计算酯化率。结果表明在温度达到50℃时，酯化率达到最高，继续提高温度，酯化率不再上升。不同温度下的酯化率如表1所示：
表1 反应温度对合成中间产物2的影响
2)反应时间对合成中间产物2植物甾醇琥珀酸乙烯酯的影响
在实施例2的基础上，将反应时间设置为变量，其他反应条件不变，分别在反应时间到6、8、10、12、14h进行采样检测，计算酯化率。结果表明反应时间到达12h的时候，酯化率达到最高。不同时间的酯化率如表2所示：
表2 反应时间对合成中间产物2的影响
3)催化剂用量对合成中间产物2植物甾醇琥珀酸乙烯酯的影响
在实施例2的基础上，将催化剂用量设置为变量，其他反应条件不变，分别在将乙酸汞的添加量设置为2、3、4、5、6％w/w，待反应结束后进行采样检测，计算酯化率。结果表明催化剂添加量为5％w/w的时候，酯化率最高。不同催化剂添加量的酯化率如表3所示：
表3 催化剂乙酸汞的用量对合成中间产物2的影响
4)底物摩尔比对合成中间产物2植物甾醇琥珀酸乙烯酯的影响
在实施例2的基础上，将底物摩尔比设置为变量，其他反应条件不变，分别在将乙酸乙烯酯的添加量设置为5、10、15、20、25mol，待反应结束后进行采样检测，计算酯化率。结果表明乙酸乙烯酯：植物甾醇琥珀酸单酯为20:1.0的时候，酯化率最高。不同摩尔比的酯化率如表4所示：
表4 乙酸乙烯酯与植物甾醇琥珀酸单酯的摩尔比对合成中间产物2的影响
5)植物甾醇琥珀酸单酯浓度对合成中间产物2植物甾醇琥珀酸乙烯酯的影响
在实施例2的基础上，将植物甾醇琥珀酸单酯的浓度设置为变量，其他反应条件不变，分别在反应结束后进行采样检测，计算酯化率。结果表明植物甾醇琥珀酸单酯浓度为0.6mmol/mL的时候，酯化率最高。不同植物甾醇琥珀酸单酯浓度的酯化率如表5所示：
表5 植物甾醇琥珀酸单酯浓度对合成中间产物2的影响
实施例5 终产物植物甾醇琥珀酸肌醇酯的制备及鉴定
1)反应温度对合成终产物植物甾醇琥珀酸肌醇酯的影响
在实施例3的基础上，将反应温度设置为变量，其他反应条件不变，分别控制反应温度为30℃、35℃、40℃、45℃、50℃，当反应达到120小时的时候，进行采样检测，计算酯化率。结果表明当反应温度达到45℃的时候，酯化率达到最高。不同温度的酯化率如表6所示：
表6 反应温度对合成终产物的影响
2)反应时间对合成终产物植物甾醇琥珀酸肌醇酯的影响
在实施例3的基础上，将反应时间设置为变量，其他反应条件不变，分别在反应时间到40、60、80、100、120h进行采样检测，计算酯化率。结果表明反应时间为120h的时候，酯化率最高。不同时间的酯化率如表7所示：
表7 反应时间对合成终产物的影响
3)酶用量对终产物植物甾醇琥珀酸肌醇酯的影响
在实施例3的基础上，将酶用量设置为变量，其他反应条件不变，分别在将脂肪酶的添加量设置为20、40、60、80、100g/L，待反应结束后进行采样检测，计算酯化率。当脂肪酶的添加量设置为80g/L时，酯化率达到最高。不同酶添加量的酯化率如表8所示：
表8 酶用量对合成终产物的影响
4)底物摩尔比对合成终产物植物甾醇琥珀酸肌醇酯的影响
在实施例3的基础上，将底物摩尔比设置为变量，其他反应条件不变，分别在将肌醇的添加量设置为0.090、0.1350、0.1800、0.2250g，待反应结束后进行采样检测，计算酯化率。结果表明植物甾醇琥珀酸乙烯酯：肌醇为1.0:3.0时的酯化率最高。不同底物摩尔比的酯化率如表9所示：
表9 底物摩尔比对合成终产物的影响
5)植物甾醇琥珀酸乙烯酯浓度对合成终产物的影响
在实施案例2的基础上，将植物甾醇琥珀酸单酯的浓度设置为变量，其他反应条件不变，分别在反应结束后进行采样检测，计算酯化率。结果表明植物甾醇琥珀酸乙烯酯浓度为0.025mmol/L时酯化率最高。酯化率如表10所示：
表10 植物甾醇琥珀酸乙烯酯浓度对合成终产物的影响
实施例6 中间产物2植物甾醇琥珀酸乙烯酯的纯化过程
以豆甾醇琥珀酸乙烯酯为例，通过薄层色谱探索适合硅胶柱层析分离豆甾醇琥珀酸乙烯酯的洗脱溶剂为：石油醚/乙酸乙酯/甲酸：9/2/0.01。将320g 100-200目柱层析硅胶G放入烧杯，加入一定洗脱溶剂，充分搅匀，呈匀浆状态，室温下浸泡3h。将充分浸泡的硅胶G缓缓装入扩口层析柱(2.5cm×100cm)，避免气泡出现，待硅胶充分沉降后，静置一晚，待用。将4g样品溶于20mL洗脱溶剂，上样，用洗脱剂洗脱硅胶柱，用自动收集器收集洗脱液，8min/管，并用薄层色谱分析跟踪洗脱产物，将比移值(Rf)一致的产物合并收集，经旋转蒸发去掉溶剂后为豆甾醇琥珀酸乙烯酯。
实施例7 终产物植物甾醇琥珀酸肌醇酯的纯化过程
以豆甾醇琥珀酸乙烯酯为例，通过薄层色谱探索适合硅胶柱层析分离豆甾醇琥珀酸乙烯酯的洗脱溶剂为：石油醚/乙酸乙酯/甲酸：13/7/0.02。将320g 100-200目柱层析硅胶G放入烧杯，加入一定洗脱溶剂，充分搅匀，呈匀浆状态，室温下浸泡3h。将充分浸泡的硅胶G缓缓装入扩口层析柱(2.5cm×100cm)，避免气泡出现，待硅胶充分沉降后，静置一晚，待用。将4g样品溶于20mL洗脱溶剂，上样，用洗脱剂洗脱硅胶柱，用自动收集器收集洗脱液，8min/管，并用薄层色谱分析跟踪洗脱产物，将比移值(Rf)一致的产物合并收集，经旋转蒸发去掉溶剂后为豆甾醇琥珀酸肌醇酯。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
一种植物甾醇多元酸肌醇酯及其制备方法专利购买费用说明
Q：办理专利转让的流程及所需资料
A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。
1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。
2：按规定缴纳著录项目变更手续费。
3：同时提交相关证明文件原件。
4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。
Q:专利著录项目变更费用如何缴交
A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式
Q：专利转让变更，多久能出结果
A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。
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