专利摘要
本发明公开了一种利用混合菌固态发酵制备米糠活性肽的方法，包括：利用黑曲霉AS3.410、AS3.350、AS3.365和米曲霉AS3.910混合菌种进行米糠的固态发酵培养，首先将斜面菌种活化，生成种子培养基，再将四种菌丝混合接种于已灭菌的米糠中，固态培养，经过分离干燥后得到米糠混合态。本发明选用高产纤维素酶、淀粉酶、果胶酶、糖化酶、脂肪酶和蛋白酶等的复合微生物菌群，通过固态发酵法直接发酵米糠，不仅提高了发酵物的营养水平，同时对某些苦味肽基团进行修饰和重组，使制得的米糠肽基本无苦味和异味，生产工艺简化，可有效降低生产成本，无污染，适合大规模工业化生产米糠活性肽。
权利要求
1.一种利用混合菌固态发酵制备米糠活性肽的方法，包括以下步骤：
(1)菌种的活化：将黑曲霉AS3.410、AS3.350、AS3.365和米曲霉AS3.910斜面菌种分别转接到液体活化培养基中，培养至生成均一小菌丝球；
(2)米糠培养基的配制：在新鲜米糠中加入蒸馏水，混合均匀后装入250mL的三角瓶，充分灭菌；
(3)混合菌种的制备：分别将四种菌丝球分割成大小均匀的菌片，配制成混合菌种；
(4)将混合菌种加入(2)已灭菌的米糠培养基中，并摇匀；
(5)将(4)已接种的米糠培养基放入霉菌培养箱中培养；
(6)膜分离：将步骤(5)所得的发酵液置于离心机中分离，收集上清液，将上清液通过截流分子量为3000Da的膜进行分离，收集透过液，浓缩干燥后得到米糠活性肽。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)所述黑曲霉AS3.410、AS3.350、AS3.365和米曲霉AS3.910斜面菌种的活化条件为：28-32℃，140-160rpm振荡培养45-50h，生成均一小菌丝球。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)所述米糠培养基的配制中，米糠质量与蒸馏水的体积比为0.4-0.5g/mL，灭菌条件为100-121℃充分灭菌2-6小时。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)混合菌种的制备中，分别将黑曲霉AS3.410、AS3.350、AS3.365和米曲霉AS3.910的菌丝按1∶2∶4∶3的质量比配制成混合菌种。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(4)中将混合菌种按5-15％(w∶w)的比例接种到(2)已灭菌的米糠中。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(5)中的培养条件为相对湿度70-90％、温度为28-32℃，培养5-6天。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(6)中膜过滤压力位1-2kg/cm2，透过量为30-35mL/min。
8.权利要求1-7所述的方法制备的活性肽，其特征在于：活性肽分子量集中在10000Da以下，主要由3-10个氨基酸构成的小肽。
说明书
技术领域
本发明涉及生物活性蛋白制备领域，具体涉及一种混合菌种固态发酵制备米糠活性肽的方法。
背景技术
米糠蛋白中必需氨基酸齐全，生物效价较高，氨基酸组成更接近FAO/WHO的推荐模式，其功效比值为2.0～2.5。米糠蛋白主要由清蛋白、球蛋白、谷蛋白以及醇溶蛋白大致按37∶36∶22∶5的质量比构成，其中可溶性蛋白质约占70％，其蛋白质含量、应用性功能(如乳化性、溶解性、稳定性等)均与大豆分离蛋白相似。此外，米糠蛋白质最大的优点为低过敏性，是已知谷物中过敏性最低的蛋白质。所以利用酶解米糠蛋白质生产具有高生物活性的米糠活性肽具有广阔的市场前景(樊金娟，等.米糠抗氧化肽的抗衰老作用，食品科学.2010，31(23)：40-43)。
目前，国内外活性肽的制取方法主要有分离提取法、酶法、化学合成法、基因重组法等。其中酶法直接水解蛋白可以在不降低营养价值的前提下改善蛋白质的理化和功能性质，生产活性肽安全性极高，受到广泛重视。在营养蛋白多肽链内部可能普遍存在着功能区，选择适当的蛋白酶水解这些多肽，有可能将其释放出来，从而制备各种功能肽。米糠活性肽的制备技术主要以抗氧化为目的。李喆(2012)利用碱性蛋白酶酶解米糠蛋白制备活性肽其对DPPH自由基的清除率最高为68.7％(李喆，翟爱华.米糠蛋白抗氧化肽的制备及初步分离.黑龙江八一农垦大学学报，2012，24(3)：56-59.)。贾俊强等利用中性蛋白酶酶解制备出大米抗氧化混合肽，其清除DPPH的能力可达到74.8％(贾俊强，等.超声预处理大米蛋白制备抗氧化肽.农业工程学报，2008，24(8)：288-293)。CN 101434980B的中国发明专利公布了一种制备米糠短肽的方法，该发明通过添加复合蛋白酶水解蛋白质，获得米糠短肽；CN 10208011A的中国发明专利申请公布了一种米糠抗氧化肽的制备技术，采用碱法制备米糠蛋白，再利用复合蛋白酶酶解获得具有抗氧化活性的米糠蛋白肽；CN10174818A的中国发明专利申请公布了一种米糠抗氧化肽的制备方法，其中采用了碱性蛋白酶解法。
如上所述，目前常利用“碱溶酸沉”制备米糠蛋白质，不仅蛋白质纯度低，且易生成有毒物质，同时会带入大量盐离子使产品涩味过高；在活性肽的制备过程中，利用2-3种酶直接酶解米糠蛋白，由于米糠蛋白分子间含有大量聚合较强难以分离的二硫键和表面疏水性氨基酸残基，水溶性较差，制备的活性肽不仅纯度和得率低，也影响了其生物学活性；而且直接使用酶价格相对较高，酶解产物在很大程度都存在着苦味还需进行脱苦工艺。近年来，虽也利用微生物尝试对米糠进行固态发酵，但由于其产酶种类和能力所限，使产物的抗氧化能力较低(邓文辉.益生菌固态发酵黑米糠抗氧化发酵条件研究.食品与发酵科技，2013，49(2)：50-54))。上述问题制约了米糠功能肽的发展和应用，难以规模化生产。
发明内容
本发明提供了一种利用混合菌固态发酵制备米糠活性肽的方法，直接以新鲜米糠为原料，采用食品级微生物黑曲霉AS3.410、AS3.350、AS3.365和米曲霉AS3.910(购自沈阳市易昂生物技术有限公司)。
混合菌种进行固态发酵培养，获得米糠活性肽。生产工艺简化，可有效降低生产成本，无污染，适合大规模工业化生产米糠活性肽。
一种利用混合菌固态发酵制备米糠活性肽的方法，包括以下步骤：
(1)菌种的活化：将黑曲霉AS3.410、AS3.350、AS3.365和米曲霉AS3.910斜面菌种分别转接到液体活化培养基中，培养至生成均一小菌丝球；
(2)米糠培养基的配制：在新鲜米糠中加入蒸馏水，混合均匀后装入250mL的三角瓶，充分灭菌；
(3)混合菌种的制备：分别将四种菌丝球分割成大小均匀的菌片，配制成混合菌种；
(4)将混合菌种加入(2)已灭菌的米糠中，并摇匀；
(5)将(4)已接种的米糠放入霉菌培养箱中培养；
(6)膜分离：将步骤(5)所得的发酵液置于离心机中分离，收集上清液，将上清液通过截流分子量为3000Da的膜进行分离，收集透过液，浓缩干燥后得到米糠活性肽。
在上述制备过程中，
步骤(1)所述黑曲霉AS3.410、AS3.350、AS3.365和米曲霉AS3.910斜面菌种的活化条件为：28-32℃，140-160rpm振荡培养45-50h，生成均一小菌丝球。因黑曲霉、米曲霉需活化48h后方可达到菌体生长的对数期，采用上述条件培养，有利于菌种的增殖。液体活化培养基：NaNO33g、K2HPO41g、MgSO4·7H2O 0.5g、KCl 0.5g、FeSO40.01g、蔗糖30g、蒸馏水1000ml，自然pH值。
步骤(2)所述米糠培养基的配制中，米糠质量与蒸馏水的体积比为0.4-0.5g/mL，灭菌条件为100-121℃充分灭菌2-6小时。在此条件下，米糠培养基灭菌充分彻底。
步骤(3)混合菌种的制备中，分别将黑曲霉AS3.410、AS3.350、AS3.365和米曲霉AS3.910的菌丝按1∶2∶4∶3的质量比配制成混合菌种。上述质量比的复合微生物菌群，能够产生纤维素酶、淀粉酶、果胶酶、糖化酶、脂肪酶和蛋白酶等复合酶，产酶能力和种类有利于米糠肽的制备。
步骤(4)中将混合菌种按5-15％(W∶W)的比例接种到(2)已灭菌的米糠中。采用上述质量比能够提高米糠肽的得率。
步骤(5)中的培养条件为相对湿度70-90％、温度为28-32℃，培养5-6天。培养时间过短或过长，能够导致发酵不充分或部分微生物死亡，影响微生物产酶效果和蛋白质的酶解，在此条件下能够较好的控制蛋白质水解进程，制备的活性肽具有较强的抗氧化能力。
步骤(6)中膜过滤压力位1-2kg/cm2，透过量为30-35mL/min。在此条件下，能够获得目的片段，保证得到较高纯度和活性的米糠肽。
上述方法获得的米糠活性肽分子量集中在10000Da以下，主要是由3-10个氨基酸构成的小肽。
本发明的优点
(1)本发明利用不同微生物的产酶特点，采用食品级微生物黑曲霉AS3.410、AS3.350、AS3.365和米曲霉AS3.910组成的复合菌群，通过固态发酵法直接发酵米糠生产活性肽，无需对米糠蛋白进行分离纯化和额外添加蛋白酶，生产工艺简单且无污染，可有效的降低生产成本，节约资源和能源，适合大规模工业化生产米糠活性肽。
(2)本发明制备的米糠活性肽，利用微生物在生长过程中产生的纤维素酶、淀粉酶、果胶酶、糖化酶、脂肪酶和蛋白酶等复合酶直接作用于米糠，提高了米糠肽的得率，制备的活性肽具有较强的抗氧化能力，对羟自由基、超氧阴离子和DPPH自由基的清除能力分别为90.53％、50.48％和91.02％，且在还原力方面也表现出较高的生物学活性，最高达到79.3％。制备的米糠活性肽可用于食品配方、功能性食品、食品添加剂、药品、化妆品、无公害饲料添加剂等。
具体实施方式
实施例1
将黑曲霉AS3.410、AS3.350、AS3.365和米曲霉AS3.910斜面菌种分别转接到液体活化培养基中，在28℃，140rpm振荡培养50h，生成均一小菌丝球；分别将四种菌丝球分割成大小相等菌片，分别将黑曲霉AS3.410、AS3.350、AS3.365和米曲霉AS3.91的菌丝按1∶2∶4∶3的质量比配制成混合菌种。在新鲜米糠中按质量与体积比为0.4g/mL加入蒸馏水，混合均匀后装入250mL的三角瓶，灭菌条件为110℃充分灭菌5小时。将混合菌种按10％(W∶W)的比例接种到已灭菌的米糠中，并摇匀；放入霉菌培养箱中在相对湿度70％、温度为28℃的条件下培养6天。将所得的发酵液置于离心机中4000rpm离心40min，收集上清液，将上清液通过截流分子量为3000Da的膜进行分离，过滤条件为1.0kg/cm2，透过量为30mL/min，收集透过液，浓缩干燥后得到分子量集中在10000Da以下，主要由3-10个氨基酸构成的小肽。
实施例2
将黑曲霉AS3.410、AS3.350、AS3.365和米曲霉AS3.910斜面菌种分别转接到液体活化培养基中，在30℃，150rpm振荡培养48h，生成均一小菌丝球；分别将四种菌丝球分割成大小相等菌片，分别将黑曲霉AS3.410、AS3.350、AS3.365和米曲霉AS3.91的菌丝按1∶2∶4∶3的质量比配制成混合菌种。在新鲜米糠(购置沈阳千重浪稻业公司)中按质量与体积比为0.45g/mL加入蒸馏水，混合均匀后装入250mL的三角瓶，灭菌条件为115℃充分灭菌4小时。将混合菌种按12％(W∶W)的比例接种到已灭菌的米糠中，并摇匀；放入霉菌培养箱中在相对湿度80％、温度为30℃的条件下培养6天。将所得的发酵液置于离心机中5000rpm离心30min，收集上清液，将上清液通过截流分子量为3000Da的膜进行分离，过滤条件为1.kg/cm2，透过量为33mL/min，收集透过液，浓缩干燥后得到分子量集中在10000Da以下，主要由3-10个氨基酸构成的小肽。
实施例3
将黑曲霉AS3.410、AS3.350、AS3.365和米曲霉AS3.910斜面菌种分别转接到液体活化培养基中，在32℃，160rpm振荡培养45h，生成均一小菌丝球；分别将四种菌丝球分割成大小相等菌片，分别将黑曲霉AS3.410、AS3.350、AS3.365和米曲霉AS3.910的菌丝按1∶2∶4∶3的质量比配制成混合菌种。在新鲜米糠中按质量与体积比为0.5g/mL加入蒸馏水，混合均匀后装入250mL的三角瓶，灭菌条件为121℃充分灭菌3小时。将混合菌种按15％(W∶W)的比例接种到已灭菌的米糠中，并摇匀；放入霉菌培养箱中在相对湿度90％、温度为32℃的条件下培养5天。将所得的发酵液置于离心机中5000rpm离心25min，收集上清液，将上清液通过截流分子量为3000Da的膜进行分离，过滤条件为2kg/cm2，透过量为35mL/min，收集透过液，浓缩干燥后得到分子量集中在10000Da以下，主要由3-10个氨基酸构成的小肽。
米糠活性肽抗氧化能力测定
1.对羟自由基的清除能力
参考何军山等的方法(何军山，等.体外羟自由基测定条件的优化与应用.卫生研究.，2008，37(5)：617-618.)。用H2O2启动FeSO4产生·OH，以·OH氧化水杨酸钠所得产物的吸光值表示.OH的多少，吸光值越大，·OH越多。将实施例1制备的米糠活性肽干粉用无菌蒸馏水配成0，0.08，0.16，0.24，0.32，0.40，0.48，0.56mg/mL的米糠肽液各0.5mL。每个反应体系中分别加入1mL 9mmol/LFeSO4，1mL 9mmol/L水杨酸钠，0.5mL不同浓度的米糠肽液，最后加入1mL 8.8mmol/LH2O2启动反应，37℃水浴30min，以蒸馏水作参比，与试剂空白液作比较，于510nm下测各反应液的吸光值。按下式计算清除率：
清除率/％＝[A0-(Ai-Ai0)]/A0×100％
A0为对照，为米糠多肽液浓度为0的吸光值；
Ai为某浓度时的吸光值；
Ai0为无显色剂时该浓度的本底值。
2.对超氧阴离子的清除能力
采用邻苯三酚自氧化法(张宏，谭竹钧.2002.四种邻苯三酚自氧化法测定超氧化物歧化酶活性方法的比较.内蒙古大学学报(自然科学版)，33(6)：677-681.)。具体做法如下：在含有50mmol/LTris-HCl(pH＝8.2，内含1mmol/LEDTA)1.mL、去离子水1.0mL的试管中，分别加入上述实施例1制备的米糠肽液各0.1mL(将实施例1制备的米糠活性肽干粉用无菌蒸馏水配成0，0.08，0.16，0.24，0.32，0.40，0.48，0.56mg/mL的米糠肽液)，25℃水浴保温15min，以米糠肽液浓度为0的浓度为空白对照管，最后加入同样25℃水浴保温15min的3mmol/L邻苯三酚(用10mmol/LHCl配制)0.1mL，立即于320nm下0～300s每隔60s记录一次吸光值，分别得dA0/dt，dA样/dt(dA0/dt、dA样/dt分别表示未加入和加入抑制物时PR自氧化的速率，即每lmin其光吸收的平均变化率)。
清除率/％＝(1-dA样/dt/dA0/dt)×100％
3.DPPH自由基的清除能力
参考张强等的方法(张强，王松华，孙玉军，冯付春.体外化学模拟体系中米糠肽抗氧化活性的研究.食品与发酵工业.2008，34(4)：49-51)。精确称取DPPH9.7mg，加少量无水乙醇溶解后，以95％乙醇定容至250mL，制成浓度为0.2mmol/L的DPPH溶液。取2mL已配制的DPPH溶液，分别加入上述实施例1制备的米糠肽2mL(将实施例1制备的米糠活性肽干粉用无菌蒸馏水配成0，0.08，0.16，0.24，0.32，0.40，0.48，0.56mg/mL的米糠肽液)于试管中，混合均匀，反应20min，4000/min下离心10min，取上清液在波长517nm处，测其吸光度A1；另取2mL不同浓度的米糠肽液于试管中，加入2mL无水乙醇，反应20min，4000r/min下离心10min，取上清液在波长517nm处测其吸光度A2；以2mLDPPH溶液和2mL无水乙醇反应做为参照，其吸光度记为A0。按照下式计算米糠多肽液对DPPH自由基的清除率：
清除率/％＝[1-(A1-A2)/A0]×100％
式中，A0为2mLDPPH溶液加2mL无水乙醇时的吸光度；
A1为2mLDPPH溶液加2mL米糠多肽液时的吸光度；
A2为2mL无水乙醇加2mL米糠多肽液时的吸光度。
4.还原力的测定
取上述实施例1制备的不同浓度米糠肽(将实施例1制备的米糠活性肽干粉用无菌蒸馏水配成0，0.08，0.16，0.24，0.32，0.40，0.48，0.56mg/mL的米糠肽)各1mL于试管中，依次加入2.5mL0.2mol/L磷酸缓冲液(pH＝6.6)和2.5mL质量分数1％铁氰化钾混匀，于55℃恒温水浴中温育20min后，迅速冷却，加入2.5mL质量分数10％的三氯乙酸混合后，以3000r/min离心10min，取上清液2.5mL，依次加入2mL蒸馏水和0.5mL质量分数0.1％的三氯化铁溶液，充分混合，静置10min后，于700nm处测定吸光度值，吸光度越大，表示还原能力越强。用蒸馏水作参比，Vc为阳性对照。
还原力＝样品吸光度-空白对照组吸光度
5.实验结论
按照上述实验方式，对本发明所获得的米糠活性肽进行抗氧化能力测定，得出如下的实验结果：对羟自由基、超氧阴离子和DPPH自由基的清除能力分别为90.53％、50.48％和91.02％，还原力最高达到79.3％。以往对米糠活性肽抗氧化能力的评价主要集中在对DPPH自由基的清除上，李喆(李喆，翟爱华.米糠蛋白抗氧化肽的制备及初步分离.黑龙江八一农垦大学学报，2012，24(3)：56-59.)和贾俊强等(贾俊强，等.超声预处理大米蛋白制备抗氧化肽.农业工程学报，2008.24(8)：288-293)利用酶法制备的米糠活性肽对其清除率分别为68.7％和74.8％；邓文辉等利用益生菌发酵得到的米糠肽对其清除能力最高为74％(邓文辉.益生菌固态发酵黑米糠抗氧化发酵条件研究.食品与发酵科技，2013，49(2)：50-54))。说明实例1制备米糠活性肽不仅在DPPH自由基的清除能力方面表现出较强的优势，在清除羟自由基、超氧阴离子和还原力方面也具有较高的活性，抗氧化能力强，可用于食品配方、功能性食品、食品添加剂、药品、化妆品、无公害饲料添加剂等。
一种混合菌种固态发酵制备米糠活性肽的方法专利购买费用说明
Q：办理专利转让的流程及所需资料
A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。
1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。
2：按规定缴纳著录项目变更手续费。
3：同时提交相关证明文件原件。
4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。
Q:专利著录项目变更费用如何缴交
A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式
Q：专利转让变更，多久能出结果
A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。
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