专利摘要

本发明提供了2-N[7-硝基苯-2-乙二酸,3-4羟氨基]-2-脱氧葡萄糖的合成方法，它具有如下操作步骤：取氨基葡萄糖盐酸盐、碱、4-氯-7-硝基苯呋咱，在反应溶剂中，10-60℃下反应15-20h，待反应结束后，除去溶剂，经硅胶柱层析，即得2-NBDG；所述反应溶剂为DMF、甲醇、含水甲醇、乙醇、甲苯中的一种或两种以上的混合；所述碱为碳酸氢钠、碳酸钠、碳酸钾或三乙胺。本发明通过对合成方法的优选，在使用价格低廉的NBD-Cl为原料时，就能够保证较高的2-NBDG的收率，极大地节省了生产成本，且该反应条件温和，操作简便，为2-NBDG的工业化生产提供了基础，为降低2-NBDG的昂贵售价提供了可能，具有良好的工业应用前景。

权利要求

1.2-N[7-硝基苯-2-乙二酸,3-4羟氨基]-2-脱氧葡萄糖的合成方法，其特征在于：操作步骤如下：

取氨基葡萄糖盐酸盐、碱、4-氯-7-硝基苯呋咱，在反应溶剂中，20-60℃下反应15-20h，待反应结束后，除去溶剂，经硅胶柱层析，即得目标产物；

所述反应溶剂为DMF、甲醇、含水甲醇、乙醇、甲苯中的一种或两种以上的混合溶剂；所述碱为碳酸氢钠、碳酸钠、碳酸钾或三乙胺。

2.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于：所述反应溶剂为DMF、甲醇或浓度大于40%v/v的含水甲醇；所述碱为三乙胺。

3.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于：所述反应溶剂为甲醇。

4.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于：反应温度为28-32℃。

5.根据权利要求4所述的合成方法，其特征在于：反应温度为30℃。

6.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于：反应时间为15-20h。

7.根据权利要求6所述的合成方法，其特征在于：反应时间为15-16h。

8.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于：碱与4-氯-7-硝基苯呋咱的摩尔比为（2.2-3.5）：1。

9.根据权利要求8所述的合成方法，其特征在于：碱与4-氯-7-硝基苯呋咱的摩尔比为3：1。

10.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于：氨基葡萄糖盐酸盐与4-氯-7-硝基苯呋咱的摩尔比为（1-1.5）：1，优选为1.2：1。

说明书

技术领域

本发明涉及2-NBDG的合成方法，即2-N[7-硝基苯-2-乙二酸,3-4羟氨基]-2-脱氧葡萄糖的合成。

背景技术

2-NBDG，即2-N[7-硝基苯-2-乙二酸,3-4羟氨基]-2-脱氧葡萄糖，是2-脱氧葡萄糖(2-DG)荧光类似物，是一种常用的生化荧光试剂，目前多将其应用于疾病检测中的光学成像技术，特别是用于对肿瘤的检测（胡慧，等，江苏大学学报（医学版），2010年20卷3期，p216~219）。该化合物在成像技术方面具有优异效果，但其市面售价较高，约为5mg/2000元，目前还无法大量投入使用。

2-NBDG的制备方法，是导致其高售价的主要原因。目前报道的2-NBDG的合成方法，主要分为两种：

方法一、通过NBD-Cl和GlcN反应来合成2-NBDG

2007年Yamada,K.报道了的合成2-NBDG的方法，这是目前报道的通过NBD-Cl来合成2-NBDG较为理想的方法。其合成步骤如下：

该方法收率仅有12%，收率较低导致了2-NBDG的高售价。（Yamada,K.;Saito,M.;Matsuoka,H.;Inagaki,N.Nat.Protoc.2007,2,753–762.）

方法二、通过NBD-F和GlcN反应来合成2-NBDG

2011年在Jung,M.E.报道的文章中[Tetrahedron Letters52(2011)2533-2535]，首次利用NBD-F来合成2-NBDG，其收率有了明显的提高，其合成方法为：

（一）、

将NBD-F(48.7mg,0.266mmol,1.1equiv)和氨基葡萄糖盐酸盐（52.4mg 0.243mmol,1.0 equiv)加入到1mL乙腈中，然后加入0.3M NaHCO₃(0.315mmol,1.2equiv)溶液1ml，然后在黑暗的环境下将混合液在23°C条件下搅拌28h后溶液变为了红黑色/黑色。待反应结束后用硅藻土过滤，用甲醇洗，滤液旋干、用硅胶柱层析，最后得到红色粉末状产物(62mg,75%)。

（二）、

将NBD-F(52.1mg,0.285mmol,1.0equiv)和氨基葡萄糖盐酸盐(64.5mg,0.299mmol,1.1equiv)加入到圆底烧瓶中，然后加入0.5mL DMF和三乙胺(0.08mL,0.569mmol,2.0equiv)。然后在黑暗的环境下将混合液在23°C条件下搅拌28h，待反应结束后将混合物真空浓缩，用硅胶柱层析，最后得到红色粉末状产物(63.2mg,65%)。

该方法中，采用NBD-F为原料进行合成，2-NBDG的收率可高达65%-75%，显著提高了产品收率。然而，该方法中使用的NBD-F，其价格昂贵，其市场售价大约是NBD-Cl的100倍以上，使得该方法的制备成本显著提高，这也是导致2-NBDG昂贵的另一个原因；同时，NBD-F见光容易分解，不容易保存，最好是现制现用，而且反应要在避光的条件下进行，不便于工业化大生产。

因此，寻求一条更加经济、简便、高效的方法来合成2-NBDG仍然具有其研究价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的2-N[7-硝基苯-2-乙二酸,3-4羟氨基]-2-脱氧葡萄糖的合成方法。

本发明提供了2-NBDG的合成方法，其操作步骤如下：

取氨基葡萄糖盐酸盐、碱、4-氯-7-硝基苯呋咱，在反应溶剂中，20-60℃下反应15-20h，待反应结束后，除去溶剂，经硅胶柱层析，即得目标产物；

所述反应溶剂为DMF、甲醇、含水甲醇、乙醇、甲苯中的一种或两种以上的混合溶剂；所述碱为碳酸氢钠、碳酸钠、碳酸钾或三乙胺。

反应式如下：

进一步地，所述反应溶剂为DMF、甲醇或浓度大于40%v/v的含水甲醇。

进一步优选地，所述反应溶剂为甲醇。

进一步优选地，所述碱为三乙胺。

进一步地，反应温度为28-32℃。

进一步优选地，反应温度为30℃。

进一步地，反应时间为15-20h。

进一步优选地，反应时间为15-16h。

其中，碱与4-氯-7-硝基苯呋咱的摩尔比为（2.2-3.5）：1。

进一步地，碱与4-氯-7-硝基苯呋咱的摩尔比为3：1。

其中，氨基葡萄糖盐酸盐与4-氯-7-硝基苯呋咱的摩尔比为（1-1.5）：1。

进一步地，氨基葡萄糖盐酸盐与4-氯-7-硝基苯呋咱的摩尔比为1.2：1。

本发明通过对合成方法的优选，在使用价格低廉的NBD-Cl为原料时，就能够保证较高的2-NBDG的收率，极大地节省了生产成本，且该反应条件温和，操作简便，为2-NBDG的工业化生产提供了基础，为降低2-NBDG的昂贵售价提供了可能，具有良好的工业应用前景。

具体实施方式

实施例1本发明2-NBDG的合成方法

首先将氨基葡萄糖盐酸盐(1293mg,6mmol,1.2equiv)加入到圆底烧瓶中，然后加入15ml甲醇和三乙胺(1515mg,15mmol,3equiv),将反应混合物在30°C条件下搅拌1h，然后加入NBD-Cl(997.5mg,5mmol,1equiv)和甲醇15ml，继续在30°C条件下反应15h，反应混合物逐渐变为黑绿色。待反应结束后，将反应液定容至50ml的容量瓶中，然后在HPLC中进样10μl，平行进样三次，根据峰面积的平均值采用外标法计算收率，收率为82.4%。待反应结束后，真空浓缩除去甲醇，然后用(DCM:MeOH)硅胶柱层析，最后得到红色粉末状产物，计算收率，收率也可以达到80%。

对上述粉末状产物进行鉴定，结果表明，该产物为2-NBDG，其结构式如下：

具体数据如下：

高分辨质谱：(C₁₂H₁₄N₄O₈+Na)⁺m/z 365.0704,found m/z 365.0710.

¹HNMR(300MHz,D₂O):δ:8.53(1H,d,J=9.43),8.48(1H,d,J=9.30),6.62(1H,d,J=9.19),6.55(1H,d,J=9.15),5.50(1H,s),4.98(1H,d,J=7.51),4.10(2H,t,J=9.10),3.84-3.99(8H,m),3.36-3.67(4H,m)

收率的计算方法：

收率=实际质量/理论质量×100%

含量检测方法采用HPLC进行，色谱条件如下：

C18柱(250mm×4.6mm,10μm)，流动相为甲醇-水(10:90)，流速1.0ml·min~(-1)，检测波长474nm，进样量10μl。

实施例2本发明2-NBDG的合成方法

在100ml圆底烧瓶中依次加入氨基葡萄糖盐酸盐(1293mg,6mmol,1.2equiv)、30ml甲醇、三乙胺(1515mg,15mmol,3equiv)和NBD-Cl(997.5mg,5mmol,1equiv)，在30°C条件下搅拌反应16h，反应混合物逐渐变为黑绿色。待反应结束后，将溶液定容至50ml的容量瓶中，然后在HPLC中进样10μl，平行进样三次，根据峰面积的平均值采用外标法计算收率，收率为80.4%。待反应结束后，真空浓缩除去甲醇，然后用(DCM:MeOH)硅胶柱层析，最后得到红色粉末状产物，计算收率，收率达到78.4%。

实施例3本发明2-NBDG的合成方法

首先将氨基葡萄糖盐酸盐(51.72mg,0.24mmol,1.2equiv)加入到圆底烧瓶中，然后加入2ml甲醇和三乙胺(60.6mg,0.6mmol,3equiv),将反应混合物在30°C条件下搅拌1h，然后加入NBD-Cl(39.9mg,0.2mmol,1equiv)，继续在30°C条件下反应15h，反应混合物逐渐变为黑绿色。待反应结束后，将混合物真空浓缩除去甲醇，(DCM:MeOH)硅胶柱层析，最后得到红色粉末状产物(53.6mg,78.4%)。

实施例4本发明合成方法的工艺考察

1、不同反应时间的筛选

首先将氨基葡萄糖盐酸盐(51.72mg,0.24mmol,1.2equiv)加入到圆底烧瓶中，然后加入750μl水和NaHCO3(50.4mg,0.6mmol,3equiv)，将反应混合物在20°C条件下搅拌1h，然后加入NBD-Cl(39.9mg,0.2mmol,1equiv)和甲醇1ml。继续在20°C条件下反应不同的时间，反应混合物逐渐变为黑绿色，待反应结束后，将反应液定容至10ml的容量瓶中，然后在HPLC中进样10μl，平行进样三次，根据峰面积的平均值采用外标法计算收率。同时，我们采用硅胶柱层析的方法验证了Table1(Entry 2、3)的收率。待反应结束后，用二氯甲烷萃取三次，合并有机层，无水硫酸镁干燥，过滤、旋干、(DCM:MeOH)硅胶柱层析，最后得到红色粉末状产物，计算收率，收率分别为20.3%和18.3%。如此证明采用HPLC的方法测定2-NBDG的收率是可行的。

表1.时间筛选结果

2、碱的种类筛选

首先将氨基葡萄糖盐酸盐(51.72mg,0.24mmol,1.2equiv)加入到圆底烧瓶中，然后加入750μl水和不同的有机与无机碱(3equiv)，在20°C条件下搅拌1h，然后加入NBD-Cl(39.9mg,0.2mmol,1equiv)和甲醇1ml，继续在20°C条件下反应15h，反应混合物逐渐变为黑绿色。继续搅拌，待反应结束后，将反应液定容至10ml的容量瓶中，然后在HPLC中进样10μl，平行进样三次，根据峰面积的平均值采用外标法计算收率。

表2.碱的种类筛选结果

3、碱的不同用量的筛选

首先将氨基葡萄糖盐酸盐(51.72mg,0.24mmol,1.2equiv)加入到圆底烧瓶中，然后加入750μl水和不同当量的TEA，在20°C条件下搅拌1h，然后加入NBD-Cl(39.9mg,0.2mmol,1equiv)和甲醇1ml，继续在20°C条件下反应15h，反应混合物逐渐变为黑绿色，待反应结束后，将反应液定容至10ml的容量瓶中，然后在HPLC中进样10μl，平行进样三次，根据峰面积的平均值采用外标法计算收率。

表3.碱的用量筛选结果

4、不同溶剂的筛选

首先将氨基葡萄糖盐酸盐(51.72mg,0.24mmol,1.2equiv)加入到圆底烧瓶中，然后加入750μl水和TEA(60.6mg,0.6mmol,3equiv)，在20°C条件下搅拌1h，然后加入NBD-Cl(39.9mg,0.2mmol,1equiv)和不同的有机溶剂1ml，继续在20°C条件下反应15h，反应混合物逐渐变为黑绿色，待反应结束后，将反应液定容至10ml的容量瓶中，然后在HPLC中进样10μl，平行进样三次，根据峰面积的平均值采用外标法计算收率。

表4.溶剂种类筛选结果

5、溶剂比例的筛选

首先将氨基葡萄糖盐酸盐(51.72mg,0.24mmol,1.2equiv)加入到圆底烧瓶中，然后加入溶剂A(750μl)和TEA(60.6mg,0.6mmol,3equiv)，在20°C条件下搅拌1h，然后加入NBD-Cl(39.9mg,0.2mmol,1equiv)和溶剂B(1ml)，继续在20°C条件下反应15h，反应混合物逐渐变为黑绿色，待反应结束后，将反应液定容至10ml的容量瓶中，然后在HPLC中进样10μl，平行进样三次，根据峰面积的平均值采用外标法计算收率。

表5.溶剂比筛选结果

6、不同反应温度的筛选

首先将氨基葡萄糖盐酸盐(51.72mg,0.24mmol,1.2equiv)加入到圆底烧瓶中，然后加入甲醇1ml和TEA(60.6mg,0.6mmol,3equiv)，在不同温度条件下搅拌1h，然后加入NBD-Cl(39.9mg,0.2mmol,1equiv)和甲醇1ml，继续在该温度下反应15h，反应混合物逐渐变为黑绿色，待反应结束后，将反应液定容至10ml的容量瓶中，然后在HPLC中进样10μl，平行进样三次，根据峰面积的平均值采用外标法计算收率。

表6.温度筛选结果

通过上述筛选实验，得出本发明的最佳工艺为：

首先将氨基葡萄糖盐酸盐(1293mg,6mmol,1.2equiv)加入到圆底烧瓶中，然后加入15ml甲醇和三乙胺(1515mg,15mmol,3equiv),将反应混合物在30°C条件下搅拌1h，然后加入NBD-Cl(997.5mg,5mmol,1equiv)和甲醇15ml，继续在30°C条件下反应15h，待反应结束后，将混合物真空浓缩除去甲醇，(DCM:MeOH)硅胶柱层析，最后得到2-NBDG。

结论：

（1）与背景技术中提及的“方法一”相比，本发明在该合成方法的基础上，对反应条件、催化剂、溶剂等作进一步优化，使得2-NBDG的收率提高了550%以上。

（2）与背景技术中提及的“方法二”相比，本发明仅使用价格低廉的NBD-Cl为原料，就能得到与方法二相当甚至更高的收率，使得原料成本降低了100倍以上，极大地节约了生产成本，其原料价格对比参见下表。

表7NBD-Cl与NBD-F的市场售价比较（价格：人民币元）

综上所述，本发明通过对合成方法的优化，在使用价格低廉的NBD-Cl为原料时，就能够保证较高的2-NBDG的收率，极大地节省了生产成本，且该反应条件温和，操作简便，为2-NBDG的工业化生产提供了基础，为降低2-NBDG的昂贵售价提供了可能，具有良好的工业应用前景。

2-N[7-硝基苯专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。