专利摘要

本发明公开了单个纳米颗粒的精确快速测温系统及其测温方法，所述系统包括：激光发射模块，包括激光发生器，光路调整组件，光学显微放大物镜，匹配镜油和半透半反镜片，用于将单色入射激光转换成p偏振光，并以激发表面等离激元共振（SPR）角入射到样品反应模块；样品反应模块，用于激发单个纳米颗粒的SPR效应；温度调节模块，与所述颗粒反应模块连接；颗粒强度检测模块，用于记录在不同温度下所述的单个纳米颗粒通过生物分子结合对连接在传感芯片表面发生布朗运动的SPR强度变化，获得所述单个纳米颗粒在z方向上的变化；通过绘制单纳米颗粒温度T和z2的校准曲线，可以精确快速测定其温度，进一步获得单个纳米颗粒上修饰的生物分子相应温度。

权利要求

1.一种单个纳米颗粒精确快速测温方法，其特征在于，所述测温方法采用单个纳米颗粒的精确快速测温系统，该系统包括：

激光发射模块，包括用于发生单色入射激光的激光发生器(11)、用于将单色入射激光转换成p偏振光的光路调整组件(12)、用于放大光路信号的光学显微放大物镜(13)、以及用于转换p偏振光入射角度的半透半反镜片(15)；

样品反应模块，其包括传感芯片(21)以及用于放置单个纳米颗粒的样品池(22)，所述样品池、传感芯片、光学显微放大物镜同向设置，p偏振光经由半透半反镜片(15)的作用以激发表面等离激元共振SPR角度入射至光学显微放大物镜(13)、传感芯片与样品池，传感芯片表面的单个纳米颗粒受激发产生局域等离激元共振效应，其散射光沿光路通过光学显微放大物镜及反射镜(41)的作用后，由图像传感器(42)采集相应图像信号；

温度调节模块，其与样品池控制配合以精确控制样品池的温度；

颗粒强度检测模块，其包括用于转换光学显微放大物镜发射的散射光路入射角度的反射镜(41)以及用于获取反射镜发射光成像的图像传感器(42)；

通过温度调节模块控制样品池的温度以记录在不同温度下所述的单个纳米颗粒的SPR强度变化；

具体方法包括如下步骤：步骤1)传感芯片表面修饰纳米颗粒；步骤2)采集样品不同温度下的SPR图像强度，通过将单个纳米颗粒在不同温度下的SPR强度转化为纳米颗粒距离传感芯片表面距离z，可以得到以温度为横坐标，以z2为纵坐标的校准曲线；测试待测样品的SPR图像强度，通过曲线得到单个纳米颗粒的温度。

2.根据权利要求1所述的单个纳米颗粒精确快速测温方法，其特征在于，所述步骤1)具体包括如下步骤：将所述的传感芯片表面固定样品池，通过IgG和Anti-IgG生物分子结合对修饰将纳米颗粒单个分散地结合在传感芯片表面。

3.根据权利要求2所述的单个纳米颗粒精确快速测温方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：所述步骤2)单个纳米颗粒上修饰的生物分子温度测定具体通过以下方法实现；

步骤21)测试单个纳米颗粒在不同温度下通过生物分子结合在传感芯片表面发生布朗运动的SPR强度变化，并将其转化为纳米颗粒距离传感芯片表面距离z，可以得到以温度为横坐标，以z2为纵坐标的校准曲线；根据SPR强度和z的关系：I＝I0 e-z/L；其中，I0为在z＝0时的SPR强度，值为200，L为延迟常数，值为100，由此可以得到z值；步骤22)绘制单纳米颗粒温度T和z2的校准曲线；步骤23)根据该校准曲线，我们可以根据纳米颗粒SPR强度变化，获得该纳米颗粒在z方向上的变化，将z2代入该曲线，测得单个纳米颗粒的相应温度。

4.根据权利要求1所述的单个纳米颗粒精确快速测温方法，其特征在于，所述光路调整组件(12)包括准直透镜(121)，偏振片(122)和聚光透镜(123)，用于将单色入射激光转换成p偏振光，聚焦于光学显微放大物镜的后聚焦面上。

5.根据权利要求1所述的单个纳米颗粒精确快速测温方法，其特征在于，所述的光学显微放大物镜(13)和传感芯片(21)之间填充匹配镜油(14)，该匹配镜油的折射率为1.51。

6.根据权利要求1所述的单个纳米颗粒精确快速测温方法，其特征在于，所述样品池固定在传感芯片的上表面，通过加入溶液将单个纳米颗粒表面修饰的生物分子和传感芯片表面修饰的目标分子相结合，从而达到将单个纳米颗粒固定在传感芯片表面且在溶液中发生布朗运动的目的。

7.根据权利要求1所述的单个纳米颗粒精确快速测温方法，其特征在于，光学显微放大物镜的放大倍数为60，其数值孔径为1.49，所述的图像传感器为CCD图像传感器或CMOS图像传感器。

8.根据权利要求1所述的单个纳米颗粒精确快速测温方法，其特征在于，传感芯片由基底和金属层组成，基底为BK7盖玻片。

说明书

技术领域

本发明涉及纳米颗粒温度测定领域，具体涉及一种单个纳米颗粒的精确快速测温系统及其测温方法。

背景技术

纳米材料的应用在纳米科技的进步中发挥重要作用，其中纳米颗粒更是在催化、信息传递、能源储备等领域应用广泛。近年来，由于生化分析领域的不断发展，对生物分子的快速、灵敏要求不断提高。纳米颗粒作为一种被广泛深入研究的纳米材料，更是在医学和生物工程中广泛应用。例如，金纳米颗粒由于具有较大的体表比，独特的光学和电磁特性，并且表面易于修饰等性质，在生物检测和临床快速检测中应用广泛。众所周知，温度的变化会对纳米颗粒布朗运动的程度产生影响，继而影响其应用。因此精确快速测定体系中纳米颗粒的温度变化意义重大。然而，目前的温度测定装置只能测定体相中的整体温度，不能具体测定单个纳米颗粒的温度变化，这大大限制了研究纳米颗粒的性质和应用研究。

同时，精确快速测定单个纳米颗粒的温度变化可以拓展到多个领域，为其他领域的发展进步提供重要基础。例如，在利用纳米颗粒研究生物分子相互作用时，大多数生物分子的相互作用都伴随着吸热或放热的过程，由于分子间的差异性，不同分子间的相互作用存在差异，因此不同分子间相互作用引起的温度变化也不同。利用纳米颗粒研究生物分子的相互作用，通过实现对单个纳米颗粒温度变化的测定，可以进一步为研究单个生物分子相互作用提供一种新的研究手段。

发明内容

第一方面，本发明提供一种单个纳米颗粒的精确快速测温系统，该系统包括：

激光发射模块，包括用于发生单色入射激光的激光发生器、用于将单色入射激光转换成p偏振光的光路调整组件、用于放大光路信号的光学显微放大物镜、以及用于转换p偏振光入射角度的半透半反镜片；

样品反应模块，其包括传感芯片以及用于放置单个纳米颗粒的样品池，所述样品池、传感芯片、光学显微放大物镜同向设置，p偏振光经由半透半反镜片的作用以SPR角度入射至光学显微放大物镜、传感芯片与样品池，样品池中的单个纳米颗粒受激发发生SPR效应，传感芯片发生折射光路且通过光学显微放大物镜发射；

温度调节模块，其与样品池控制配合以精确控制样品池的温度；

颗粒强度检测模块，其包括用于转换光学显微放大物镜发射的折射光路入射角度的反射镜以及用于获取反射镜发射光成像的图像传感器；

通过温度调节模块控制样品池的温度以记录在不同温度下所述的单个纳米颗粒的SPR强度变化。

本发明的发明人评估了该系统用于监测温度变化过程的有效性；如图3，本实验采集了不同温度下样品池中去离子水降温过程中SPR强度的变化，获得温度(ΔT)和等离激元共振角位移(Δθ)之间的线性关系，实验值为-76.4K·deg-1，R2＝0.998，与根据SPR角度和水折射率的光系计算得出的理论值-73.3K·deg-1一致。结果表明，在本发明涉及的装置中，能够准确有效地通过测定SPR强度的变化监测温度变化。受此实验结果启发，我们可以依据SPR强度变化测定单个纳米颗粒的温度变化。因此我们搭建了一套单个纳米颗粒的准确快速测温系统，同时可用于测定颗粒表面修饰的生物分子温度变化。

在一些实施例中，所述光路调整组件包括准直透镜，偏振片和聚光透镜，用于将单色入射激光转换成p偏振光，聚焦于光学显微放大物镜的后聚焦面上。

在一些实施例中所述的光学显微放大物镜和传感芯片之间填充匹配镜油，该匹配镜油的折射率为1.51。

在一些实施例中，所述样品池固定在传感芯片的上表面，通过加入溶液将单个纳米颗粒表面修饰的生物分子和传感芯片表面修饰的目标分子相结合，从而达到将单个纳米颗粒固定在传感芯片表面且在溶液中发生布朗运动的目的。其产生的SPR这一物理光学信号可用于传感芯片表面的折射率变化，例如纳米颗粒与传感芯片之间距离及温度的变化。温度越高，相应的纳米颗粒运动越剧烈。

在一些实施例中光学显微放大物镜的放大倍数为60，其数值孔径为1.49，所述的图像传感器为CCD图像传感器或CMOS图像传感器。

在一些实施例中，传感芯片由基底和金属层组成，基底为BK7盖玻片。

第二方面，本发明提供一种单个纳米颗粒精确快速测温方法，所述测定方法采用本发明提供的系统，具体方法包括如下步骤：步骤1)传感芯片表面修饰纳米颗粒；步骤2)采集样品不同温度下的SPR图像获得单个纳米颗粒和SPR图像强度的曲线；测试待测样品的SPR图像强度，通过曲线得到单个纳米颗粒的温度。

在一些实施例中，通过将单个纳米颗粒在不同温度下的SPR强度转化为金纳米颗粒距离金片表面距离z，可以得到以温度为横坐标，以z2为纵坐标的校准曲线。

在一些实施例中，所述步骤1)具体包括如下步骤：将所述的传感芯片表面固定样品池，通过IgG和Anti-IgG修饰将纳米颗粒单个分散地结合在传感芯片表面

在一些实施例中，该方法包括如下步骤：所述步骤2)单个纳米颗粒上修饰的生物分子温度测定具体通过以下方法实现；

步骤21)测试单个金纳米颗粒在不同温度下的SPR强度变化，并将其转化为金纳米颗粒距离金片表面距离z，可以得到以温度为横坐标，以z2为纵坐标的校准曲线；根据SPR强度和z的关系：I＝I0 e-z/L；其中，I0为在z＝0时的SPR强度，值为200，L为延迟常数，值为100，由此可以得到z值；步骤22)绘制单纳米颗粒温度T和z2的校准曲线；步骤23)根据该校准曲线，我们可以根据纳米颗粒SPR强度变化，获得该纳米颗粒在z方向上的变化，将z2代入该曲线，测得单个纳米颗粒的温度。

如图4所示，我们获得了单个纳米颗粒通过IgG和Anti-IgG相互作用结合到传感芯片表面。通过明场和扫描电子显微镜图像(图5)，纳米颗粒在传感芯片表面呈单颗粒分布。以上结果证明，通过IgG和Anti-IgG的相互作用，单个金纳米颗粒结合到传感芯片表面。接着测试了单个金纳米颗粒在不同温度下的SPR强度变化，并将其转化为金纳米颗粒距离金片表面距离z，可以得到以温度为横坐标，以z2为纵坐标的校准曲线。根据SPR强度和z的关系：

I＝I0 e-z/L

其中，I0为在z＝0时的SPR强度，值为200，L为延迟常数，值为100，由此可以得到z值。

如图6A所示，通过测定纳米颗粒在304K时SPR强度变化，得到纳米颗粒在z方向的位置信息。为了更为直接显示这种变化，我们取z值的平方，如图6B所示。利用该装置，我们继续测定了在其他温度下纳米颗粒的SPR强度值，得到纳米颗粒在z方向上的位置信息(图6C)，并取z值的平方，绘制单纳米颗粒温度T和z2的校准曲线。如图7所示，随温度升高，纳米颗粒在z方向位置升高，斜率为6.02nm2/K。根据该校准曲线，我们可以根据纳米颗粒SPR强度变化，获得该纳米颗粒在z方向上的变化，将z2代入该曲线，测得金纳米颗粒及其表面修饰的IgG和传感芯片表面修饰的Anti-IgG结合对的温度。

此结果表明，该装置能够精确快速地测定单个纳米颗粒及修饰的生物分子温度，同时为研究温度对单个纳米颗粒布朗运动及生物分子之间相互作用的影响提供一种重要动态检测手段。

本发明将将温度调节模块和等离激元共振成像模块结合，通过直接检测单个纳米颗粒的SPR强度的变化，获得测定单个纳米颗粒以及表面修饰的生物分子温度变化能力，为研究单颗粒温度局域变化及生物分子相互作用提供了一种新的重要研究手段。

本发明的发明人发现了SPR强度与单个纳米颗粒的温度存在关联，进一步地，本发明的发明人发现通过SPR强度变化，并将其转化为金纳米颗粒距离金片表面距离z，可以得到以温度为横坐标，以z2为纵坐标的校准曲线；并据此将其应用到纳米颗粒的测温方法中，测温结果精确可靠。

本发明不仅可以获得单个纳米颗粒的局域温度微小变化，还能够检测单个纳米颗粒上修饰的生物分子结合对相应温度，具体表现为生物分子的结合、解离和中间态构象变化产生的温度及热量的差异，获得生物分子结合热力学相关信息。通过对单纳米颗粒上结合的不同生物分子结合热力学信息的分析和比较，可绘制相应的生物分子体系热能能谱，进一步拓展人们对分子生物学领域的认知。同时，该发明可拓展至生物体对温度适应机制的研究，例如对产热和温度调节具有重要作用的线粒体在结构和组成分布发生变化时的动态温度变化分析；还可拓展至医学领域的生物分子与靶标结合的热力学监测，为肿瘤及癌症的早期检测和治疗提供了一种有力的工具。

附图说明

图1是本发明涉及的系统的结构示意图；

图2是本发明涉及的方法的流程图；

图3是本发明涉及的装置的温度校准曲线；

图4是本发明涉及的单个纳米颗粒在传感芯片上的结合示意图：

图5A是本发明涉及的单个纳米颗粒的明场图；

图5B是本发明涉及的单个纳米颗粒的扫描电子显微镜图；

图6A是本发明涉及的单个纳米颗粒在304K时z值；

图6B是本发明涉及的单个纳米颗粒在304K时z2值的变化；

图6C是本发明涉及的单个纳米颗粒在304K逐步变化到304.6K时z2值的变化，每段升高0.2K；

图7是本发明涉及的单个纳米颗粒温度T和z2的校准曲线。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行具体的描述，只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

如图1，本实施例搭建单粒子表面等离子共振成像测温系统，具体地提供一种单个纳米颗粒的精确快速测温系统，该系统包括激光发射模块、样品反应模块、温度调节模块以及颗粒强度检测模块；

激光发射模块包括以下四个部分：用于发生单色入射激光的激光发生器，作为产生局域等离激元共振的单个贵金属纳米颗粒的激发光源；用于将单色入射激光转换成p偏振光的光路调整组件12；用于放大光路信号的光学显微放大物镜，以达到对传感芯片表面的单纳米颗粒进行高倍数放大成像分析的要求；用于转换p偏振光入射角度的半透半反镜片15，作为调整优化光路结构满足入射光成功照射到物镜及传感芯片的实际要求；以及用于高倍数光学显微放大物镜与传感芯片之间的匹配镜油14，其折射率与玻璃接近以满足增加光线、提高视野度及获得清晰物象的要求。

所述光路调整组件包括准直透镜，偏振片和聚光透镜，用于将单色入射激光转换成p偏振光，聚焦于光学显微放大物镜的后聚焦面上。

光学显微放大物镜的放大倍数为60，其数值孔径为1.49；

样品反应模块包括传感芯片21以及用于放置单个纳米颗粒的样品池22，所述样品池22、传感芯片21、光学显微放大物镜自上而下同向设置，p偏振光经由半透半反镜片15的作用以SPR角度入射至光学显微放大物镜13、传感芯片与样品池，传感芯片表面的单个纳米颗粒受激发发生局域等离激元共振效应后，其相应发生的散射共振光通过光学显微放大物镜及反射镜41反射后由图像传感器42采集相应的实时图像；

具体地，样品反应模块利用金片和聚二甲基硅氧烷(PDMS)样品池搭建：传感芯片为金片，金片是由基底和金属层组成，基底为BK7盖玻片，在该基底上镀一层～2nm的金属铬，在镀一层厚度约为47nm的金；金片在使用前用氢火焰灼烧，然后用乙醇和去离子水冲洗干净且氮气吹干，备用；用5mL，1mM的11-巯基十一烷酸的乙醇溶液修饰浸泡金片过夜，用摩尔比为4：1的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的混合溶液活化表面的羧基基团20分钟。取PDMS池作为样品池，用乙醇和去离子水冲洗干净且用氮气吹干，置于传感芯片表面，用于放置溶液。

温度调节模块3与样品池控制配合以精确控制样品池的温度；具体地，在显微放大物镜上方的载物台上搭建加热台31，将样品反应模块放入加热台31内，置于物镜上方，调节加热控制器控制样品反应模块的温度；在本实施例中，通过加入热电偶测定样品池中液体的整体温度；

颗粒强度检测模块4包括用于转换光学显微放大物镜发射的折射光路入射角度的反射镜41以及用于获取反射镜发射光成像的图像传感器42；

通过温度调节模块控制样品池的温度以记录在不同温度下所述单个纳米颗粒结合在表面后发生布朗运动引起的SPR强度变化；

具体地，在本实施例中，选择波长为680nm的红色激光引入SPR成像中，作为纳米颗粒局域等离激元共振的激发光源，打开激光发生器，调节强度至100mA，使得图像传感器(CMOS相机)上接收到较强的信号；

选择60X物镜，在光学显微放大物镜外端和传感芯片的下端面之间滴加一滴匹配镜油，该匹配镜油的折射率为1.51；调节光路调整组件，使入射光到光学显微放大物镜内，并调节入射光角度处于激发纳米颗粒SPR的位置。

实施例2

下面以IgG抗原和Anti-IgG抗体结合对为例探究本发明中涉及的系统和方法，如图2所示，具体实验方案为：

步骤1)温度(ΔT)和等离激元共振角位移(Δθ)之间的线性关系的校准：在上述搭建的单颗粒SPR成像加热系统中，向PDMS样品池中加入100μL去离子水，在样品池中插入热电偶，测定样品池中液体的整体温度。在样品池中加入100μL的90℃的去离子水，通过CMOS相机记录样品池中去离子水降温过程中SPR强度的变化，相机的拍摄速度为每秒100帧。

如图3，本实验采集了不同温度下样品池中去离子水降温过程中SPR强度的变化，获得温度(ΔT)和等离激元共振角位移(Δθ)之间的线性关系，实验值为-76.4K·deg-1，R2＝0.998，与根据SPR角度和水折射率的光系计算得出的理论值-73.3K·deg-1一致。结果表明，在本发明涉及的装置中，能够准确有效地通过测定SPR强度的变化监测温度变化。受此实验结果启发，我们可以依据SPR强度变化测定单个纳米颗粒的温度变化。因此我们搭建了一套单个纳米颗粒的准确快速测温系统，同时可用于测定颗粒表面修饰的生物分子温度变化。

步骤2)传感芯片表面修饰金纳米颗粒(以IgG和Anti-IgG修饰的金纳米颗粒(150nm)为例)：

步骤21)样品的准备：准确称取1mg IgG，用10mL磷酸盐缓冲溶液(PBS)配制100μg/mL的IgG溶液，作为母液；将2μLIgG母液和98μLPBS混合，在涡轮搅拌器上搅拌30s，备用；将2μLAnti-IgG修饰的金纳米颗粒(直径为150nm)与5mL去离子水混合，在涡轮搅拌器上搅拌2min，备用；准确称取60mg牛血清白蛋白固体粉末，准确量取2mL的磷酸盐缓冲溶液，涡轮搅拌30s，配制成质量分数为3％的牛血清白蛋白溶液，备用。

步骤22)表面修饰：将100μLIgG溶液加入至样品反应池中，静置10min。随后，用200μL磷酸盐吐温缓冲溶液(PBST，0.05％Tween)洗涤样品池三次；紧接着，加入200μL3％的牛血清白蛋白溶液，静置10min后，用200μL的PBST洗涤样品池三次；最后，加入100μL Anti-IgG修饰的纳米颗粒溶液，静置10min后，用200μL的PBST洗涤样品池三次。

如图4所示，我们获得了单个纳米颗粒通过IgG和Anti-IgG相互作用结合到传感芯片表面。通过明场和扫描电子显微镜图像(图5)，纳米颗粒在传感芯片表面呈单颗粒分布。以上结果证明，通过IgG和Anti-IgG的相互作用，单个金纳米颗粒结合到传感芯片表面。

步骤3)单个纳米颗粒上修饰的生物分子温度测定：

步骤31)单个金纳米颗粒在不同温度下的SPR图像强度：首先，记录纳米颗粒在室温(298K)下的SPR图像，相机的拍摄速度为每秒100帧，拍摄时间为15s。然后，调控加热控制器，升高温度4K，保持10min，待样品池内溶液温度达到设置温度302K，记录在该温度下纳米颗粒的SPR图像，相机的拍摄速度为每秒100帧，拍摄时间为15s。继续调控加热控制器升温2K，保持10min，待样品池内溶液温度达到设置温度306K，记录在该温度下纳米颗粒的SPR图像，相机的拍摄速度为每秒100帧，拍摄时间为15s。接着调控加热控制器升温7K，保持10min，待样品池内溶液温度达到设置温度313K，记录在该温度下纳米颗粒的SPR图像，相机的拍摄速度为每秒100帧，拍摄时间为15s。最后调控加热控温器升温，保持10min，待样品池内温度到达，记录在该温度纳米颗粒的SPR图像，相机的拍摄速度为每秒100帧，拍摄时间为15s；

步骤32)将单个金纳米颗粒在不同温度下的SPR图像强度变化转化为金纳米颗粒距离金片表面距离z，可以得到以温度为横坐标，以z2为纵坐标的校准曲线。根据SPR强度和z的关系：

I＝I0 e-z/L

其中，I0为在z＝0时的SPR强度，值为200，L为延迟常数，值为100，由此可以得到z值。

如图6A所示，通过测定纳米颗粒在304K时SPR强度变化，得到纳米颗粒在z方向的位置信息。为了更为直接显示这种变化，我们取z值的平方，如图6B所示。利用该装置，我们继续测定了在其他温度下纳米颗粒的SPR强度值，得到纳米颗粒在z方向上的位置信息(图6C)，并取z值的平方，绘制单纳米颗粒温度T和z2的校准曲线。如图7所示，随温度升高，纳米颗粒在z方向位置升高，斜率为6.02nm2/K。根据该校准曲线，我们可以根据纳米颗粒SPR强度变化，获得该纳米颗粒在z方向上的变化，将z2代入该曲线，测得金纳米颗粒、IgG和Anti-IgG结合对的温度。

此结果表明，该装置能够精确快速地测定单个纳米颗粒及修饰的生物分子温度，同时为研究温度对单个纳米颗粒布朗运动及生物分子之间相互作用的影响提供一种重要手段。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求所界定的保护范围。

单个纳米颗粒的精确快速测温系统及其测温方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

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4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

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