专利摘要

本发明属于医药技术领域，公开了(1)来源于真菌次生代谢产物的新杂萜类化合物1‑5的活性及结构；(2)化合物1‑5的分离纯化制备方法和抗菌活性。化合物1‑5的结构式；(3)衍生物类似物。化合物1和3对甲氧西林耐药的金黄色葡萄球菌，葡萄球菌，产超广谱β‑内酰胺酶的大肠埃希菌，大肠杆菌以及铜绿假单菌具有较强的抗菌活性。

权利要求

1.新杂萜类化合物的制备方法，所述新杂萜类化合物为从曲霉TJ23发酵产物中分离纯化得到新杂萜类化合物1-5：其特征在于，包括以下步骤：

S1.种子培养基的制备：

曲霉TJ23接入种子培养基，该曲霉为DDBJ/EMBL/GenBank No.KY346978，菌株保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏日期为2017年7月25日；保藏号为CCTCC M 2017432，摇床培养，得到种子培养液；所述摇床培养的条件为：25～28℃下，摇床转速100～120rpm，培养时间为3～5天；所述种子培养基的组分为：酵母膏1～5g，麦芽膏1～5g，蛋白胨1～10g，葡萄糖5～15g，水0.5～1.5L；

S2.接种：

采用固体发酵方式，在发酵瓶中加入大米固体发酵培养基，接种S1中种子培养液，静置培养；所述大米固体发酵培养基为每0.5～1.5L的三角锥形瓶中加入大米150～250g，水150～250mL；所述静置培养的时间为20～40天，培养温度为25～28℃；

S3.将S2发酵得到的菌丝体及培养基用乙醇提取，减压浓缩回收乙醇，得到浸膏；

S4.将S3所得浸膏经柱层析分离，得到化合物1-5；所述层析分离方法包括硅胶柱层析，凝胶柱层析，半制备高效液相色谱。

说明书

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及真菌次生代谢产物中具有抗菌活性化合物的分离制备方法及用途，具体涉及分离纯化过程，结构确证，抗菌作用等。

背景技术

细菌耐药是本世纪全球关注的热点问题，已成为严重的公共卫生危机。细菌耐药直接导致患者治疗失败、医疗费用增加、病死率上升，更为严重的是，耐药菌的进一步发展可能使人类重新面临感染性疾病的威胁。目前加强抗菌药物研发是国内外对抗细菌耐药的共识，真菌代谢产物的丰富性及其生物活性的多样性是发现抗菌新药的不竭动力。

发明内容

本发明的目的是提供具有抗菌活性化合物的来源以及分离纯化方法及其潜在应用价值。

我们在抗菌活性筛选的指导下，对从湖北省神农架地区采集的贯叶连翘内生真菌(曲霉TJ23)发酵产物的抗菌活性成分进行了系统研究，分离得到了新化合物1-5。结构式如(Ⅰ)所示。

通过这5个化合物对7种病原菌抗菌活性研究，发现化合物1和3对甲氧西林耐药的金黄色葡萄球菌，葡萄球菌，产超广谱β-内酰胺酶的大肠埃希菌，大肠杆菌以及铜绿假单菌具有抗菌活性。

本发明涉及真菌代谢产物中相关杂萜类化合物的分离制备、以及它具有抑制甲氧西林耐药的金黄色葡萄球菌，葡萄球菌，产超广谱β-内酰胺酶的大肠埃希菌以及铜绿假单菌的活性。可以预期发展成为新的抗菌药物。由此完成了本发明。

曲霉TJ23(Aspergillus sp.TJ23)已于2017年7月25日保藏于位于中国.武汉.武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M 2017432，该中心于2017年8月8日检测完毕，结果为存活。

本发明所提供的抗菌活性化合物类似结构表示为(Ⅱ)和(Ⅲ)。

其中：(一)：R1可以为以下芳环或杂环：二氢化吡咯、2-二氢化吡咯、1-二氢化吡咯、2-恶唑啉、3-恶唑啉、2-咪唑啉、二氢吡唑、吡咯、咪唑、苯并咪唑、吡唑、吲唑、吡啶、二氢嘧啶、嘧啶、苯环。

(二)：R2-R15可以相同或不同，可以分别、同时或各自为氢、羟基或含1-8个碳的烷基、卤素、硝基，1-8个碳的烷氧基，羰基、羧基、醛基或氨基。

(一)：R1可以为以下芳环或杂环：二氢化吡咯、2-二氢化吡咯、1-二氢化吡咯、2-恶唑啉、3-恶唑啉、2-咪唑啉、二氢吡唑、吡咯、咪唑、苯并咪唑、吡唑、吲唑、吡啶、二氢嘧啶、嘧啶、苯环。

(二)：R1-R14可以相同或不同，可以分别、同时或各自为氢、羟基或含1-8个碳的烷基、卤素、硝基，1-8个碳的烷氧基，羰基、羧基、醛基或氨基。

附图说明

图1：化合物1晶体结构；

图2：化合物2晶体结构；

图3：化合物3晶体结构；

图4：化合物4晶体结构；

图5：化合物5的ECD计算结果；

图6：为实施例1中的提取分离步骤图：将发酵得到的发酵物用乙醇提取4次，于45℃减压浓缩回收乙醇，得到总浸膏。总浸膏用乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯部分(228g)。将乙酸乙酯部分用100-200目硅胶拌样，进行硅胶柱层析，用二氯甲烷-甲醇梯度洗脱(10:1–1:1)，TLC检测，合并相同的组分，共得到5个组分。组分2经过反复的正反相硅胶柱色谱，凝胶色谱和高效液相色谱分离得到化合物1(16mg)和2(8.5mg)。组分3经过反复的正反相硅胶柱色谱，凝胶色谱和高效液相色谱分离得到化合物3(6mg)和4(12mg)。组分4经过反复的正反相硅胶柱色谱，凝胶色谱和高效液相色谱分离得到化合物5(10mg)。

具体实施方式

实施例1：化合物1-5的制备和结构鉴定。

(一)如式(1)所示化合物1的制备

1.发酵条件

种子培养液的配置：取酵母膏3.0g，麦芽膏3.0g，蛋白胨5.0g，葡萄糖10.0g，溶于适量的水中，再用水定容至1000mL，121℃下高温灭菌30min，备用。将曲霉TJ23接种到上述培养基中，25～28℃，100～120rpm条件下摇床培养为3～5天，得到种子培养液。

发酵：将200g大米装入1000mL锥形瓶中，加入200mL水，121℃下高温灭菌30min，备用。将上述种子培养液接种到大米培养基中，25～28℃条件下静置培养25～30天。

2.提取分离

将发酵得到的发酵物用乙醇提取4次，于45℃减压浓缩回收乙醇，得到总浸膏。总浸膏用乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯部分(228g)。将乙酸乙酯部分用100-200目硅胶拌样，进行硅胶柱层析，用二氯甲烷-甲醇梯度洗脱(10:1–1:1)，TLC检测，合并相同的组分，共得到5个组分。组分2经过反复的正反相硅胶柱色谱，凝胶色谱和高效液相色谱分离得到化合物1(16mg)和2(8.5mg)。组分3经过反复的正反相硅胶柱色谱，凝胶色谱和高效液相色谱分离得到化合物3(6mg)和4(12mg)。组分4经过反复的正反相硅胶柱色谱，凝胶色谱和高效液相色谱分离得到化合物5(10mg)。见图6。

(二)化合物1-5的结构鉴定

通过高分辨质谱，紫外光谱，红外光谱，旋光，核磁共振，圆二色谱和X射线单晶衍射等数据进行综合分析，从而确定该化合物的结构。

化合物1：化合物1的核磁共振(NMR)数据如表(1)所示，其绝对构型是通过X射线单晶衍射确定的，晶体结构如图(1)所示。

化合物2：Colorless crystals(CHCl3–MeOH)；mp 214-216℃； UV(CH2Cl2)λmax(logε)＝230(4.11),294(2.96)nm；IRνmax＝2969,2940,1705,1671,1622,1438,1379,and 1267cm–1；CD(CH2Cl2)λmax(Δε)232(+37.5)and 297(-42.5)nm；1H NMR(400MHz)and 13C NMR(100MHz)data see Table 1；HRESIMS[M+Na]+m/z463.2049and 441.2251[M+H]+(calcd for C26H32O6Na,463.2097and C26H33O6,441.2277)。化合物2的核磁共振(NMR)数据如表(1)所示，其绝对构型是通过X射线单晶衍射确定的，晶体结构如图(2)所示。

表(1).化合物1和2的1H,13C NMR数据(Record in CDCl3；J in Hz).a

a400MHz for 1H and 100MHz for 13C.

化合物3：colorless crystals； UV(MeOH)λmax(logε)＝236(3.64)nm；IR(KBr)νmax＝3449,2966,1763,1708,1665,1623,1440,1372,and 1243cm–1；CD(MeOH)λmax(Δε)＝200(–7.2),220(–2.2),and 245(+3.4)nm；For 1H NMR(400MHz)and13C NMR(100MHz)data,see Table 2；HRESIMS[M+H]+m/z 411.2189(calcd for C25H30O5,411.2171)。化合物3的核磁共振(NMR)数据如表(2)所示，其绝对构型是通过X射线单晶衍射确定的，晶体结构如图(3)所示。

化合物4：colorless crystals； UV(MeOH)λmax(logε)＝238(3.70)nm；IR(KBr)νmax＝3436,2972,2844,1755,1641,1452,1379,and 1014cm–1；CD(MeOH)λmax(Δε)＝203(+8.5),265(+4.3),and 310(–10.1)nm；For 1H NMR(400MHz)and 13CNMR(100MHz)data,see Table 2；HRESIMS[M+H]+m/z 393.2063(calcd for C25H29O4,393.2066)。化合物4的核磁共振(NMR)数据如表(2)所示，其绝对构型是通过X射线单晶衍射确定的，晶体结构如图(4)所示。

化合物5：white powder； UV(MeOH)λmax(logε)＝236(3.70)nm；IR(KBr)vmax＝3430,2950,2839,1760,1707,1667,1451,1382,and 1020cm–1；CD(MeOH)λmax(Δε)＝200(–0.83),251(+7.3),and 310(–3.8)nm；For 1H NMR(400MHz)and 13CNMR(100MHz)data,see Table 2；HRESIMS ion peak at[M+H]+m/z 409.2016(calcd forC25H29O5,409.2015)。化合物3的核磁共振(NMR)数据如表(2)所示，其绝对构型是通过ECD计算确定，如图(5)所示。

表(2).化合物3-5的1H,13C NMR数据

aRecorded in CDCl3；bRecorded in CD3OD；“m”＝overlapped or multipletwith other signals.

实施例2：化合物1-5的抗菌活性见表(3)。

表(3).化合物1-5的抗菌活性(MIC,μg/mL)

aMRSA＝甲氧西林耐药的金黄色葡萄球菌ATCC43300；bS.aureus＝金黄色葡萄球菌ATCC25923；cE.faecalis＝粪肠球菌ATCC 29212；dESBL-E.coli＝产超广谱β-内酰胺酶的大肠埃希菌ATCC 35218；eE.coli＝大肠杆菌ATCC25922；fP.aeruginos＝铜绿假单胞菌ATCC15442；gK.pneumonia＝肺炎克雷伯菌ATCC 700603；h对招品的选择参照CLSI标准(NationalCommittee for Clinical Laboratory Standards，CLSI)；Va＝万古霉素；Ch＝氯霉素；Am＝阿米卡星；Ce＝头孢曲松。

耐药菌株和对照品：进行抗菌活性测试的耐药菌株购买于ATCC标准菌株库，对照品的选择依照美国临床和实验室标准协会标准。测试中所用的对照品：万古霉素﹑氯霉素﹑头孢曲松﹑头孢他啶﹑阿米卡星﹑甲氧西林﹑阿莫西林﹑氟康唑，购买于西格玛中国官网。

微量肉汤稀释法确定最低抑菌浓度(MIC)：将倍比稀释后不同浓度的待测样品以及抗菌对照品溶液分别加到灭菌的96孔板中。第1至第11孔加待测样品溶液或抗菌对照品溶液，每孔10μL。每板的最后一排为抗菌溶液，作为阳性对照，每排的第12孔为空白菌液，作为阴性对照。冰冻干燥后密封，-20℃以下保存备用。将用直接菌悬液法制备的浓度相当于0.5麦氏比浊标准的菌悬液，经MH肉汤1:1000稀释后，向每孔中加100μL，使第1孔至第11孔最终的待测样品或抗菌对照品浓度分别为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125μg/mL。将96孔板置于恒温培养箱37℃孵育16–24h判断结果。阴性孔显示清亮，阳性孔显示混浊，以在小孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC。

实验结论：化合物1和3对甲氧西林耐药的金黄色葡萄球菌，葡萄球菌，产超广谱β-内酰胺酶的大肠埃希菌，大肠杆菌以及铜绿假单菌具有较强的抗菌活性。

真菌次生代谢产物中具有抗菌活性化合物的分离制备及用途专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。