专利摘要

本发明涉及一株盐红菌Halorubrumsp.HRM‑150菌株及利用所述菌株发酵生产类胡萝卜素的方法，属于天然类胡萝卜素生产技术领域。本发明所述盐红菌Halorubrumsp.HRM‑150菌株的保藏编号为CGMCCNo.17350。本发明提供的盐红菌Halorubrumsp.HRM‑150菌株为极端嗜盐古菌，将所述盐红菌Halorubrumsp.HRM‑150菌株采用连续发酵的方式进行发酵，得到的发酵菌体湿重高达20g/L，色素含量高达1.25％ww。

权利要求

1.盐红菌Halorubrumsp.HRM-150菌株生产类胡萝卜素的方法，所述盐红菌Halorubrumsp.HRM-150菌株保藏编号为CGMCC No.17350，包括以下步骤：

1)将盐红菌Halorubrumsp.HRM-150菌株接种到发酵培养基中进行连续发酵培养；所述发酵培养基含质量分数为1％的氮源和质量分数为1％的碳源，盐度为150～250；所述发酵培养的条件为：起始转速200rpm，至对数生长期转速升高至400rpm，发酵至50～54h时补加碳源，80～84h结束发酵；所述氮源为酵母提取物和酸水解酪蛋白；所述碳源为可溶性淀粉；所述补加为补加发酵培养基的质量分数为1％的碳源；

2)收集菌体，加入蒸馏水，得到细胞裂解液；

3)将细胞裂解液、三氯甲烷和甲醇以1:1:2的体积比混合，震荡，静置4h以上，收集下层有机相，将所述有机相进行旋蒸浓缩，利用氮气去除残余溶剂。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)所述收集菌体的条件为：在4℃下8000rpm离心10min，取沉淀。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)所述旋蒸浓缩的水浴温度为30～35℃，转速为100rpm。

说明书

技术领域

本发明涉及天然类胡萝卜素生产技术领域，具体涉及一株盐红菌Halorubrumsp.HRM-150菌株及利用盐红菌Halorubrum sp.HRM-150菌株发酵生产类胡萝卜素的方法。

背景技术

类胡萝卜素(Carotenoids)是碳氢类胡萝卜素(carotenes)和含氧类胡萝卜素(xanthophylls)两大类色素的总称，一般由8个类异戊二烯单位组成，呈现黄色、橙红色或者红色。天然类胡萝卜素的主要来源于植物、动物和微生物，可用作着色剂、和抗氧化剂，在提高机体免疫力、抑制肿瘤细胞生长等方面具有广阔的应用前景。

菌红素作为类胡萝卜素中的一类少见的羟基化C50类胡萝卜素，属于高碳类胡萝卜素。菌红素较β-胡萝卜素清除羟自由基的能力更强，且其抗氧化能力比β-胡萝卜素高出50％。但目前未见一种利用微生物发酵生产类胡萝卜素的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一株盐红菌Halorubrum sp.HRM-150菌株及其发酵生产类胡萝卜素的方法。本发明提供的菌株能够生产类胡萝卜素。

本发明提供了一株盐红菌Halorubrum sp.HRM-150菌株，保藏编号为CGMCCNo.17350。

本发明还提供了上述技术方案所述菌株在生产类胡萝卜素中的应用。

优选的是，所述类胡萝卜素包括菌红素、单脱水菌红素、番茄红素和β-胡萝卜素。

本发明还提供了上述技术方案所述菌株生产类胡萝卜素的方法，包括以下步骤：

1)将盐红菌Halorubrum sp.HRM-150菌株接种到发酵培养基中进行连续发酵培养；所述发酵培养基含质量分数为1％的氮源和质量分数为1％的碳源，盐度为150～250；所述发酵培养的条件为：起始转速200rpm，至对数生长期转速升高至400rpm，发酵至50～54h时补加碳源，80～84h结束发酵；

2)收集菌体，加入蒸馏水，得到细胞裂解液；

3)将细胞裂解液、三氯甲烷和甲醇以1:1:2的体积比混合，震荡，静置4h以上，收集下层有机相，将所述有机相进行旋蒸浓缩，利用氮气去除残余溶剂。

优选的是，步骤1)所述氮源包括酵母提取物和酸水解酪蛋白。

优选的是，步骤1)所述碳源包括可溶性淀粉。

优选的是，步骤1)所述补加为补加发酵培养基的质量分数为1％的碳源。

优选的是，步骤2)所述收集菌体的条件为：在4℃下8000rpm离心10min，取沉淀。

优选的是，步骤3)所述旋蒸浓缩的水浴温度为30～35℃，转速为100rpm。

本发明提供了一株盐红菌Halorubrum sp.HRM-150菌株。本发明提供的HRM-150菌株为极端嗜盐菌，将所述盐红菌属古菌HRM-150菌株采用连续发酵的方式进行发酵，得到的发酵菌体湿重高达20g/L，色素含量高达1.25％ww。

附图说明

图1为本发明提供的HRM-150菌落形态；

图2为本发明提供的HRM-150菌株电子显微镜图片；

图3为本发明提供的基于16S rRNA片段序列的HRM-150系统育树分析；

图4为本发明是实施例1提供的HRM-150菌株在不同培养条件下的生长曲线；

图5为本发明是实施例1提供的HRM-150菌株在不同培养条件下的菌体湿重情况；

图6为本发明是实施例1提供的HRM-150菌体色素粗提物的TLC以及硅胶柱层析分离结果；

图7为本发明是实施例1提供的色素组分抗氧化水平测试结果。

生物保藏信息

盐红菌Halorubrum sp.，菌株编号为HRM-150，保藏地点为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏时间为2019年3月18日，保藏编号为CGMCCNo.17350。

具体实施方式

本发明提供了一株盐红菌Halorubrum sp.HRM-150菌株，保藏编号为CGMCCNo.17350。

在本发明中，所述盐红菌Halorubrum sp.HRM-150菌株的菌落形态图如图1所示，菌落为红色，圆形，光滑；菌株电子显微镜图片如图2所示，细胞为短棒状。在本发明中，所述盐红菌Halorubrum sp.HRM-150菌株的16S rRNA序列如SEQ ID NO.1所示，其16S rRNA基因序列全长如下：

GATTCGACGTTCGTGGAACGCCTCATCCGGACCTCACTCGGGTGCTTTGACGGGCGGTGTGTGCAAGGAGCAGGGACGTATTCACCGCGCGCTTGTGACACGCGATTACTACCGAATCCAGCTTCATGTGGGCGAGTTGCAGCCCACAATCCGAACTACGATCGAGTTTCTGAGATTACCGTCTCCTTTCGGAGTTGGAACCCTTTGTCTCGACCATTGTAGCCCGCGTGTTGCCCAGCACATTCGGGGCATACTGACCTACCGTTGCCCGTTCCTTCCTCCGTGTTAGCCACGGCGGTCCCCCTACTGTCCCCAGCTACCTCGCGGTACTGCTGGCAAGTAAGGGTGCGGGTCTCGCTCGTTGCCTGACTTAACAGGACGCCTCACGGTACGAGCTGACGGCGGCCATGCACCTCCTCTCTGAAACTCGGACAAGGTCATCAACCTGGTCGTCATTATTACAGTCGATGCTGGTGAGATGTCCGGCGTTGAGTCCAATTAAACCGCAGGCTCCTCCGGTTGTAGTGCTCCCCCGCCAATTCCTTTAAGTTTCATCCTTGCGGACGTACTTCCCAGGCGGTCTGCTTAGCGGCTTCCCTACGGCACAGCACCCACTCGTAGTGGGAGCCACACCTAGCAGACATTGTTTACGGCCAGGACTACCCGGGTATCTAATCCGGTTCGAGACCCTGGCTTTCGTCCCTCACTGTCGGATCCGTCCTCGCGACGTGCTTTCGCCATCGGCGGTCCGTCCAGGATTACGGGATTTCACTCCTACCCCGGACGTACCCGTCGCGCCTTCCGGTCCCAAGCCACGCAGTTTCTACCGGGCGCCCACCTGTTGGGCAGGTGGATTTCCCGATGGACTTGCGCGGCCAGCTACGGACGCTTTAGGCCCAATAAGATCGGCCATCACTTGGGCTGCCGGTATTACCGCGGCGGCTGGCACCGGTCTTGCCCAGCCCTTATTCTGGTACCACCTTACGGTACCGAAAAGCACAGGCGCTATGCCTGTGCACTTGGGATCCCCCTATCGCACTGTCGTGCAGTGTAAAGGTTTCGCGCCTGCTGCGCCCCGTAGGGCCCGGAATCTTGTCTCAGATTCCGTCTCTGGGTTCTCACTCTCATGACCCATACCGATTATTGGCACGGTGGGCCGTTACCCCACCGTCTACCTAATCGGCCGCAGCCACATCCTTCGGCGCCGGAGCGTTTGGCATACCACTCATTCCAGTGGTGGTATGGTATACACTATTAGCCTCAGTTTCCCGAGGGTATTGTGTTCCGAAGGGTAGTTTGGCCACGTGTTACTGAGCTATTCGCCACGAGTCTGAACTCGTGCGAC。

基于16S rRNA片段序列的系统发育树分析结果如图3所示。从Genebank查找相似度较高的序列，构建系统进化树，发现Halorubrum sp.HRM-150菌株与NCBI数据库中四个Halorubrum菌株相似度均为99.8％以上。

本发明还提供了上述技术方案所述菌株在生产类胡萝卜素中的应用。在本发明中，所述类胡萝卜素包括菌红素、单脱水菌红素、番茄红素和β-胡萝卜素。其中，所述类胡萝卜素中菌红素含量最高。

本发明还提供了上述技术方案所述菌株生产类胡萝卜素的方法，包括以下步骤：

1)将盐红菌Halorubrum sp.HRM-150菌株接种到发酵培养基中进行连续发酵培养；所述发酵培养基含质量分数为1％的氮源和质量分数为1％的碳源，盐度为150～250；所述发酵培养的条件为：起始转速200rpm，至对数生长期转速升高至400rpm，发酵至50～54h时补加碳源，80～84h结束发酵；

2)收集菌体，加入蒸馏水，得到细胞裂解液；

3)将细胞裂解液、三氯甲烷和甲醇以1:1:2的体积比混合，震荡，静置4h以上，收集下层有机相，将所述有机相进行旋蒸浓缩，利用氮气去除残余溶剂。

本发明将盐红菌Halorubrum sp.HRM-150菌株接种到发酵培养基中进行连续发酵培养；所述发酵培养基含质量分数为1％的氮源和质量分数为1％的碳源，盐度为150～250；所述发酵培养的条件为：起始转速200rpm，至对数生长期转速升高至400rpm，发酵至50～54h时补加碳源，80～84h结束发酵。在本发明中，所述氮源包括酵母提取物和酸水解酪蛋白。在本发明中，所述碳源包括可溶性淀粉。在本发明中，所述补加为补加发酵培养基的质量分数为1％的碳源。本发明所述盐红菌Halorubrum sp.HRM-150菌株能够在高盐条件下生长，本发明较高的盐度设置可减少发酵过程中的污染。

结束发酵后，本发明收集菌体，加入蒸馏水，得到细胞裂解液。本发明加入蒸馏水后，优选进行震荡，使菌体和蒸馏水充分混匀，本发明菌体可利用渗透压变化进行裂解，方便色素的提取、分离和纯化。在本发明中，所述收集菌体的条件优选为：在4℃下8000rpm离心10min，取沉淀。

得到细胞裂解液后，本发明将细胞裂解液、三氯甲烷和甲醇以1:1:2的体积比混合，震荡，静置4h以上，收集下层有机相，将所述有机相进行旋蒸浓缩，利用氮气去除残余溶剂。在本发明中，所述旋蒸浓缩的水浴温度为30～35℃，转速为100rpm。

下面结合具体实施例对本发明所述的一株盐红菌Halorubrum sp.HRM-150菌株及其发酵生产类胡萝卜素的方法做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

实施例1

1)碳、氮源单因素实验(96孔板实验)

采用的碳源包括：可溶性淀粉、蔗糖、葡萄糖、乳糖；氮源包括：明胶、酵母提取物&酸水解酪蛋白(4/3,g/g)，培养基pH 7.0～7.2，培养基灭菌后使用。碳(C)、氮(N)源分别包括三个水平，即0.5％、1％和1.5％，并由该组空白培养基作为对照。菌体接种量为1％。

使用生长曲线分析仪(OY Growth Curves FP-1100-C，芬兰)测定细胞的生长状况。菌体积累在与仪器配套的孔板中进行，每孔加入200～400μL培养液进行实验。实验条件：检测OD600和OD494，温度37.0℃，转速150rpm，时间为6d。生长曲线结果如图4所示(其中，图4a为菌株以可溶性淀粉为碳源，分别以酵母提取物&酸水解酪蛋白、明胶为氮源时的细胞生长情况；图4b为菌株在以酵母提取物&酸水解酪蛋白为氮源，分别以可溶性淀粉、蔗糖、葡萄糖、乳糖为碳源时的细胞生长情况)。

2)最适碳氮源比例实验(500mL摇瓶实验)

根据上述结果，菌株HRM-150在可溶性淀粉与酵母提取物&酸水解酪蛋白共同存在的培养基中能够出现菌体的大量生长。实验设计碳氮源分别以0.5％、1％、1.5％的添加量进行正交实验。实验以三水平不添加碳源的氮源组作为对照，其它实验条件不变。

菌体采用恒温摇床(HMY-211B，欧诺，中国)进行培养。实验条件：温度37.0℃，转速150rpm，培养12d。每隔1d取样一次，测定OD600。并测定发酵实验终止时的菌体湿重。菌体始终测定结果如图5所示(其中，图5a为不添加碳源的情况下，不同氮源添加量对菌株生长的影响；图5b为氮源添加量为0.5％时，不同碳源添加量对菌株生长的影响；图5c为氮源添加量为1％时，不同碳源添加量对菌株生长的影响；图5d为氮源添加量为1.5％时，不同碳源添加量对菌株生长的影响)。

在不添加碳源的情况下，HRM-150菌体湿重随氮源添加比例的增加而增加，在改良CM培养基中(即17.5g/L)，菌体湿重达到最高(4.15g/L)。当氮源添加比例为0.5％时，添加碳源促进菌体生长。当碳源添加量为1.5％时，菌体湿重达到最高(7.30g/L)。当氮源添加比例为1％时，添加碳源同样促进菌体生长，但三个水平的碳源对菌体生长的影响相差不大，添加1％碳源时菌体湿重达到最高(8.47g/L)。当氮源添加水平为1.5％时，添加1％碳源菌体湿重最高(8.81g/L)。

综上所述，在无碳源添加的组别，氮源添加水平的增加会增加菌体积累量；在同一氮源水平下添加碳源，菌体积累量会大幅度增加，且菌体积累量会随着添加碳源的比例增高而增加，1％氮源添加组除外，该组碳源添加水平对菌体积累量并无产生太大差异。考虑到成本的因素，选择1％氮源和1％碳源水平进行HRM-150菌体的大量培养。

3)发酵实验(5L全自动连续发酵罐)

利用上述实验获得最适碳氮比，即发酵培养基组成为：10g/L酵母提取物和7.5g/L酸水解酪蛋白，碳源选择可溶性淀粉10g/L。发酵控制条件：盐度150；起始转速200rpm，至对数生长期逐渐升高至400rpm；发酵至54h时补加可溶性淀粉10g/L，84h结束发酵。测定菌体湿重为20g/L。

采用高速冷冻离心机(H-2050R，湘仪，中国)8000rpm，10min，4℃进行菌体收集，收集后的菌体放入4℃备用。色素提取后进行硅胶柱层析分离(结果如图6所示)，从HRM-150细胞中分离得到四种主要组分，分别命名为R1-R4。经分析鉴定，R1、R2、R3和R4组分分别为β-胡萝卜素、番茄红素、单脱水菌红素和菌红素，产量分别为7.46、10.82、7.45和5.36mg/L(如表1所示)。

表1为Halorubrum HRM-150色素组分及含量。

抗氧化实验(如图7所示，其中，图7a为色素组分DPPH自由基的清除率，图7b为色素组分还原力，图7c为色素组分总抗氧化力，图7d为色素组分螯合亚铁离子能力)表明，与其它色素组分相比，菌红素(R4)对自由自由基清除率最高，达到17.68％，高于阳性对照组合成β-胡萝卜素；单脱水菌红素(R3)和Mix的自由基清除率基本与对照组β-胡萝卜素持平，其余两组分均比阳性对照组低；色素R1-R4还原力均比阳性对照组β-胡萝卜素的还原力高，还原力最强的组分为R4，为0.18；色素R4总抗氧化力最高达22.89％，其余组分的总抗氧化力相差不大，但均低于R4组分的总抗氧化力。色素R3和Mix的螯合亚铁离子能力相对较高，其值分别为11.81％和11.35％，均高于阳性对照BHA和BHT组。

表1 Halorubrum HRM-150色素组分

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 天津科技大学

<120> 盐红菌Halorubrum sp. HRM-150及其发酵生产类胡萝卜素的方法

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1345

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gattcgacgt tcgtggaacg cctcatccgg acctcactcg ggtgctttga cgggcggtgt 60

gtgcaaggag cagggacgta ttcaccgcgc gcttgtgaca cgcgattact accgaatcca 120

gcttcatgtg ggcgagttgc agcccacaat ccgaactacg atcgagtttc tgagattacc 180

gtctcctttc ggagttggaa ccctttgtct cgaccattgt agcccgcgtg ttgcccagca 240

cattcggggc atactgacct accgttgccc gttccttcct ccgtgttagc cacggcggtc 300

cccctactgt ccccagctac ctcgcggtac tgctggcaag taagggtgcg ggtctcgctc 360

gttgcctgac ttaacaggac gcctcacggt acgagctgac ggcggccatg cacctcctct 420

ctgaaactcg gacaaggtca tcaacctggt cgtcattatt acagtcgatg ctggtgagat 480

gtccggcgtt gagtccaatt aaaccgcagg ctcctccggt tgtagtgctc ccccgccaat 540

tcctttaagt ttcatccttg cggacgtact tcccaggcgg tctgcttagc ggcttcccta 600

cggcacagca cccactcgta gtgggagcca cacctagcag acattgttta cggccaggac 660

tacccgggta tctaatccgg ttcgagaccc tggctttcgt ccctcactgt cggatccgtc 720

ctcgcgacgt gctttcgcca tcggcggtcc gtccaggatt acgggatttc actcctaccc 780

cggacgtacc cgtcgcgcct tccggtccca agccacgcag tttctaccgg gcgcccacct 840

gttgggcagg tggatttccc gatggacttg cgcggccagc tacggacgct ttaggcccaa 900

taagatcggc catcacttgg gctgccggta ttaccgcggc ggctggcacc ggtcttgccc 960

agcccttatt ctggtaccac cttacggtac cgaaaagcac aggcgctatg cctgtgcact 1020

tgggatcccc ctatcgcact gtcgtgcagt gtaaaggttt cgcgcctgct gcgccccgta 1080

gggcccggaa tcttgtctca gattccgtct ctgggttctc actctcatga cccataccga 1140

ttattggcac ggtgggccgt taccccaccg tctacctaat cggccgcagc cacatccttc 1200

ggcgccggag cgtttggcat accactcatt ccagtggtgg tatggtatac actattagcc 1260

tcagtttccc gagggtattg tgttccgaag ggtagtttgg ccacgtgtta ctgagctatt 1320

cgccacgagt ctgaactcgt gcgac 1345

盐红菌Halorubrumsp.HRM-150及其发酵生产类胡萝卜素的方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。