专利摘要

本发明公开了一种焦磷酸盐化胆固醇及其制备方法和用途。本发明通过点击化学连接胆固醇与焦磷酸盐，将胆固醇在药物制剂中的广泛应用与焦磷酸盐的骨靶向性二者相结合，制备出对骨具有强亲和力的靶向辅料—焦磷酸盐化胆固醇(PPi‑Chol)，大大提升骨靶向剂型方面的研究进展，提升骨相关疾病的治疗效果。

权利要求

1.一种制备焦磷酸盐化胆固醇的方法，其特征在于：所述焦磷酸盐化胆固醇的化学结构式如下：

；

所述焦磷酸盐化胆固醇的合成路线如下：

；

所述方法的具体步骤如下：

(1)0℃下，将胆固醇溶解在无水二氯甲烷中，再缓慢加入三乙胺，DMAP，最后缓慢加入对甲苯磺酰氯，室温搅拌过夜；用盐酸洗2次，饱和NaCl溶液洗2次，有机层加无水Na2SO4干燥，真空旋转挥干有机溶剂，过硅胶柱，流动相为石油醚和乙酸乙酯，体积比4:1；得产物2；

(2)产物2溶解在干燥的1,4-二氧六环中，加入三甘醇，薄层鉴定反应终点，挥去有机溶剂，反应物溶解在氯仿中，饱和NaHCO3溶液萃取2次，饱和NaCl溶液洗2次，无水Na2SO4干燥，真空旋转蒸发氯仿，过硅胶柱，流动相为石油醚和乙酸乙酯，体积比为1:1；得白色油状固体-产物3；

(3)产物3溶解在无水DCM中，再加入溴乙酸，再在0℃下，加入DCC，DMAP，室温搅拌，过滤，减压蒸干，过硅胶柱，流动相为石油醚和乙酸乙酯，体积比为3:1；得产物4；

(4)TBAP溶解在无水乙腈中，再加入产物4，搅拌，旋转蒸干有机溶剂，残渣溶解在NaCl溶液中，过含有Na+交换树脂的树脂柱，用NaCl溶液冲洗，洗脱液RT旋转蒸干，1H NMR谱中不再有Bu4N的峰为止，用纤维素快速色谱除去多余的焦磷酸盐，以流动相体积比为4.5:2:3的异丙醇:乙腈:水洗脱，收集洗脱液，室温旋转蒸干，纯净的产物-20℃保存。

2.如权利要求1所述的焦磷酸盐化胆固醇用于制备治疗骨相关疾病药物的用途。

说明书

技术领域

本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种焦磷酸盐化胆固醇及其制备方法和用途。

背景技术

点击化学(Click Chemistry)是指一组反应快速，操作简单，容易提纯，反应灵活，配向性好，且产物产率高的一组反应。如叠氮化1,3-偶极环加成反应、末端炔烃偶极环加成反应等。在材料科学、高分子化学，医药科学中应用广泛，比如生物偶联，纳米颗粒表面改性，以及与制药相关的高分子化学。

自1999年，在第217届美国化学学会年会上由巴里·夏普勒斯博士团队首次提出以来，如今点击化学已经成为一个非常热门的话题，相应的出版物以近乎指数级别增长。在2007年12月31日统计的通过SciFinder 进行的文献搜索显示,共有788个含有“点击化学”或“点击反应”关键词的出版物。

一、点击化学目前主要分为以下四类：

1、环加成反应：主要指1,3-偶极环加成，也包括异狄尔斯-阿尔德加成。

2、亲核开环反应：指连接紧密的杂环亲电试剂的开环，如氮杂环丙烷、环氧化合物、环硫酸盐，氮化铵离子，附子离子等。

3、非醛类的羰基化学反应：如尿素酶、硫脲、腙、肟、醚类、酰胺、芳香杂环化合物的合成。

4、增加碳碳多键的反应：如环氧化反应、氮丙啶二羟基化反应、硫酰卤加成、,亚硝酰卤加成和某些迈克尔加成。

二、点击化学在药物科学中的应用主要体现在以下一些方面：

1、点击化学与聚合物治疗：包括用点击化学合成阻滞共聚物、点击化学与聚合物胶束、点击化学和线性多功能聚合物运载系统等。

2、点击化学和纳米颗粒递送系统：金和磁性纳米颗粒以及脂质体等。

3、生物偶联：放射性标记、标记的大肠杆菌、标记豇豆花叶病毒、DNA探针标记、偶联多糖等。

药物靶向纳米颗粒输送系统有以下优点：减少用药剂量，最小化副作用，保护药物免于降解和增加药物稳定性。通过点击化学对这些药物表面进行修饰，对其理化性质和治疗作用有显著的影响。如改变Zeta电位，疏水性，靶向性等。

胆固醇作为一些新兴剂型的乳化剂，在药物制剂中得到广发的应用。比如脂质体、聚合物胶束等。三(四丁基铵)氢焦磷酸钾盐(TBAP)分子式(Bu4N)3(HO)P2O6，是一种焦磷酸盐衍生物，TBAP对骨骼主要矿物成分—羟基磷灰石(hydroxyapatite，HA)有非常好的亲和力，体现出较强靶向性。因此，将TBAP作为骨疾病方面的治疗的靶向介导因子，有助于加强药物的治疗效果。

胆固醇是构成动物细胞膜的必需成分，具有重要的生理作用，是人体不可缺少的物质。早在18世纪，人们已从胆石中发现了胆固醇，1816年，化学家费歇尔将这种具脂类性质的物质命名为“胆固醇”。胆固醇亦称胆甾醇，是人类最早发现的一种甾体化合物。胆固醇是以环戊烷多氢菲核为骨架的27碳化合物。

这类小分子物质以游离或酯(软脂酸、硬脂酸、油酸)的形式广泛存在于一切动物组织中，尤以脑和神经组织中最为丰富，在肾、脾、皮肤、肝和胆汁中含量也高。植物组织中不含或含有极少量的胆固醇。胆固醇是构成动物细胞膜的必需成分，它不仅参与形成细胞膜，而且是合成胆汁酸，维生素D以及甾体激素的原料，具有重要的生理作用，同时也是人体必需的营养成分。胆固醇的溶解性与脂肪类似，不溶于水，易溶于乙醚、氯仿等溶剂。研究发现，适量的胆固醇对维持人体正常的生理功能具有重要的意义，但体内堆积过多的胆固醇也会影响人体自身的健康。

胆固醇作为一些新兴剂型的乳化剂，可调节磷脂双分子层膜的流动性，使膜通透性降低，减少药物渗漏。同时可使脂膜维持一定柔韧性，增强药物载体囊泡抗击外部条件变化的能力。并对磷脂的氧化有一定保护作用。在药物制剂中得到广发的应用。比如脂质体、聚合物胶束等。

三(四丁基铵)氢焦磷酸钾盐(TBAP)分子式(Bu4N)3(HO)P2O6，是一种焦磷酸盐衍生物，TBAP对骨骼主要矿物成分—羟基磷灰石(hydroxyapatite，HA)有非常好的亲和力，二者主要通过分子间氢键相互结合，体现出较强靶向性。因此，将TBAP作为骨疾病方面的治疗的靶向介导因子，有助于加强药物的治疗效果。

发明内容

本发明目的在于提供一种焦磷酸盐化胆固醇及其制备方法和用途。

本发明采取的技术方案是：

本发明焦磷酸盐化胆固醇的化学结构式如下：

本发明的焦磷酸盐化胆固醇的合成路线如下：

所述方法的具体步骤如下：

(1)0℃下，将胆固醇溶解在无水二氯甲烷中，再缓慢加入三乙胺，DMAP，最后缓慢加入对甲苯磺酰氯，室温搅拌过夜；用盐酸洗2次，饱和NaCl溶液洗2次，有机层加无水Na2SO4干燥，真空旋转挥干有机溶剂，过硅胶柱，流动相为石油醚和乙酸乙酯，体积比4:1；得产物2；

(2)产物2溶解在干燥的二恶烷中，加入三甘醇，薄层鉴定反应终点，挥去有机溶剂，反应物溶解在氯仿中，饱和NaHCO3溶液萃取2次，饱和NaCl溶液洗2次，无水Na2SO4干燥，真空旋转蒸发氯仿，过硅胶柱，流动相为石油醚和乙酸乙酯，体积比为1:1；得白色油状固体-产物3；

(3)产物3溶解在无水DCM中，再加入溴乙酸，再在0℃下，加入DCC，DMAP，室温搅拌，过滤，减压蒸干，过硅胶柱，流动相为石油醚和乙酸乙酯，体积比为3:1；得产物4；

(4)TBAP溶解在无水乙腈中，再加入产物4，搅拌，旋转蒸干有机溶剂，残渣溶解在NaCl溶液中，过含有Na+交换树脂的树脂柱，用NaCl溶液冲洗，洗脱液RT旋转蒸干，1H NMR谱中不再有Bu4N的峰为止，用cellulose flash chromatography除去多余的焦磷酸盐，以流动相体积比为4.5:2:3的异丙醇:乙腈:水洗脱，收集洗脱液，室温旋转蒸干，纯净的产物-20℃保存。

本发明的焦磷酸盐化胆固醇可以用于制备治疗骨相关疾病药物。

本发明的积极效果如下：

本发明通过点击化学连接胆固醇与焦磷酸盐，降胆固醇在药物制剂中的广泛应用于焦磷酸盐的骨靶向性二者相结合，制备出对骨具有强亲和力的靶向辅料—焦磷酸盐化胆固醇(PPi-Chol)，大大提升骨靶向剂型方面的研究进展，提升骨相关疾病的治疗效果。

附图说明

图1是体外靶向于HA能力

图2是体外靶向于HA动力学

图3是体外靶向于HA动力学

图4是体外靶向于HA能力动力学

具体实施方式

下面的实施例是对本发明的进一步详细描述。

实施例1

1、 0℃下，胆固醇(1.933g,5mmol)溶解在40mL的无水二氯甲烷中，再缓慢加入三乙胺(1.125mL,7.5mmol)，DMAP(60mg,0.5mmol)，最后缓慢加入对甲苯磺酰氯(1.43g,7.5mmol)，室温搅拌过夜。1mol/L盐酸洗2次，每次40mL，饱和NaCl溶液洗2次，每次40mL。有机层加适量无水Na2SO4干燥。真空旋转挥干有机溶剂。过硅胶柱(石油醚:乙酸乙酯4:1)。

2、产物2，(2.16g,4mmol)溶解在30mL干燥的二恶烷中，加入(15mL,111mmol)三甘醇。(薄层鉴定反应终点)。挥去有机溶剂，反应物溶解在50mL氯仿中，饱和NaHCO3溶液萃取2次，每次50mL，饱和NaCl溶液洗2次，每次50mL。适量无水Na2SO4干燥。真空旋转蒸发氯仿，过硅胶柱，(石油醚:乙酸乙酯1:1)得白色油状固体。

3、产物3溶解在适量无水DCM中，再加入溴乙酸(1:1.3mol/mol)。再在0℃下，加入DCC 1.1eq，DMAP 0.1eq，室温搅拌4h，过滤，减压蒸干，过硅胶柱(石油醚:乙酸乙酯3:1)

4、 1eq TBAP溶解在适量无水乙腈中，再加入0.5eq产物4，搅拌2h，旋转蒸干有机溶剂，残渣溶解在适量25mM的NaCl溶液中，过含有30eq Na+交换树脂的树脂柱，用25mM的NaCl溶液以15min一柱的速率冲洗。洗脱液RT旋转蒸干，1H NMR谱中不再有Bu4N的峰为止，用cellulose flash chromatography除去多余的焦磷酸盐。以(异丙醇:乙腈:水4.5:2:3)洗脱，收集洗脱液，室温旋转蒸干，纯净的产物-20℃保存。

产物的核磁数据如下：(Brooker 400NMR Spectrometer):1H NMR(400MHz,D2O)δ＝5.34(d,1H,J＝4.9Hz),4.59(d,J＝8.8Hz,2H),4.16(t,2H,J＝4.9Hz),3.69(t,2H,J＝4.9Hz),3.61–3.59(m,8H),3.18–3.15(m,1H),2.95(br,1H)；2.37–2.34(m,1H),2.22–2.19(m,1H),2.02–1.01(m,26H),0.99(s,3H),0.91(d,3H,J＝6.3Hz),0.86(dd,6H,J1＝6.3Hz,J2＝2.2Hz),0.67(s,3H)；13C NMR(125MHz,D2O)δ＝167,79.4,70.9,70.7,70.5,69.2,68.6,67.2,56.7,56.1,50.1,44.3,42.3,39.7,39.5,39.0,37.2,36.8,36.1,35.7,31.9,31.8,28.3,28.2,28.0,24.2,23.8,22.8,22.5,21.6,21.0,18.7,11.8.31P NMR(202MHz,D2O)δ＝-10.55(d,J＝20.2Hz,1P),-11.45(d,J＝20.2Hz,1P).

药效学参数

一、体外靶向于HA能力研究

在与骨、牙齿主要成分—羟基磷灰石(HA)共同孵育30min后，通过荧光显微镜可以看出载有荧光素钠的靶向脂质体(磷脂:胆固醇:PPi-TEG-Chol 70:20:10)(图1b)显示出极强的靶向性，明显高于普通脂质体(磷脂:胆固醇:PPi-TEG-Chol 70:30:0)(图1a)。

二、体外靶向于HA动力学研究

图2的体外靶向动力学显示，在与羟基磷灰石(HA)共同孵育10min后，载有淫羊藿苷的靶向脂质体(磷脂:胆固醇:PPi-TEG-Chol 70:20:10)显示出极强的靶向性(>70％)，而载有淫羊藿苷的普通脂质体(磷脂:胆固醇:PPi-TEG-Chol 70:30:0)显示出极微弱的靶向性(<10％)。

实施例2

(1)、2,2-双-(溴甲基)丙烷-1,3-二醇和叠氮化钠适量溶解在二甲基甲酰胺中，120℃搅拌过夜，过滤，除去有机溶剂，残留物标准乙醚/NaCl水溶液萃取，，粗产物过硅胶柱，用氯仿:甲醇＝20:1洗脱，用进一步纯化，纯化得到的产物与溴乙酸(1:1.3,mol/mol)加入适量无水二氯甲烷中。上述溶液在零度下加入二环己基碳二亚胺(DCC)1.1当量，4-二甲氨基吡啶(DMAP)0.1当量，室温搅拌4h，过滤，减压蒸干，过硅胶柱(环己烷:乙酸乙酯3:1)得产物1.

(2)、三(四丁基铵)氢焦磷酸钾盐1当量和粗产物10.5当量溶解在适量无水乙腈中，室温搅拌2h，旋转蒸干有机溶剂，残渣溶解在适量25mmol/L的NaCl溶液中，过含有30当量Na+交换树脂的树脂柱，用25mmol/L的NaCl溶液以15min一柱的速率冲洗。洗脱液室温旋转蒸干，至1H NMR谱中不再有Bu4N的峰为止，用快速纤维素柱色谱除去多余的焦磷酸盐。以(异丙醇:乙腈:水4.5:2:3)洗脱，收集洗脱液，室温旋转蒸干，得产物2

(3)、聚乙二醇2000或聚乙二醇600溶解在适量无水甲苯中，回流，旋转蒸干除去其中水分，20％的碳酰氯甲苯溶液在搅拌下加入到上述聚乙二醇溶液中，通风橱里反映过夜，真空干燥除去多余的碳酰氯，残留物溶解在适量无水二氯甲烷中，加入炔丙基胺，室温反应7-8h，产物用乙醚清洗三次，过LH-20柱，水透析得产物3。

(4)、产物2、产物3以1:1mol/mol和0.1当量CuSO4·5H2O溶解在适量水溶液中，逐滴加入抗坏血酸钠溶液，反应在氩气保护下室温反应4h，旋转蒸干多余水，用EDTA除去Cu2+，得最终产物。

合成路线如下：

体外靶向于HA动力学研究：

图3可以明显看出，含有PPi-PEG的聚合物，不管是高分子量还是低分子量都比不含PPi-PEG的聚合物显示出更强的靶向于HA的能力。

实施例3

合成路线如下：

合成双L-磷酸丝氨酸聚丙二醇环氧乙烷加聚物(a)和焦磷酸盐聚丙二醇环氧乙烷加聚物(b)

体外靶向于HA动力学研究：

牙齿靶向聚合物胶束在HA上的靶向动力学，用从图4中可以看出用双L-磷酸丝氨酸聚丙二醇环氧乙烷加聚物制备的牙齿靶向聚合物胶束(DPS-TBM)的靶向能力不及由焦磷酸盐聚丙二醇环氧乙烷加聚物制备的牙齿靶向聚合物胶束(PPi-TBM).

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

一种焦磷酸盐化胆固醇及其制备方法和用途专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。