用于检测α-甲酰基-CoA消旋酶(AMACR)和前列腺癌的系统和方法

IPC分类号 : G01N33/487,G01N27/327,B01J21/00,B01J23/00

申请号

CN201380055579.5

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专利摘要

本发明提供了一种用于测定肌体样品中α-甲酰基-CoA(AMACR)水平的检测系统，其包含：至少一种反应溶液，其用于在与所述的肌体样品中的AMACR结合时产生H2O2；以及生物传感器，其用于测定所生成的H2O2的水平。所述的反应溶液包含可以被AMACR手性转化成(2S)-2-甲酰基-CoA差向异构体的(2R)-2-甲酰基-CoA差向异构体，以及与所述的(2S)-2-甲酰基-CoA差向异构体一起实施β-氧化从而生成过氧化氢(H2O2)的酶。

权利要求

1.一种用于测定肌体样品中α-甲酰基-CoA(AMACR)水平的检测系统，其包含：

至少一种反应溶液，其用于在与所述的肌体样品中的AMACR结合时产生H₂O₂，所述的反应溶液包含可以被AMACR手性转化成(2S)-2-甲酰基-CoA差向异构体的(2R)-2-甲酰基-CoA差向异构体，以及与所述的(2S)-2-甲酰基-CoA差向异构体一起实施β-氧化从而生成过氧化氢(H₂O₂)的酶；以及

生物传感器，其用于测定所生成的H₂O₂的水平。

2.权利要求1所述的检测系统，所述的反应溶液包含辅酶A(CoA)、过氧化物酶体酰基-辅酶A氧化酶3(ACOX3)、三磷酸腺苷(ATP)以及具有(R)和(S)差向异构体的支化脂肪酸，其中仅所述的(R)差向异构体为AMACR的反应底物。

3.权利要求2所述的检测系统，所述的支化脂肪酸包含降植烷酸。

4.权利要求1所述的检测系统，所述的肌体样品包含选自血液、血浆、血清和尿的体液。

5.权利要求1所述的检测系统，所述的生物传感器包含工作电极和反电极，该工作电极和反电极包含催化剂颗粒，其用于增加与H₂O₂的电化学氧化-还原反应速率，并在比不具有所述的催化剂颗粒的更低的氧化电势下提供对H₂O₂的检测。

6.权利要求5所述的检测系统，所述的催化剂颗粒包含纳米颗粒金属催化剂。

7.权利要求5所述的检测系统，所述的催化剂颗粒包含一元金属(M)、二元金属(M-X)、一元金属氧化物(MOy)、二元金属氧化物(MOy-XOy)、金属-金属氧化物复合材料(M-MOy)或它们的组合，其中y小于3，并且M和X独立地选自Li,Na,Mg,Al,K,Ca,Cr,Mn,Fe,Co,Ni,Cu,Zn,Ga,Sr,Y,Zr,Nb,Mo,Ru,Rh,Pd,Ag,Cd,In,Sn,Ba,La,Ce,Pr,Nd,Sm,Eu,Gd,Tb,Dy,Ho,Er,Tm,Lu,Ta,W,Os,Ir,Pt,Au和Pb。

8.权利要求5所述的检测系统，所述的催化剂颗粒包含氧化铱颗粒。

9.权利要求1所述的检测系统，其进一步包含用于将电压电势施加在所述的工作电极和所述的反电极上、并测量所述的工作电极与所述的反电极之间的电流的测量装置。

10.权利要求1所述的检测系统，其适用于检测受试对象中的前列腺癌。

11.一种用于检测受试对象的前列腺癌的检验，其包含：

生物传感器，其用于测定所生成的H₂O₂的水平。

12.权利要求11所述的检验，所述的反应溶液包含辅酶A(CoA)、过氧化物酶体酰基-辅酶A氧化酶3(ACOX3)、三磷酸腺苷(ATP)以及具有(R)和(S)差向异构体的支化脂肪酸，其中仅所述的(R)差向异构体为AMACR的反应底物。

13.权利要求12所述的检验，所述的支化脂肪酸包含降植烷酸。

14.权利要求11所述的检验，所述的肌体样品包含选自血液、血浆、血清和尿的体液。

15.权利要求11所述的检验，所述的生物传感器包含工作电极和反电极，该工作电极和反电极包含催化剂颗粒，其用于增加与H₂O₂的电化学氧化-还原反应速率，并在比不具有所述的催化剂颗粒的更低的氧化电势下提供对H₂O₂的检测。

16.权利要求15所述的检验，所述的催化剂颗粒包含纳米颗粒金属催化剂。

17.权利要求15所述的检验，所述的催化剂颗粒包含一元金属(M)、二元金属(M-X)、一元金属氧化物(MOy)、二元金属氧化物(MOy-XOy)、金属-金属氧化物复合材料(M-MOy)或它们的组合，其中y小于3，并且M和X独立地选自Li,Na,Mg,Al,K,Ca,Cr,Mn,Fe,Co,Ni,Cu,Zn,Ga,Sr,Y,Zr,Nb,Mo,Ru,Rh,Pd,Ag,Cd,In,Sn,Ba,La,Ce,Pr,Nd,Sm,Eu,Gd,Tb,Dy,Ho,Er,Tm,Lu,Ta,W,Os,Ir,Pt,Au和Pb。

18.权利要求15所述的检验，所述的催化剂颗粒包含氧化铱颗粒。

19.权利要求11所述的检验，其进一步包含用于将电压电势施加在所述的工作电极和所述的反电极上、并测量所述的工作电极与所述的反电极之间的电流的测量装置。

20.一种检测受试对象中的AMACR的方法，该方法包含：

由所述的受试对象获得肌体样品，所述的肌体样品包含选自血液、血浆、血清和尿的体液；

将所述的肌体样品与至少一种反应溶液结合，该反应溶液用于在与所述的肌体样品中的AMACR结合时产生H₂O₂，所述的反应溶液包含可以被AMACR手性转化成(2S)-2-甲酰基-CoA差向异构体的(2R)-2-甲酰基-CoA差向异构体，以及与所述的(2S)-2-甲酰基-CoA差向异构体一起实施β-氧化从而生成过氧化氢(H₂O₂)的酶；以及

使用生物传感器检测在所述的反应溶液中生成的H₂O₂的数量，其中与对照相比，所检测的H₂O₂的数量增加表明所述的肌体样品中的AMACR的数量增加。

21.权利要求20所述的方法，所述的反应溶液包含辅酶A(CoA)、过氧化物酶体酰基-辅酶A氧化酶3(ACOX3)、三磷酸腺苷(ATP)以及具有(R)和(S)差向异构体的支化脂肪酸，其中仅所述的(R)差向异构体为AMACR的反应底物。

22.权利要求21所述的方法，所述的支化脂肪酸包含降植烷酸。

23.权利要求20所述的方法，所述的生物传感器包含工作电极和反电极，该工作电极和反电极包含催化剂颗粒，其用于增加与H₂O₂的电化学氧化-还原反应速率，并在比不具有所述的催化剂颗粒的更低的氧化电势下提供对H₂O₂的检测。

24.权利要求23所述的方法，所述的催化剂颗粒包含纳米颗粒金属催化剂。

25.权利要求23所述的方法，所述的催化剂颗粒包含一元金属(M)、二元金属(M-X)、一元金属氧化物(MOy)、二元金属氧化物(MOy-XOy)、金属-金属氧化物复合材料(M-MOy)或它们的组合，其中y小于3，并且M和X独立地选自Li,Na,Mg,Al,K,Ca,Cr,Mn,Fe,Co,Ni,Cu,Zn,Ga,Sr,Y,Zr,Nb,Mo,Ru,Rh,Pd,Ag,Cd,In,Sn,Ba,La,Ce,Pr,Nd,Sm,Eu,Gd,Tb,Dy,Ho,Er,Tm,Lu,Ta,W,Os,Ir,Pt,Au和Pb。

26.权利要求23所述的方法，所述的催化剂颗粒包含氧化铱颗粒。

27.权利要求23所述的方法，其进一步包含将电压电势施加在所述的工作电极和所述的反电极上，以及测量所述的工作电极与所述的反电极之间的电流，从而测定H₂O₂的水平。

28.一种检测受试对象中前列腺癌或者前列腺癌风险增高的方法，该方法包含：

由所述的受试对象获得肌体样品，所述的肌体样品包含选自血液、血浆、血清和尿的体液；

使用生物传感器检测在所述的反应溶液中生成的H₂O₂的数量，其中与对照相比，所检测的H₂O₂的数量增加表明所述的肌体样品中的AMACR的数量增加。

29.权利要求28所述的方法，所述的反应溶液包含辅酶A(CoA)、过氧化物酶体酰基-辅酶A氧化酶3(ACOX3)、三磷酸腺苷(ATP)以及具有(R)和(S)差向异构体的支化脂肪酸，其中仅所述的(R)差向异构体为AMACR的反应底物。

30.权利要求29所述的方法，所述的支化脂肪酸包含降植烷酸。

31.权利要求28所述的方法，所述的生物传感器包含工作电极和反电极，该工作电极和反电极包含催化剂颗粒，其用于增加与H₂O₂的电化学氧化-还原反应速率，并在比不具有所述的催化剂颗粒的更低的氧化电势下提供对H₂O₂的检测。

32.权利要求31所述的方法，所述的催化剂颗粒包含纳米颗粒金属催化剂。

33.权利要求31所述的方法，所述的催化剂颗粒包含一元金属(M)、二元金属(M-X)、一元金属氧化物(MOy)、二元金属氧化物(MOy-XOy)、金属-金属氧化物复合材料(M-MOy)或它们的组合，其中y小于3，并且M和X独立地选自Li,Na,Mg,Al,K,Ca,Cr,Mn,Fe,Co,Ni,Cu,Zn,Ga,Sr,Y,Zr,Nb,Mo,Ru,Rh,Pd,Ag,Cd,In,Sn,Ba,La,Ce,Pr,Nd,Sm,Eu,Gd,Tb,Dy,Ho,Er,Tm,Lu,Ta,W,Os,Ir,Pt,Au和Pb。

34.权利要求31所述的方法，所述的催化剂颗粒包含氧化铱颗粒。

35.权利要求31所述的方法，其进一步包含将电压电势施加在所述的工作电极和所述的反电极上，以及测量所述的工作电极与所述的反电极之间的电流，从而测定H₂O₂的水平。

说明书

相关申请

本申请要求2012年8月24日提交的美国临时申请No.61/692,988的优先权，该申请的主题以引用方式全文并入本文。

背景技术

在美国，前列腺癌是男人中最普通的恶性肿瘤，并且还在男性癌症死中排名为第二名的最普通的原因。除了直肠指检以外，前列腺特异性抗原(PSA)血液检验是传统上筛查前列腺癌的优选方式。尽管前列腺癌筛查可以早期诊断前列腺癌，这会相应地允许进行治愈性治疗，但是由于血清PSA对前列腺癌不具有特异性，所以前列腺癌筛查还具有很大的局限。PSA筛查的主要局限之一是在具有其他普通良性状况(例如良性前列腺增生、前列腺炎)或在较少的临床程序(例如经直肠超声)后的患者中，血清PSA可以升高血清。因此，每4名具有前列腺活组织检查的男人中，就有1名被检测出前列腺癌。

此外，PSA也不是侵略性前列腺癌的可靠生物标志物。高分级的前列腺癌实际上产生较少的PSA，并且PSA的绝对数不能精确地反应疾病的侵略性。对于被诊断患有前列腺癌的男人而言，许多都患有无临床意义的疾病，这些疾病在他们的一生中都不会发展成有症状的。估计由PSA筛查导致的无临床意义前列腺癌的这种“过度诊断”高达30％，并随后导致过度治疗。前列腺癌治疗的副作用可以包含不必要的痛苦的活组织检查、手术并发症、放射性烧伤、失禁、勃起功能障碍、肠道伤害和患者焦虑。因此，明确地需要前列腺癌的改善的生物标志物。

α-甲酰基-CoA消旋酶(AMACR)为与食物支链脂肪酸的过氧化物酶体β-氧化有关的酶。AMACR在前列腺癌上皮细胞中持续过表达；因此，其成为前列腺内癌细胞的离理想的特异性生物标志物。由于AMACR的表达在恶化前损伤(前列腺上皮内瘤)中增加，所以AMACR的过表达可以增加前列腺癌的风险。此外，流行病学、遗传学和试验室研究可以定向于AMACR在前列腺癌中的重要性。在遗传性前列腺癌家族中，连锁的全基因组扫描证明AMACR的染色体区域(5p13)为前列腺癌易患基因的位置，并且已经显示在患有遗传性前列腺癌的家族中，AMACR基因序列的变体(多态性)与前列腺癌共同分离。

发明概述

本文所述的实施方案涉及用于检测、鉴定、定量和/或测定α-甲酰基-CoA消旋酶(AMACR)在肌体样品中的水平的检测系统和体外检验，以及用于诊断、鉴定、分期和/或监测在患有前列腺癌、疑似患有前列腺癌或处于前列腺癌风险下的受试对象中的前列腺癌的检测系统和体外检验。所述的检测系统包含：至少一种反应溶液，其用于在与肌体样品中的ARACR结合时生成H₂O₂；以及生物传感器，用于测定所生成的H₂O₂的水平。在一些实施方案中，所述的至少一种反应溶液包含：(2R)-2-甲酰基-CoA差向异构体，其可以被AMACR手性转化成(2S)-2-甲酰基-CoA差向异构体；以及酶，其与(2S)-2-甲酰基-CoA差向异构体一起实施β-氧化，从而生成过氧化氢(H₂O₂)。在其他的实施方案中，所述的反应溶液可以包含辅酶A(CoA)、过氧化物酶体酰基-辅酶A氧化酶3(ACOX3)、三磷酸腺苷(ATP)以及具有(R)和(S)差向异构体的支化脂肪酸，其中在所述的差向异构体中，仅(R)差向异构体为AMACR的反应底物。所述的支化脂肪酸可以为例如2-甲基羧酸，其包含(2R)-2-甲基羧酸差向异构体和(2S)-2-甲基羧酸差向异构体。在一个实例中，所述的支化脂肪酸可以为降植烷酸。

在一些实施方案中，所述的肌体样品可以包含可潜在地包含AMACR的体液，例如血液、血浆、血清或尿。

在其他实施方案中，所述的生物传感器可以包含工作电极、反电极以及可任选的参照电极。工作电极和反电极可以包含催化剂颗粒，该催化剂颗粒可以增加与H₂O₂的电化学氧化-还原反应的速率，并且所述的工作电极和反电极可以在比不存在催化剂颗粒的更低的氧化电势下，提供对H₂O₂的检测。所述的催化剂颗粒可以包含纳米颗粒金属催化剂，例如一元金属(M)、二元金属(M-X)、一元金属氧化物(MOy)、二元金属氧化物(MOy-XOy)、金属-金属氧化物复合材料(M-MOy)或它们的组合，其中y小于3，并且M和X独立地选自Li,Na,Mg,Al,K,Ca,Cr,Mn,Fe,Co,Ni,Cu,Zn,Ga,Sr,Y,Zr,Nb,Mo,Ru,Rh,Pd,Ag,Cd,In,Sn,Ba,La,Ce,Pr,Nd,Sm,Eu,Gd,Tb,Dy,Ho,Er,Tm,Lu,Ta,W,Os,Ir,Pt,Au和Pb。在一个实施方案中，所述的催化剂颗粒可以包含氧化铱颗粒。

此外，所述的检测系统还可以包含用于将电压电势施加到工作电极、反电极和/或参照电极，并且测量工作电极和反电极之间的电流的测量装置。

本文所述的其他实施方案涉及检测、鉴定、定量和/或测定AMACR在肌体样品中的水平的方法，以及诊断、鉴定、分期和/或监测在患有前列腺癌、疑似患有前列腺癌或处于前列腺癌风险下的受试对象中的前列腺癌的方法。所述的方法包含由受试对象获得肌体样品。肌体样品可以包含可潜在地包含AMACR的体液，例如血液、血浆、血清和尿。体液样品与至少一种反应溶液结合，其中所述的反应溶液在与肌体样品中的AMACR结合时可生成H₂O₂。在一些实施方案中，所述的至少一种反应溶液包含：(2R)-2-甲酰基-CoA差向异构体，其可以被AMACR手性转化成(2S)-2-甲酰基-CoA差向异构体；以及酶，其与(2S)-2-甲酰基-CoA差向异构体一起实施β-氧化，从而生成过氧化氢(H₂O₂)。在其他的实施方案中，所述的反应溶液可以包含辅酶A(CoA)、过氧化物酶体酰基-辅酶A氧化酶3(ACOX3)、三磷酸腺苷(ATP)以及具有(R)和(S)差向异构体的支化脂肪酸，其中在所述的差向异构体中，仅(R)差向异构体为AMACR的反应底物。所述的支化脂肪酸可以为例如2-甲基羧酸，其包含(2R)-2-甲基羧酸差向异构体和(2S)-2-甲基羧酸差向异构体。在一个实例中，所述的支化脂肪酸可以为降植烷酸。使用生物传感器来检测反应溶液中生成的H₂O₂的量、数量或水平。H₂O₂的数量比对照升高表明肌体样品中AMACR的数量水平升高，并且表明受试对象患有前列腺癌或者患前列腺癌的风险增加。

在一些实施方案中，所述的生物传感器可以包含工作电极、反电极以及可任选的参照电极。工作电极和反电极可以包含催化剂颗粒，该催化剂颗粒可以增加与H₂O₂的电化学氧化-还原反应的速率，并且所述的工作电极和反电极可以在比不存在催化剂颗粒的更低的氧化电势下，提供对H₂O₂的检测。所述的催化剂颗粒可以包含纳米颗粒金属催化剂，例如一元金属(M)、二元金属(M-X)、一元金属氧化物(MOy)、二元金属氧化物(MOy-XOy)、金属-金属氧化物复合材料(M-MOy)或它们的组合，其中y小于3，并且M和X独立地选自Li,Na,Mg,Al,K,Ca,Cr,Mn,Fe,Co,Ni,Cu,Zn,Ga,Sr,Y,Zr,Nb,Mo,Ru,Rh,Pd,Ag,Cd,In,Sn,Ba,La,Ce,Pr,Nd,Sm,Eu,Gd,Tb,Dy,Ho,Er,Tm,Lu,Ta,W,Os,Ir,Pt,Au和Pb。在一个实施方案中，所述的催化剂颗粒可以包含氧化铱颗粒。

附图简述

图1为根据一个应用方面的生物传感器的示意图。

图2为通过丝网印刷工艺制造的一排生物传感器阵列的顶视图。

图3(A-C)示出多附图，其显示(a)PBS介质的对照样品溶液、和PB+降植烷酸；(b)PBS、和PBS+AMACR；(c)降植烷酸+PBS+ACOX3+AMACR、降植烷酸+PBS+ACOX3、和降植烷酸+PBS的循环伏安图。

图4(A-B)示出多附图，其显示由包含AMACR的不同血浆样品以(A)年月日顺序和(B)样品编号顺序得到的测量电流读数。样品1-9得自健康男子。样品11-20得自患有高分级前列腺上皮内瘤(HGPIN)的男子。样品21-25得自患有前列腺癌的男子(Gleason得分为6-7)。

发明详述

除非本文明确说明，否则所用的所有术语都具有与题述应用领域的那些技术人员所理解的相同的含义。对于说明书和权利要求书中使用的术语，明确提供以下定义。

如本文所用，术语“监测”是指使用由数据库产生的结果来提供关于个体、或者个体健康或疾病状态的有用信息。“监测”可以包含例如预后测定、风险分层、药物治疗的选择、评估进行中的药物治疗、测定治疗的有效性、预测结果、测定对治疗的应答、诊断疾病或疾病并发症、跟踪疾病进程或提供一段时间内与患者健康状态有关的任何信息、选择最可能受益于试验治疗(具有已知的分子作用机制)的患者、选择最可能受益于经批准的药物(具有已知的分子机制，其中该机制在一小部分疾病中是重要的，对于所述的疾病，所述的药剂不具有标记)的患者、筛选患者群体以帮助对更侵入式/昂贵的测试(例如由非侵入式血液测试至更侵入式选择(例如活组织检查)的一系列测试)作出决定、或者评估用于治疗另一种迹象的药物副作用的测试。

如本文所用，术语“定量数据”、“定量水平”或“定量数量”是指与任何数据库组成(例如标志物、临床迹象)有关的数据、水平或数量，其中所述的组成可以被赋予数值。

如本文所用，术语“受试对象”是指男性人类或另一种雄性哺乳动物，其可以受到前列腺疾病(包含前列腺癌)的折磨，但是可以患有或不患有此类疾病。通常，对于人类个体而言，术语“受试对象”和“患者”在本文中可以交换使用。

如本文所用，术语“疑似患有前列腺癌的受试对象”是指这样的受试对象，其呈现一种或多种表示前列腺癌的症状，或者是针对前列腺癌而筛选的(例如在常规体检中)。此外，疑似患有前列腺癌的受试对象还可以具有一个或多个风险因素。所述的术语涵盖了未经过针对前列腺癌的测试的个体，接受初步诊断(例如显示团块的CT扫描)但是未知其癌症的阶段的个体，以及其癌症的阶段和/或分级已经通过传统方法(例如Gleason得分)测定的个体。此外，所述的术语还包含以前经过针对前列腺癌的治疗(包含根治性前列腺切除术和短距离放射治疗)的患者。

如本文所用，术语“处于前列腺癌风险下的受试对象”是指具有发展成前列腺癌的一个或多个风险因素的受试对象。风险因素包含但不限于性别、年龄、遗传倾向性、以前的癌症事件和先前存在的非癌症疾病。

如本文所用，术语“诊断前列腺癌”或“检测前列腺癌”是指目的在于以下一种或多种的过程：测定受试对象是否受到前列腺癌的折磨；测定受试对象中前列腺癌的严重性或阶段；测定受试对象受到前列腺癌的折磨的风险；以及测定受到前列腺癌折磨的受试对象的预后。

如本文所用，术语“被诊断患有前列腺疾病的受试对象”是指经测试并发现患有前列腺疾病的受试对象。可以使用任何合适的方法来进行诊断，包含但不限于活组织检查、x射线、血液测试和本文所述的方法。

如本文所用，术语“提供预后”是指提供关于前列腺癌的存在(例如如本文所述的方法测定的)对受试对象未来健康的影响的信息。提供预后可以包含预测以下一种或多种：前列腺癌进程、由前列腺癌引起死亡的可能性、患者的平均寿命预期、患者将存活给定时间数量(例如6个月、1年、5年等)的可能性、在特定的延长时期内患者将是无病的可能性、患上前列腺癌的可能性、发展成侵略性前列腺癌的可能性、复发的可能性和转移的可能性。在某些实施方案中，本文所述的预后方法在临床上通过针对任何特定的患者来选择最合适的治疗方式而用于作出治疗决定。

如本文所用，术语“肌体样品”是指可以得自受试对象(例如人类)或得自受试对象的组成(例如组织)的样品。所述的样品可以为可检验本文所述的生物标志物的任何生物组织或流体。通常，所述的样品为“临床样品”，即，由患者衍生的样品。此类样品包含但不限于体液，例如尿、血液、血浆或血清；以及具有已知的诊断、治疗和/或结果史的归档样品。此外，术语生物样品还涵盖了通过处理生物样品而衍生的任何材料。肌体样品的处理可以涉及过滤、蒸馏、提取、浓缩、感染组分的灭活、加入试剂等的一种或多种。

如本文所用，术语“正常的”和“健康的”可交换使用。它们是指未显示任何前列腺癌症状以及未诊断患有前列腺癌的个体或多组个体。优选的是，正常的个体(或多组个体)未处于影响前列腺癌的药剂之下。在某些实施方案中，与已经由其获得待测试的样品的个体相比，正常的个体具有相似的性别、年龄和体重指数。此外，术语“正常的”在本文中还用于证明由健康个体分离得到的样品是合格的。

如本文所用，术语“对照”或“对照样品”是指由正常的(即，健康的)个体或正常的多组个体分离得到的一个或多个生物样品。此外，术语“对照”、“对照值”或“对照样品”还可以指由分类为正常的一个或多个个体和/或被诊断患有前列腺癌的一个或多个个体的样品衍生得到的数据的汇编。

如本文所用，当术语“表明前列腺癌”用于肌体样品中至少一种α-甲酰基-CoA消旋酶(AMACR)的量时，其是指被诊断为前列腺癌的水平或数量，由此发现该水平或数量在患有所述疾病的受试对象中通常明显高于未患有所述疾病或者患有另一个阶段的前列腺癌的受试对象(如使用常规的统计学方法测定，将置信水平设定为最小95％)。优选的是，在至少大约60％的患有所述疾病的受试对象中并且在低于大约10％的未患有所述疾病的受试对象中发现表明前列腺癌的水平或数量。更优选的是，在至少大约70％、至少大约75％、至少大约80％、至少大约85％、至少大约90％、至少大约95％或更高的患有所述疾病的受试对象中并且在低于大约10％、低于大约8％、低于大约5％、低于大约2.5％、低于大约1％的未患有所述疾病的受试对象中发现表明前列腺癌的水平或数量。

本文所述的实施方案涉及用于检测、鉴定、定量和/或测定肌体样品中α-甲酰基-CoA消旋酶(AMACR)水平的检测系统、体外检验和/或方法，以及用于诊断、鉴定、分期和/或监测在患有前列腺癌、疑似患有前列腺癌或处于前列腺癌风险下的受试对象中的前列腺癌的检测系统、体外检验和/或方法。

本文所述的检测系统和方法提供了使用肌体样品(例如通过非侵入式或最小侵入式手段而获得的体液)，简单地现场检验并早期检测前列腺癌的单用途且成本有效的一次性生物传感器，其将用于癌症筛查的复杂的临床程序减至最少。目前用于检测AMACR(经鉴定与前列腺癌的发生有关的一种蛋白质)的检验是无效的，这是由于对其化学检测的有限理解。在本文申请中，提供了可以使用电催化剂来增强可以筛选肌体样品(例如体液，包含血液、血清、血浆或尿样品)的电化学生物传感器的敏感性以用于检测、诊断、鉴定、分期和/或监测前列腺癌的检测和体外检验。

本文所述的检测系统和检验或方法包含：至少一种反应溶液，其可以用于生成可检测的和/或可定量的分析物，该分析物表明了在疑似患有前列腺癌或处于前列腺癌风险下的肌体样品中的AMACR的数量、浓度或水平；以及生物传感器，用于检测反应溶液中分析物的数量、水平或浓度。反应溶液的组分是基于需要AMACR以机械顺序参与的生物化学途径。反应溶液包含：(2R)-2-甲酰基-CoA差向异构体，其在体液中可以被AMACR手性转化成(2S)-2-甲酰基-CoA差向异构体；以及酶，其与所形成的(2S)-2-甲酰基-CoA差向异构体一起实施β-氧化，从而生成分析物过氧化氢(H₂O₂)。可以使用生物传感器来测量通过反应样品与肌体样品(由疑似患有前列腺癌或处于前列腺癌风险下的受试对象得到)中的AMACR之间的生物化学反应而生成的H₂O₂的数量、浓度或水平，从而测定体液中AMACR的数量、浓度或水平，并由此测定受试对象是否患有前列腺癌或者患前列腺癌的风险是否增加。

在一些实施方案中，至少一种反应溶液包含具有(R)和(S)差向异构体的支化脂肪酸，其中在所述的差向异构体中，仅(R)差向异构体可以形成AMACR的反应底物。所述的支化脂肪酸可以为例如包含(2R)-2-甲基羧酸差向异构体和(2S)-2-甲基羧酸差向异构体的支化脂肪酸。在一个实例中，所述的支化脂肪酸可以为降植烷酸。降植烷酸在其化学主链中具有4个特征性碳原子。在第二个位置(C-2)处的碳原子将产生以下述反应式中(2R)和(2S)所示的(R)-构造或(S-)构造差向异构体。

如上述反应式所示，(2R)和(2S)差向异构体可以与反应溶液中也可提供的适量的辅酶A(CoA)、ATP和Mg⁺²反应，从而分别形成(2R)-降植烷酰基-CoA和(2S)-降植烷酰基-CoA。(2R)-降植烷酰基-CoA不能实施β-氧化过程，从而产生H₂O₂。相反，如下所示，在酶ACOX₃(过氧化物酶体酰基-辅酶A氧化酶3)存在下，(2S)-降植烷酰基-CoA可以实施β-氧化过程，从而产生H₂O₂，其可以通过电化学来检测。

因此，可以使用能够定量测量所生成的H₂O₂的传感器来测量(2S)-降植烷酰基-CoA的量。

如下所示，在AMACR存在下(2R)-降植烷酰基-CoA将转化成(2S)-降植烷酰基-CoA，接着该(2S)-降植烷酰基-CoA在过氧化物酶体酰基-辅酶A氧化酶3(ACOX₃)存在下可以被氧化，从而产生更多的H₂O₂。

由于AMACR将(2R)-降植烷酰基-CoA转化成(2S)-降植烷酰基-CoA而产生的额外的H₂O₂可以被定量，并且与对照值或水平相比，从而测定肌体样品中AMACR的量。由疑似患有前列腺癌或者处于前列腺癌风险下的受试对象得到的肌体样品中AMACR的量可以直接影响(2S)-降植烷酰基-CoA的产生并由此影响H₂O₂的产生。因此，可以将所产生的H₂O₂的定量水平与对照或预定值比较，从而测定肌体样品中AMACR的水平，并测定受试对象是否患有前列腺癌。例如与反应溶液混合的肌体样品中H₂O₂的检测水平与对照值相比有所升高表明受试对象患有前列腺癌或者患前列腺癌的风险升高。

在一些实施方案中，与由受试对象得到的肌体样品混合的至少一种反应溶液可以包含降植烷酸溶液、三磷酸腺苷(ATP)、氯化镁、辅酶A(CoA)和过氧化物酶体酰基-辅酶A氧化酶3(ACOX3)。例如在制备反应溶液中，购自Sigma-Aldrich的降植烷酸溶液可以与磷酸缓冲生理盐水(PBS)混合，使得PBS与降植烷酸溶液之间的体积比为大约1:1。通过将磷酸一氢钠和磷酸二氢钠与去离子水混合可以制备pH为6.5的PBS溶液，并且可以加入200mM氯化钾作为支持电解质，以改善缓冲剂的传导性。此外，还可以将3mgATP、3mg CoA和3mg氯化镁加入到PBS/降植烷酸混合物中。然后，可以将5μl该溶液与1μl ACOX3结合，从而形成反应溶液。有利地，反应溶液不包含任何试剂或副产物，该试剂或副产物可能会潜在地有助于生物传感器的背景氧化电流并损害对所生成的H₂O₂的检测和定量。

可以将如此形成的反应溶液与由受试对象得到的肌体样品(例如体液，例如血液、血清、血浆或尿)混合。在一些方面中，由受试对象取得的血液的数量为大约0.1ml或更多，并且加入到大约6μl反应溶液中的数量可以为大约1μl或更少。在一些实施方案中，肌体样品为由受试对象的全血样品得到的血浆。可以使用公知的方法(例如离心)由全血分离血浆。

可以使用用于以侵入式(即，由受试对象直接得到)或非侵入式方式获得液体和/或固体肌体样品的取样装置(例如注射器、拭子或其他取样装置)由受试对象得到肌体样品。接着，可以将这些样品储存在储存容器中。用于容纳收集的样品的储存容器可以包含非表面反应性材料，例如聚丙烯。储存容器通常不是由未经处理的玻璃或其他样品反应性材料制得的，从而防止样品被玻璃容器的表面吸收或吸附。

储存在容器中的收集的样品可以储存在冷藏温度下。为了储存更长时间，可以将收集的样品冷冻，从而防止分解并有利于储存。例如可以将由受试对象得到的样品储存在离心管中，并冷却至大约-80℃的温度。

通过将包含AMACR的肌体样品与反应溶液混合而生成的H₂O₂为电化学活性物质，其可以在合适的条件下被氧化或还原，并可以使用H₂O₂生物传感器检测，以定量生物样品中AMACR的水平并测定受试对象是否患有前列腺癌或处于前列腺癌的风险之下。在一些实施方案中，H₂O₂生物传感器可以包含2个或3个电极电化生物传感器。生物传感器可以由已经建立的微细加工技术来制造，包含厚膜丝网印刷、喷墨印刷或激光蚀刻工艺。此类加工工艺还可以使用这些工艺和任何其他制造技术结合。有利地，可以使用厚膜丝网印刷来生产H₂O₂生物传感器。厚膜丝网印刷提供了可以将任何电极清洁、灭菌和电极污染问题降至最低的、成本有效且单用途的一次性生物传感器。

图1示出了根据一个应用实施方案的H₂O₂生物传感器10。生物传感器10为包含反电极12、工作电极14和参照电极16的3电极传感器，它们暴露于生物传感器10的检测区域20中的反应溶液中。电压电源22与工作电极14和参照电极16连接，从而在将反应溶液和生物样品的混合物加入到生物传感器10的检测区域20中时，测量由H₂O₂的氧化还原反应所生成的电流。

工作电极14位于H₂O₂的氧化还原反应的位点处，并且在此处发生电荷转移。反电极12的功能是使电路完整，从而使电荷流过传感器10。工作电极14和反电极12优选由相同的材料形成，但是这不是必须的。可以用于工作电极14和反电极12的材料的实例包含但不限于金、铂、钯、银和碳。

可以用于形成参照电极16的材料的实例为银-氯化银以及汞-氯化汞(甘汞)。银-氯化银是优选的。可以将银以银墨(其是市售可得的)的形式施加在基材上，或者可以使用精细分散的金属颗粒、溶剂和粘结剂制成。各个银接触垫30、32和34分别与各电极12、14和16连接。绝缘层40可以覆盖电极12、14和16的一部分，使电极12、14和16的顶端暴露于检测区域20的检测环境中。

在一些实施方案中，工作电极14和反电极12可以包含一层颗粒，例如活性碳或多孔碳的微小、中等或纳米尺寸的颗粒。活性碳纳米颗粒可以与金属催化剂颗粒结合，其中所述的金属催化剂颗粒可以增加与H₂O₂的电化学氧化-还原反应的速率，并且可以在比不存在催化剂颗粒的更低的氧化电势下提供对H₂O₂的检测。就实际用途而言，金属催化剂颗粒可以缩短反应时间，并降低用于检测反应溶液与生物样品的混合物中的H₂O₂的应用电化学电势。降低应用电势通常使所呈现的其他物质的电化学氧化或还原最低，从而使由混杂物质的多余反应所导致的干扰最低。结果，可以获得并产生高度特异性的生物传感器。

金属催化剂颗粒可以包含一元金属(M)、二元金属(M-X)、一元金属氧化物(MOy)、二元金属氧化物(MOy-XOy)、金属-金属氧化物复合材料(M-MOy)或它们的组合的纳米、中等或微小规模的颗粒，其中y小于3，并且M和X独立地选自Li,Na,Mg,Al,K,Ca,Cr,Mn,Fe,Co,Ni,Cu,Zn,Ga,Sr,Y,Zr,Nb,Mo,Ru,Rh,Pd,Ag,Cd,In,Sn,Ba,La,Ce,Pr,Nd,Sm,Eu,Gd,Tb,Dy,Ho,Er,Tm,Lu,Ta,W,Os,Ir,Pt,Au和Pb。在一个实施方案中，所述的金属催化剂颗粒可以由一元金属、一元金属氧化物、二元金属或二元金属氧化物组成，例如铱、氧化铱、铂、钌、铂-钌、铂-镍、以及铂-金。

在一个实例中，工作电极14和反电极12可以由活性碳制成，并且包含大约2重量％至大约5重量％的氧化铱纳米颗粒。将大约2重量％至大约5重量％的氧化铱纳米颗粒引入到工作电极和反电极中可以将反应溶液与生物制品的混合物中的H₂O₂的氧化电势降低至0.25伏，并且将标准的Ag/AgCl参照电极由大约0.40伏升高至大约0.45伏。在这种较低的电势下，可以将反应溶液与生物制品的混合物中的其他生物物质的氧化降至最低。

可以在基材100上制造图1和2所示的生物传感器，其中所述的基材100由聚酯、其他非导电材料(其他聚合材料、氧化铝(Al₂O₃)、陶瓷基材料、玻璃))、半导体基材(例如硅、二氧化硅形成)和其他被覆盖的基材形成。因此，可以在共同的基材100上形成多个传感器装置102(图2)。如所理解的那样，可以考虑电极的几何形状和尺寸的变体。

可以使用特别用于将多个电极沉积在基材上的薄膜、厚膜和/或喷墨印刷技术来制得生物传感器。薄膜工艺可以包含物理或化学蒸汽沉积。电化学传感器和用于制造它们的厚膜技术在C.C.Liu et al.的美国专利No.4,571,292、C.C.Liu的美国专利No.4,655,880、以及同时待审的美国申请系列No.09/466,865中有所讨论，这些文献以引用方式全部并入本文。例如在碳电极的情况下，将活性碳与粘结剂混合，像油墨那样沉积在基材上，并使其干燥。

根据生物传感器10的设计，电压电源可以将电压电势施加到工作电极14和参照电极16和/或反电极12。可以使用测量装置或测量仪来测量工作电极14和反电极16之间的电流。此类电流是由于H₂O₂在工作电极12处发生的还原而产生的，其中所述的H₂O₂是通过在与反应溶液混合和/或结合的肌体样品中的AMACR而生成的。

所测量的电流的数量或水平与所生成的H₂O₂的数量、肌体样品中AMACR的水平或数量、以及受试对象中前列腺癌的风险或存在成比例。一旦测定由肌体样品生成的电流水平(使用生物传感器测试)，便可以将该水平与预定值或对照值相比较，从而提供用于诊断或监测受试对象中前列腺癌的信息。例如可以将电流水平与预定值或对照值相比较，从而测定受试对象是否受到前列腺癌的折磨或是否患有前列腺癌。与预定值或对照值相比，电流水平升高可以表明受试对象患有前列腺癌；然而电流水平与预定值或对照值相似或降低可以表明受试对象未患有前列腺癌。

可以将由得自受试对象的肌体样品而生成的电流水平与事先(例如在给予治疗之前)由受试对象得到的肌体样品的电流水平相比较。因此，本文所述的方法可以通过比较治疗方案之前和治疗方案之后得到的电流水平而用于测量治疗方案用于治疗受试对象的前列腺癌的功效。此外，本文所述的方法可以通过比较经过给定时间段(例如天、周、月或年)而获得的肌体样品中的电流水平而用于测量受试对象的前列腺癌的进展。

此外，还可以将由受试对象的体液生成的电流水平与预定值或对照值相比较，从而提供用于测定受试对象中前列腺癌的严重性或侵略性的信息。因此，在一些方面中，可以使用公知的临床分类或与前列腺癌有关的组织病理学阶段(例如前列腺癌或者惰性与侵略性前列腺癌的Gleason得分)将电流水平与由受试对象得到的对照值相比较。在一个具体的实施方案中，样品中的电流可以提供用于测定受试对象中前列腺癌的具体Gleason分级或得分的信息。

预定值或对照值可以基于由健康或正常受试对象或者一般人群得到的、或者由所选的对照受试对象人群得到的可比较样品中的电流水平。在一些方面中，所选的对照受试对象人群可以包含被诊断患有前列腺癌的个体。例如比对照值具有更大的电流水平的受试对象可以表明受试对象患有更晚期的前列腺癌。

此外，所选的对照受试对象人群还可以包含受到前列腺癌折磨的受试对象，以便区分受到前列腺癌折磨的受试对象与患有良性前列腺疾病的那些受试对象。在一些方面中，所选的对照受试对象人群可以包含一组受到前列腺癌折磨的个体。

预定值可以采取多种形式。预定值可以为单一的端值，例如中值或平均值。预定值可以基于比较组(例如其中在一个定义组中的电流水平是另一个定义组中的电流水平的2倍)来建立。预定值可以为一个范围，例如总的受试对象人群平分(或者不相等地)成多个组，或者分成4组，最小的四分之一组为具有最低电流水平的受试对象，最大的四分之一组为具有最大电流水平的个体。在示例性实施方案中，选择2个端值，从而使假阳性结果和假阴性结果的比率最小。

以下实施例说明了本发明的实施方案，并且不以任何方式限定说明书和权利要求书。

实施例1

在本实施例中，我们呈现了用于检测人类血清样品中AMACR的生物传感器的研发结果。我们测试了能够鉴定患有前列腺癌的患者的生物传感器。我们发现使用这种生物传感器以及由24名男子得到的血浆样品，我们能够以100％的准确率区分健康男子、患有高分级前列腺上皮内瘤和患有活组织检查证明前列腺癌的男子。

方法

检测AMACR的化学作用和反应机制

降植烷酸具有4个甲基。根据上文所述的反应方案，降植烷酸可以用作反应底物，其由命名为(2R)和(2S)的2个差向异构体。(2R)和(2S)差向异构体可以在极长链脂肪酸辅酶A(VLCFA-CoA)合成酶存在下与适量的辅酶A(CoA)、ATP和Mg发生反应，其中所述的极长链脂肪酸辅酶A分别形成(2R)-降植烷酰基-CoA和(2S)-降植烷酰基-CoA。但是，(2R)-降植烷酰基-CoA不能实施β-氧化工艺。另一方面，(2S)-降植烷酰基-CoA在酶ACOX3(过氧化物酶体酰基-辅酶A氧化酶3)存在下可以实施β-氧化工艺，从而产生H₂O₂。H₂O₂可以被电化学氧化，从而产生随后可以被定量的电流。(2S)-降植烷酰基-CoAAMACR将(2R)-降植烷酰基-CoA转化成(2S)-降植烷酰基-CoA，从而得到较高水平的H₂O₂，并且H₂O₂的氧化电流随后可以用于定量AMACR存在的量。

AMACR生物传感器的制造

该生物传感器经厚膜印刷在维度为385x280mm²的0.18mm厚的聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)基材(Melinex 329,DuPont Co.)上。该厚膜工艺的成本相对较低，并且以6排/张基材而产生150个单个的生物传感器。生物传感器具有3电极构造：工作电极、反电极和参照电极。使用包含于活性碳粉末(RC72)中的铱(实际上为IrO)纳米颗粒印刷工作电极和反电极，所述的粉末被混合至厚膜印刷油墨中。此外，参照电极还为使用了DuPont#5870Ag/AgCl厚膜油墨的厚膜印刷Ag/AgCl电极。绝缘层是使用NazdarAPL 34无硅介电油墨(其还定义了单个生物传感器的维度)的厚膜印刷的。工作电极为大约0.8mm²并且直径为1.0mm。生物传感器能容纳10-20微升测试体积。除了IrO纳米催化剂以外，已经测试并评价了其他电催化剂。

必须承认这种生物传感器原型是通过厚膜印刷技术而制造的，制造成本相对较低，从而实现其成为单用途的一次性生物传感器。但是，厚膜印刷技术的内在精度限制为10％。因此，该限制必须包含在传感器测量的考虑范围内。

图1和2示意性示出了生物传感器的原型，其是在我们试验室内研发的。该生物传感器可以使用厚膜丝网印刷技术而成本有效地制造的。该生物传感器引入了纳米颗粒催化剂(氧化铱)，从而降低了H₂O₂的氧化电化学电势，并使实际生理流体样品中的其他化学物质的氧化最低。这为生物传感器提供了额外的敏感性和选择性。使用这种独特的H₂O₂生物传感器以及上述反应方案中所示的AMACR检验方法，我们能够建立血清样品中AMACR的体外检验，以用于有效地检测和诊断前列腺癌。

这种AMACR生物传感器的校准

过氧化氢H₂O₂为电化学活性物质，其在合适的条件下能够被氧化或还原。通常，在大约+0.40至0.45伏与Ag/AgCl参照电极下，H₂O₂可以被氧化，从而产生相当于所存在的H₂O₂的量的氧化电流。在引入IrO纳米催化剂的条件下，H₂O₂氧化的超电势变低，并且在0.25V与Ag/AgCl参照下，PBS中的H₂O₂随后被氧化。这代表了该生物传感器传感元件的优点和独特性。图4示出了将生物传感器的氧化电流与H₂O₂的浓度相关联的生物传感器的校准曲线。使用所涉及的化学物质，例如降植烷酸、PBS、Mg⁺²、CoA、ATP、ACOX3和AMACR，施加给所产生的H₂O₂的氧化电势为+0.4V与Ag/AgCl参照。在这些化学物质存在下，该值保持比H₂O₂的氧化电势更低，为+0.6V与Ag/AgCl参照电极。该评估可以通过循环伏安法研究而凭经验来证明。

如果所述的反应中所涉及的所有化学物质都不会有助于所产生的H₂O₂的任何氧化电流，则上文所示的这种方法和反应方案仅适用于AMACR检测。这可以通过实施所涉及的化学物质的循环伏安法研究来证明。图3示出了循环伏安法研究，其表明所使用的化学物质不会有助于由上文所示的反应方案所产生的过氧化氢的氧化电流。

图3A示出了在磷酸缓冲生理盐水(PBS)中由AMACR底物(降植烷酸)得到的背景电化学信号，证明底物本身不会有助于任何背景电流。相似地，酶AMACR不会有助于背景电流。图3B示出不存在由于PBS介质中的AMACR(0.0065μg/μl)所导致的可检测的背景电流。通过图1所示的降植烷酸的代谢β-氧化途径，在不具有ACOX3(即，在不具有ACOX3下，不能形成电化学可检测的H₂O₂)下不能氧化(2S)-降植烷酰基-CoA。这在图3C中可以证明，其中示出了在降植烷酸、降植烷酸+ACOX3、和降植烷酸+ACOX3+AMACR存在下，由生物传感器检测的氧化电流的试验结果。由于加入AMACR而使得检测的氧化电流的增加对于降植烷酰基-CoA(不具有其他分子的干扰)是特定的且独特的。在图3C中，(2R)-降植烷酰基-CoA通过AMACR而转化成(2S)-降植烷酰基-CoA的结果是产生更高的电流，这是明显的。这些结果表明AMACR的电化学检测是定量的且选择性的。

该反应需要温育时期以产生H₂O₂。使用并评估多个温育时间。我们选择48小时作为温育时间，并且该时间长度可以被进一步优化。

人类血浆样品中的测试

血浆样品得自University Hospitals Case Medical Center的24名患者。这些样品包含9名健康志愿者，10名组织学证明患有HGPIN的男子和5名被新诊断为前列腺癌的男子。由各患者收集5mL血液于标准的肝素化管中。通过标准的方案分离血浆，并冷冻至进一步使用。所有的样品都是在相关的治疗前收集的。

为了定量AMACR，首先将样品解冻，并制得5μl等分。将降植烷酸(#P6617Sigma-Aldrich)与磷酸缓冲溶液(PBS)以1:1的容积比混合。通过将适量的磷酸一氢钠和磷酸二氢钠与去离子水混合来制备pH值为6.5的PBS溶液。将200mM氯化钾作为支持电解质加入到PBS中，从而改善缓冲溶液的传导性。将3mg三磷酸腺苷ATP(#A1852Sigma-Aldrich)、3mg氯化镁(#208337Sigma-Aldrich)、和3mg辅酶A(CoA)(#C3144Sigma-Aldrich)加入至总量为140μl降植烷酸-PBS混合溶液中。在任何测试中，将该溶液在使用前在-20℃下温育72小时。

用于电流测量的应用电势设定为+0.4V与Ag/AgCl参照。将5μl制备的降植烷酸-PBS溶液首先与1μl过氧化物酶体酰基-辅酶A氧化酶3(ACOX3)(#H00008310-Q01Sigma-Aldrich)混合，然后与1μl人类血清样品混合。将该混合物在室温下温育1小时。然后解冻5μl上述混合物，并放置在生物传感器的表面上，并测量氧化电流。所有样品都运行3个重复。试验室工作人员对于样品的疾病状态是盲态的。

计算各样品的3个重复运行的平均值，从而表明样品中AMACR的估计量。使用通过数据测定的端值来计算敏感性和特异性。

结果

为了测试这种AMACR生物传感器的试剂应用，测量人类生物样本中AMACR的水平。我们预计AMACR的水平在前列腺癌患者中增加。为了评价上述估计，在样品中AMACR水平的试验室盲态测试中，使用由9名健康男子、10名患有高分级前列腺肿瘤(HGPIN)的男子和5名患有前列腺癌的男子得到的血浆样品。由各患者收集5mL血液于标准的肝素化管中。通过标准的方案分离血浆，并冷冻至进一步使用。所有的样品都是在相关的治疗前收集的。

表1示出了这些患者的特征和平均AMACR水平。为了定量AMACR，首先将样品解冻，并制得5μl等分。将降植烷酸(#P6617Sigma-Aldrich)与磷酸缓冲溶液(PBS)以1:1的容积比混合。通过将适量的磷酸一氢钠和磷酸二氢钠与去离子水混合来制备pH值为6.5的PBS溶液。将200mM氯化钾作为支持电解质加入到PBS中，从而改善缓冲溶液的传导性。将3mg三磷酸腺苷ATP(#A1852Sigma-Aldrich)、3mg氯化镁(#208337Sigma-Aldrich)、和3mg辅酶A(CoA)(#C3144Sigma-Aldrich)加入至总量为140μl降植烷酸-PBS混合溶液中。在任何测试中，将该溶液在使用前在-20℃下温育72小时。

表1：患者组的人群描述以及平均AMACR水平

用于电流测量的应用电势设定为+0.4V与Ag/AgCl参照。将5μl制备的降植烷酸-PBS溶液首先与1μl过氧化物酶体酰基-辅酶A氧化酶3(ACOX3)(#H00008310-Q01Sigma-Aldrich)混合，然后与1μl人类血清样品混合。将该混合物在室温(～21℃)下温育1小时。然后解冻5μl上述混合物，并放置在生物传感器的表面上，并测量氧化电流。所有样品都运行3个重复。试验室工作人员对于样品的疾病状态是盲态的。

计算各样品的3个重复运行的平均值，从而表明样品中AMACR的估计量。使用通过数据测定的端值来计算敏感性和特异性。

图4示出了通过我们的生物传感器对各样品测量的AMACR水平。如图4A和4B所示，使用在任何情况下为0.08至0.90的电流水平端值为将前列腺癌与其他患者分开提供100％的敏感性和100％的特异性。因此，在我们的初步数据中，测试的准确率为100％。

重要的是，所述的检测方法不仅将前列腺癌患者与健康男子清楚地区分开，而且还与患有HGPIN(其为其他前列腺癌生物标志物的共同限制)的男子区分开。该检测方法的电流输出对于前列腺癌患者而言要比健康或HGPIN男性的数量级更高。生物传感器的电流输出的这种大差异在将前列腺癌患者与正常和良性个体的区分中提供准确率。因此，所述的发现到目前为止证明了使用这种相对简单且侵入程度最低(无需活组织检查)的方法来检测AMACR水平是极为准确的。

通过本发明的上述描述，本领域的那些技术人员将意识到改进、改变和修改。本领域技术范围内的这些改进、改变和修改将被所附的权利要求书所涵盖。在本申请中的所有参考文献、出版物和专利均以引用方式全文并入本文。

用于检测α-甲酰基-CoA消旋酶(AMACR)和前列腺癌的系统和方法专利购买费用说明