专利摘要

本发明涉及一种海藻糖合酶及其编码基因与应用。海藻糖合酶的表达基因，核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；海藻糖合酶，氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。本发明首次由施氏假单胞菌(PseudomonasstutzeriQlu3)中获得海藻糖合酶，该海藻糖合酶制备方法简便，产量大，纯度高；实验证实其热稳定性好，反应1h海藻糖转化率即可达到70％，较现有的海藻糖合酶反应时间大大缩短，可以降低海藻糖的生产成本，为海藻糖的工业化生产奠定了基础。

权利要求

1.一种海藻糖合酶的表达基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种海藻糖合酶，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种插入权利要求1中SEQ ID No.1所示核苷酸序列的重组载体。

4.一种转基因细胞系，含有权利要求3所述的重组载体。

5.权利要求1所述海藻糖合酶的表达基因、权利要求3所述重组载体或权利要求4所述转基因细胞系在制备海藻糖合酶中的应用。

6.权利要求2所述海藻糖合酶在制备海藻糖中的应用。

说明书

技术领域

本发明涉及一种海藻糖合酶及其编码基因与应用，属于生物技术领域。

背景技术

海藻糖(Trehalose)是一种由两个吡喃环葡萄糖分子经α-1,1-糖苷键连接构成的非还原性二糖，广泛存在于细菌、酵母、丝状真菌、植物、昆虫、无脊椎动物等生物体体内。研究表明，其性质稳定，对生物体具有非常重要的生物学意义。主要表现在它是生物体能源和碳源的储备物，是蛋白质和生物膜分子在脱水、高温、氧自由基、低温等恶劣环境中的稳定剂和保护剂，是信号传感复合物和生长调控因子，而且还是某些细菌细胞壁的组分之一，因此在科学界海藻糖有“生命之糖”的美誉。海藻糖对生物体具有神奇的保护作用，是因为海藻糖在高温、高寒、高渗透压及干燥失水等恶劣环境条件下在细胞表面能形成独特的保护膜，有效地保护蛋白质分子不变性失活，从而维持生命体的生命过程和生物特征。这一独特的功能特性，使得海藻糖除了可以作为蛋白质药物、酶、疫苗和其他生物制品的优良活性保护剂以外，还是保持细胞活性、保湿类化妆品的重要成分，更可作为防止食品劣化、保持食品新鲜风味、提升食品品质的独特食品配料。因此海藻糖可广泛的应用到医药、化妆品业以及食品行业，具有诱人的开发应用前景和巨大的经济效益。

鉴于海藻糖广泛而重要的应用价值，寻找海藻糖高效方便、低成本生产方法的研究被广泛重视。目前海藻糖的生产方法主要有酵母提取法、发酵法、酶合成法。其中酶法生产海藻糖具有较高的特异性和快速温和等特点，已经成为研发海藻糖工业化生产的热点并作为短期可见效的可行性途径之一。

海藻糖合酶(EC5.4.99.16,Trehalose synthase,TreS)是一种分子内葡糖苷转移酶它只需要一步反应就可以将麦芽糖的α-1,4糖苷键转化为α-1,1糖苷键生成海藻糖。该酶反应流程短，易调控，不需要消耗高能物质，不需要磷酸盐共存，只需要一种酶一步反应就能获得海藻糖，因此海藻糖合酶转化法是适宜工业化生产海藻糖的方法，有着良好的应用前景，受到广泛的关注。到目前为止，国内外有报道的能够产海藻糖合酶的微生物已经超过15种。不同微生物来源的海藻糖合酶的催化效率、酶学性质各有不同，但具有基本共同点：一是底物转化率较低，最高只有80％左右，一般为60％-70％；二是酶的热稳定性较差，最适反应温度为25℃左右；三是反应时间太长，一般为48小时，有的长达72h。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种热稳定性好，反应时间大大缩短的来源于施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri Qlu3)的海藻糖合酶及其表达基因与应用。

本发明技术方案如下：

一种海藻糖合酶的表达基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

一种海藻糖合酶，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明所述海藻糖合酶是通过大肠杆菌原核高效表达后，利用亲和层析，离子交换层析，分子筛层析等一系列纯化手段，最终获得。该海藻糖合酶与文献报道的施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri CJ38)海藻糖合酶氨基酸序列同源性为98％，但是其反应时间大大缩短而且热稳定性良好。上述重组蛋白反应1h即可达到反应平衡点，海藻糖转化率为70％。上述重组蛋白在50℃金属浴中放置30min海藻糖转化率依然可以达到50％。上述重组蛋白最适反应温度为35℃。上述重组蛋白最适反应pH为8.0。

一种插入上述SEQ ID No.1所示核苷酸序列的重组载体。

一种转基因细胞系，含有上述重组载体。

上述海藻糖合酶的表达基因、重组载体或转基因细胞系在制备海藻糖合酶中的应用。

上述海藻糖合酶在制备海藻糖中的应用。

本发明所述的海藻糖合酶，由施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri Qlu3)中获得，具体方法为：利用简并引物从施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri Qlu3)基因组中扩增获得海藻糖合酶的全长基因。将该基因连接到pET-15b载体上构建成质粒，并转化到大肠杆菌BL21DE(3)中进行原核表达。然后通过镍柱亲和层析，Source-Q离子交换层析，Superdex-200分子筛层析的方法分离获得高纯度的海藻糖合酶。

有益效果

本发明首次由施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri Qlu3)中获得海藻糖合酶，该海藻糖合酶制备方法简便，产量大，纯度高；实验证实其热稳定性好，反应1h海藻糖转化率即可达到70％，较现有的海藻糖合酶反应时间大大缩短，可以降低海藻糖的生产成本，为海藻糖的工业化生产奠定了基础。

附图说明

图1是PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳结果照片；

图中：M、Marker，T为海藻糖合酶的目的条带。

图2为分子筛纯化后海藻糖合酶SDS-PAGE电泳图结果照片；

图中：M为Marker；B11，B12，C1，C2，C3，C4，C5，C6，C7为分子筛纯化后不同收集管收集到的样品；

图3为通过高效液相测定的葡萄糖、麦芽糖和海藻糖的标样峰状结果图；

图4为通过高效液相测定反应结束后葡萄糖、海藻糖和麦芽糖的峰状结果图；

图5为纯化后海藻糖合酶反应时间对转化率影响的曲线图；

图6为文章报道的海藻糖合酶反应时间对转化率影响的曲线图；

图7为纯化后海藻糖合酶酶活最适反应温度曲线及酶活温度稳定曲线图；

其中，图7A为纯化后海藻糖合酶酶活的最适反应温度曲线；

图7B为纯化后海藻糖合酶酶活温度稳定曲线；

图8为纯化后海藻糖合酶最适反应pH曲线及pH稳定曲线图；

其中，图8A为纯化后海藻糖合酶酶活最适反应pH曲线；

图8B为纯化后海藻糖合酶酶活pH稳定曲线。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。

实施例1：克隆得到施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri Qlu3)海藻糖合酶基因

依据NCBI上公开的施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)海藻糖合酶全长核苷酸序列设计简并引物，引物序列如下：

上游引物：5’-atc gga tcc atg agc ahn cca gac aah anc tat atc-3’；

下游引物：5’-tca ctc gag tta ran cac cgg hgr-3’；

以施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri Qlu3)的基因组为模板，利用上述引物进行PCR扩增，PCR反应体系如下：

上述PCR反应按照如下程序进行：

95℃预变性5min；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸4min，28个循环；72℃终延伸10min。

PCR结束后通过1％的琼脂糖凝胶电泳分析片段长短，根据片段大小切下目的条带，使用博大泰克的DNA纯化试剂盒进行回收切胶产物。

实施例2：将海藻糖合酶基因转化到表达宿主中，获得阳性表达菌株。

PCR产物及质粒载体的双酶切反应

PCR产物的酶切体系：

反应条件：37℃反应2～3h。

质粒载体的酶切体系：

反应条件：37℃反应6～8h。

PCR产物和载体双酶切后的产物经1％琼脂糖凝胶电泳，并使用DNA凝胶回收试剂盒进行纯化回收。

连接反应体系：

充分混匀后离心数秒，将管壁液滴收到管底，16℃连接过夜，制得连接产物。

重组质粒的转化

(1)感受态细胞的制备

①挑取BL21单菌落(或挑取保存菌种)接种至10ml液体LB培养基中，37℃，210rpm过夜培养；

②取5ml菌液接种于500ml LB培养基中，37℃，210rpm，摇70～80min至OD₆₀₀达到0.375；

③将菌液放置于冰水混合物上10min，同时预冷50ml离心管；

④将菌液转移到离心管中，4℃，3700rpm，10min收集菌体，弃上清；

⑤每个离心管中加入大约10ml冰预冷的激活缓冲液(0.1M CaCl₂)，用灭过菌的5ml枪尖打散沉淀，然后再向每个管中加大约30ml冰预冷的激活缓冲液，颠倒混匀，冰上静置20min；

⑥4℃，3700rpm，离心10min；弃上清，将残液倒净，按500ml菌液12ml冰预冷储存buffer(0.1M CaCl₂，15％甘油)的量，将沉淀打散，(分次转移，然后吹吸打散)。

⑦将感受态分装到冰预冷的灭菌EP中，每管100微升，置于冰上(准备一盆冰水混合物)。

⑧感受态-80℃冻存，制得感受态细胞。

注意：整个过程尽量让细胞处于低温，所用的枪尖，离心管，EP管和buffer等均要灭菌，整个过程都在超净台里操作，感受态细胞做完后要test其效率和是否染菌。

(2)连接产物转化

①将15μL连接产物加入100μL新鲜制备的感受态细胞BL21DE(3)中，轻轻混匀，冰浴30min。

②42℃热激90s，然后迅速置于冰浴中冷却3min。

③加入200μL LB培养基，37℃，180rpm/min振荡培养60min，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因；

④取上述菌液200μL，涂布于带有抗性的LB固体培养基(氨苄青霉素100mg/L)。

⑤待菌液被吸干后，倒置平板于37℃培养12～16h。

阳性克隆的鉴定

(1)菌落PCR鉴定

挑取单菌落，37℃振荡培养6～8h，吸取1μL菌液，按照15μLPCR反应体系，进行PCR鉴定。若为阳性克隆，通过琼脂糖凝胶电泳可检测到一条目的条带。

(2)蛋白表达及可溶性鉴定

将菌落PCR鉴定剩余菌液中加入终浓度为0.6mM的IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)，诱导表达1h，12000rpm/min，离心1min，弃上清，收集菌体。加入2倍上样缓冲液(购自上海生工蛋白上样缓冲液)，用枪尖悬起沉淀，90℃变性10min。若为阳性克隆，通过SDS-PAGE可检测到有蛋白表达。

(3)DNA测序

将用以上两种方法鉴定后的阳性克隆，经测序测序，得到的阳性克隆中所插入的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

实施例3：发酵培养阳性表达菌株，分离纯化海藻糖合酶重组蛋白

种子培养：以常规方法挑取阳性克隆置于5mL的含有100mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基中，在37℃振荡培养5-6h；

菌体扩大培养：将种子接入1L含有100mg/L氨苄青霉素的液体培养基中，37℃振荡培养至菌浓OD600为1.0时，降温至15℃；1小时后加入终浓度为0.6mM的IPTG，过夜诱导表达。

收集菌体：4200rpm，4℃离心15min，弃去上清，收获菌体；加入重悬溶液(25mM Tris-HCl,pH8.0，100mM NaCl)，振荡沉淀菌体细胞；加入蛋白酶抑制剂PMSF(Phenylmethyl sulfonyl fluoride，苯甲酸磺酰氟)至终浓度为2mM。

超声破碎菌体细胞：超声3s，间隔6s，400W，工作60次。

超速离心：超声之后的细胞破碎液在14000rpm，4℃条件下离心45min，收集上清液，进行下一步的分离纯化。

Ni-NTA亲和层析：将收集的含有可溶性蛋白的上清液体倒入再生好的Ni-NTA柱中；上清液流净后，以wash buffer(25mM Tris-HCl，pH8.0，100mMNaCl，15mM咪唑)冲洗10个柱体积，除去非特异性吸附的蛋白；最后使用elution buffer(25mM Tris-HCl，pH8.0，100mM NaCl，250mM咪唑)将目的蛋白洗脱下来，用干净预冷烧杯收集；使用SDS-PAGE电泳检测蛋白是否可溶，可溶的蛋白是否能够与Ni-NTA结合，是否能够被洗脱下来，及蛋白的浓度。

阴离子交换层析纯化(Source-Q)：将Ni-NTA亲和层析系脱下的可溶性蛋白用溶液A(25mM Tris-HCl,pH8.0)稀释3～4倍，然后上样到已使用溶液A平衡好的离子交换柱SourceQ上，使用溶液A与溶液B(25mM Tris-HCl，pH8.0，1M NaCl)进行线性梯度洗脱。观察280nm的吸光值(A280)变化情况，收集各个出峰位置附近的收集管，并进行SDS-PAGE电泳，以便得到目的蛋白质。

分子筛纯化：根据离子交换柱蛋白质峰的形状，有无“肩膀”及是否对称、尖锐来判断蛋白质在离子交换柱上的性状。对于性状好的蛋白质进行超滤浓缩至2mL，上样到已经用溶液C(25mM Tris-HCl，pH8.0，100mM NaCl)平衡好的凝胶过滤层析柱Superdex-200上，流速为0.4mL/min。收集蛋白峰并进行SDS-PAGE电泳，检测蛋白质的纯度及性状。经测序，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

实施例4：海藻糖合酶酶活测定方法

在反应体系中加入20％麦芽糖，20mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲溶液pH7.0，1μM施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri Qlu3)海藻糖合酶，在37℃下反应2h。通过高压液相的方法测定海藻糖的转化率，测定过程中采用氨基柱；柱温为40℃流动相采用乙腈与水的混合溶液，二者体积比为3:1；流速为1mL/min；检测器为示差检测器；检测时间为25min。标准品检测结果见图(3)按照如下公式计算转化率：

根据高效液相结果(如图4)中麦芽糖峰面积，海藻糖峰面积及葡萄糖峰面积利用软件拟合得到曲线，计算三者的质量，其中m3为转化为海藻糖的质量，m2为转化为葡萄糖的质量，m1为剩余麦芽糖的质量。

实施例5：海藻糖合酶重组蛋白生化性质测定

最适反应温度的测定：

将酶液稀释合适的倍数后，于20℃，25℃，30℃，35℃，40℃，45℃，50℃，55℃，60℃中反应2h，利用高压液相的方法测定海藻糖的转化率。结果如图7A所示。海藻糖合酶重组蛋白的最适反应温度为35℃。

温度稳定性的测定：

将酶液稀释一定的倍数后，于20℃，25℃，30℃，35℃，40℃，45℃，50℃,55℃，60℃中保温30min，测定海藻糖转化率。结果如图4所示。海藻糖合酶在50℃金属浴中放置30min依然保持64％酶活。

最适反应pH值的测定：

用pH5.0,5.5,6.0,6.5,7.0,7.5,8.0,8.5,9.0,9.5,10,0.10.5,11.0。一系列的磷酸盐缓冲液稀释重组海藻糖合酶。然后加入20％麦芽糖置于37℃反应2h，测定酶活。结果如图8A所示。海藻糖合酶的最适反应pH为8.0。

pH稳定性的测定：

将酶液用用pH5.0,5.5,6.0,6.5,7.0,7.5,8.0,8.5,9.0,9.5,10,0.10.5,11.0稀释一定倍数后，37℃中，水浴30min后，加入20％麦芽糖置于37℃反应2h，测定酶活。结果如图8B所示。海藻糖合酶在pH7.0-9.0酶活稳定。

实施例6：海藻糖合酶最佳反应时间测定

根据文献(Cloning and expression of a trehalose synthase from Pseudomonas stutzeri CJ38in Escherichia coli for the production of trehalose)所报道的条件进行检测，反应体系为20wt％的麦芽糖，20mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄，pH7.2，1μM海藻糖合酶重组蛋白，在37℃下反应，在5min，20min，40min，1h，2h，3h不同时间进行取样，然后使用HPLC进行检测，检测方法见实施例4。通过计算得到转化率。结果表明，反应进行1h反应达到平衡，转化率即可达到70％(如图5所示)。而文献报道的同源蛋白在相同条件下反应进行19h达到平衡(见图6)。

对比例

根据文献(Cloning and expression of a trehalose synthase from Pseudomonas stutzeri CJ38in Escherichia coli for the production of trehalose)所报道的条件下测定的反应时间，结果表明与本申请所述的蛋白同源性为98％的同源蛋白在相同条件下反应时间为19h(见图6)。

一种海藻糖合酶及其编码基因与应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。