专利摘要

本发明公开一种固相微萃取头及其制备方法，将5‑吲哚乙酸、电解质加入到乙腈溶液中，得到混合液A；将三电极系统浸入到所述混合液A中并利用循环伏安法制得固相微萃取头。利用该萃取头，结合气相色谱‑质谱法(GC‑MS)，构建了检测食品中丁基羟基茴香醚(BHT)和2,6‑二叔丁基对甲基苯酚(BHA)的分析方法。该方法可以用于实际样品中的BHT和BHA的检测，具有样品处理检测、分析速度快和准确可靠的特点。

权利要求

1.固相微萃取头的制备方法，其特征在于，所述方法包括，

将5-吲哚乙酸、电解质加入到有机溶剂中，得到混合液A；

将三电极系统浸入到所述混合液A中并利用循环伏安法制得固相微萃取头；

所述的混合液A中还包括离子溶液和/或介孔碳；

所述离子溶液为十六烷基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐、1-胺丙基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐、羧乙基-3-甲基味唑双三氟甲磺酰亚胺盐、1-丁基-2,3-二甲基咪唑六氟磷酸盐的一种或多种组合。

2.根据权利要求1所述的固相微萃取头的制备方法，其特征在于，所述电解质为四丁基三氟甲磺酸铵或四丁基高氯酸铵。

3.根据权利要求1所述的固相微萃取头的制备方法，其特征在于，

所述5-吲哚乙酸为0.02mol/L、电解质为0.05mol/L、介孔碳为0.3mg/mL以及离子溶液为5μL/mL。

4.根据权利要求1所述的固相微萃取头的制备方法，其特征在于，所述循环伏安法的电位范围为0～1.6V，以0.05mV/s的速度扫描50-100圈。

5.由权利要求1-4任一项所述的方法制得的固相微萃取头。

6.应用权利要求5所述的固相微萃取头检测丁基羟基茴香醚和2,6-二叔丁基对甲基苯酚的方法。

7.根据权利要求6所述的方法，还包括以下步骤：

顶空萃取：在萃取瓶中加入氯化钠溶液、丁基羟基茴香醚和2,6-二叔丁基对甲基苯酚标准储备液后进行密封；

将萃取装置放入恒温40℃-70℃水浴中并对其进行磁力搅拌下；

将制得的固相微萃取头暴露在萃取瓶上空部位进行顶空萃取40min；

将萃取头收回并将萃取头推出解吸进行GC-MS分离检测。

8.根据权利要求7所述的方法，所述磁力搅拌的转速从300r/min～700r/min。

说明书

技术领域

本申请涉及食品分析检测技术领域，尤其涉及应用于食品抗氧化剂检测中的固相微萃取头及其制备方法及其应用。

背景技术

近年来，食品安全事件屡见不鲜，非法使用食品添加剂造成的或是食品污染的重要原因之一。食品抗氧化剂是食品加工中，用于食品保鲜的重要食品添加剂，其作用是能阻止或延缓食品氧化变质、提高食品稳定性和延长贮存期。抗氧剂是食品中常用的食品添加剂之一，其中人工合成的丁基羟基茴香醚(BHA)、2,6-二叔丁基-4-羟甲基苯酚(Ionox-100)、没食子酸丙酯(PG)、2,6-二叔丁基对甲基苯酚(BHT)由于廉价而在食品生产中被广泛使用。然而，过多的摄入上述化学合成酚类化合物，对人类健康存致癌等危害。

目前，食品中抗氧化剂的检测方法有质谱法、比色法和电化学法等。其中，主要以色谱法为主要的检测方法，包括气相色谱(GC)、高效液相色谱(HPLC)、液相色谱-质谱法(HPLC-MS)和气相色谱-质谱法(GC-MS)。然而，上述色谱法需要对样品进行前处理，具有过程繁杂和耗时等特，是食品分析中的重要研究领域之一。

固相微萃取(SPME)是20世纪90年代初提出并发展起来的一种快速、灵敏、方便、无溶剂、易于实现自动化并适用于气体、液体和固体样品分析的前处理技术。其核心技术是萃取头的制备，现有技术中的SPME头在检测BHA和BHT时的灵敏度有待提高。

发明内容

根据本申请的一个方面，提供一种固相微萃取头的制备方法，所述方法包括，

将5-吲哚乙酸、电解质加入到有机溶剂中，得到混合液A；

将三电极系统浸入到所述混合液A中并利用循环伏安法制得固相微萃取头。

在某些实施方式中，混合液A中还包括离子溶液和/或介孔碳。

在某些实施方式中，离子溶液为1-丁基-2,3-二甲基咪唑六氟磷酸盐、1-胺丙基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐、羧乙基-3-甲基味唑双三氟甲磺酰亚胺盐、(苯并三唑-1基)-N,N,N',N'-二(环戊烷)鎓六氟磷酸盐以及十六烷基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐的一种或多种组合。

在某些实施方式中，电解质为四丁基三氟甲磺酸铵或四丁基高氯酸铵。

在某些实施方式中，5-吲哚乙酸为0.02mol/L、电解质为0.05mol/L、介孔碳为0.3mg/mL以及离子溶液为5μL/mL。

在某些实施方式中，循环伏安法的电位范围为0～1.6V，以0.05mV/s的速度扫描50-100圈。

根据本发明的另一个方面，提供由前述的方法制得的固相微萃取头。

根据本发明的另一个方面，应用前述的固相微萃取头检测丁基羟基茴香醚和2,6-二叔丁基对甲基苯酚的方法。

在某些实施方式中，还包括以下步骤：

顶空萃取：在萃取瓶中加入氯化钠溶液、丁基羟基茴香醚和2,6-二叔丁基对甲基苯酚标准储备液后进行密封；

将萃取装置放入恒温40℃-70℃水浴中并对其进行磁力搅拌下；

将制得的固相微萃取头暴露在萃取瓶上空部位进行顶空萃取20-60min；

将萃取头收回并将萃取头推出解吸进行GC-MS分离检测。

在某些实施方式中，磁力搅拌的转速从300r/min～700r/min。

本申请的有益效果是：本申请采用循环伏安法(CV)，以5-吲哚乙酸(IAA)为单体，制备聚合5-吲哚乙酸(Poly-IAA)的SPME头，并将其与GC-MS相结合，检测食品中BHT和BHA的检测，这种方法制得的固相微萃取头具有交好的吸附容量和机械稳定性，进而提高分析方法的灵敏度。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本审的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是制备聚合固相微萃取头的流程示意图；

图2是放大500倍的聚合5-吲哚乙酸涂层的SEM图；

图3是放大2000倍的聚合5-吲哚乙酸涂层的SEM图；

图4是放大40000倍的聚合5-吲哚乙酸涂层的SEM图；

图5是聚合5-吲哚乙酸和离子液体涂层的SEM图；

图6是聚合5-吲哚乙酸和介孔碳涂层的SEM图；

图7是聚合5-吲哚乙酸、离子液体和介孔碳涂层的SEM图；

图8是聚合5-吲哚乙酸、离子液体和介孔碳涂层的TEM图；

图9是聚合5-吲哚乙酸、离子液体和介孔碳涂层的微观SEM低倍图；

图10是聚合5-吲哚乙酸、离子液体和介孔碳涂层的横截面的SEM图；

图11是聚合5-吲哚乙酸、离子液体和介孔碳萃取头的制备的伏安行为；

图12是不同类型萃取头对BHA和BHT的响应峰面积比较图；

图13是离子液体浓度对峰面积的影响；

图14是介孔碳浓度对峰面积的影响；

图15是搅拌速率对峰面积的影响；

图16是萃取温度对峰面积的影响；

图17是萃取时间对峰面积的影响；

图18是BHA和BHT的标准工作曲线图；

图19是图18中第一段工作曲线的放大图；

图20是薯片样品的色谱图；

图21是饼干样品的色谱图；

图22是不同类型离子溶液的萃取头对BHA和BHT响应峰面积比较图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

主要的仪器及型号：岛津GCMS-QP2010气相色谱质谱联用仪、PGSTAT302N电化学工作站(瑞士)、KQ5200E超声波清洗仪、S10-3型恒温磁力搅拌器、美国Supelco聚二甲基硅氧烷(PDMS,100μm)商用萃取头、透射电子显微电镜(TEM)、测试在JEM-2100(日本)上进行，电压为200kV、扫描电子显微电镜(SEM)在Qunta-250上进行、进样器(实验自制)。

甲醇(特级色谱纯昌泰兴业有限公司)、介孔碳(CMK-3)购自南京先丰纳米材料科技有限公司(南京，中国)、四丁基三氟甲磺酸铵(99％)、十六烷基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐(IL-1)、1-胺丙基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐(IL-2)、羧乙基-3-甲基味唑双三氟甲磺酰亚胺盐(IL-3)、1-丁基-2,3-二甲基咪唑六氟磷酸盐、5-吲哚乙酸、BHA(AR,99％)、BHT(Ar,99％)购买自北京百灵威科技有限公司、屈臣氏水、乙腈(AR天津科密欧化学试剂有限公司)、氯化钠(AR天津富宇精细化工有限公司)、本实验中其余未提及试剂均为分析纯。

实施例1：固相微萃取头的制备(Poly-IAA)

如图1所示，以铂丝为对电极、饱和甘汞电极为参比电极和不锈钢丝为工作电极组装为三电极系统，将其浸入含有0.02mol/L 5-吲哚乙酸(IAA)、0.05mol/L四丁基三氟甲磺酸铵的乙腈溶液中，在0～1.6V的电位范围中，以0.05mV/s的速度扫描100圈。然后，取出制备好的SPME头，用乙醇冲洗，晾干备用。之后，用环氧树脂将其与自制进样品手柄粘接，晾干，制得Poly-IAA。接着，通过进样手柄将SPME头置于GC-MS进样口处，温度为250℃时老化5min。

实施例2：固相微萃取头的制备(Poly-IAA-IL)

如图1所示，以铂丝为对电极、饱和甘汞电极为参比电极和不锈钢丝为工作电极组装为三电极系统，将其浸入含有0.02mol/L 5-吲哚乙酸(IAA)、0.05mol/L四丁基三氟甲磺酸铵以及1-丁基-2 3-二甲基咪唑六氟磷酸盐为5μL/mL(IL)的乙腈溶液中，在0～1.6的电位范围中，以0.05mV/s的速度扫描100圈。然后，取出制备好的SPME头，用乙醇冲洗，晾干备用。之后，用环氧树脂将其与自制进样品手柄粘接，晾干，制得Poly-IAA-IL。接着，通过进样手柄将SPME头置于GC-MS进样口处，温度为250℃时老化5min。

实施例3：固相微萃取头的制备(Poly-IAA-CMK-3)

如图1所示，以铂丝为对电极、饱和甘汞电极为参比电极和不锈钢丝为工作电极组装为三电极系统，将其浸入含有0.02mol/L 5-吲哚乙酸(IAA)、0.05mol/L四丁基三氟甲磺酸铵以及0.3mg/mL介孔碳(CMK-3)的乙腈溶液中，在0～1.6的电位范围中，以0.05mV/s的速度扫描100圈。然后，取出制备好的SPME头，用乙醇冲洗，晾干备用。之后，用环氧树脂将其与自制进样品手柄粘接，晾干，制得Poly-IAA-CMK-3。接着，通过进样手柄将SPME头置于GC-MS进样口处，温度为250℃时老化5min。

实施例4：固相微萃取头的制备(Poly-IAA-IL-CMK-3)

如图1所示，以铂丝为对电极、饱和甘汞电极为参比电极和不锈钢丝为工作电极组装为三电极系统，将其浸入含有0.02mol/L 5-吲哚乙酸(IAA)、0.05mol/L四丁基三氟甲磺酸铵、0.3mg/mL介孔碳(CMK-3)以及5μL/mL的1-丁基-2,3-二甲基咪唑六氟磷酸盐的乙腈溶液中，在0～1.6的电位范围中，以0.05mV/s的速度扫描100圈。然后，取出制备好的SPME头，用乙醇冲洗，晾干备用。之后，用环氧树脂将其与自制进样品手柄粘接，晾干，制得Poly-IAA-IL-CMK-3。接着，通过进样手柄将SPME头置于GC-MS进样口处，温度为250℃时老化5min。

以上，实施例4中的1-丁基-2,3-二甲基咪唑六氟磷酸盐离子溶液(IL-4)还可以是十六烷基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐(IL-1)或1-胺丙基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐(IL-2)或羧乙基-3-甲基味唑双三氟甲磺酰亚胺盐(IL-3)，不同类型离子溶液的萃取头对BHA和BHT响应峰面积比较图可以参考图22。

实施例5：GC操作条件

以色谱柱DB-1701为分离柱，柱温箱温度为80℃；进洋口温度230℃；不分流进样方式；压力65.2kPa；总流量40.0mL/min；柱流量1.00mL/min；线速度36.8cm/sec；吹扫流量3.0mL/min；柱温箱程序升温设定：80℃保持1min，以10℃/min升温至250℃保持5min。离子源温度200℃；接口温度250℃；溶剂延迟3min。BHT及BHA的保留时间、定性定量离子见下表。

表1-BHT及BHA的特征选择离子表

实施例6：BHA、BHT标准储备液配制

使用甲醇作溶剂配制BHA、BHT储备液，用时稀释或微量移液。饱和氯化钠水溶液则使用蒸馏水配制，密封保存。

实施例7：顶空萃取

在20mL萃取瓶中加入配置好的饱和氯化钠溶液，加入磁力搅拌子，加入BHA、BHT标准溶液，生胶带封口，塞上橡胶塞，铝盖密封。之后，将此萃取瓶放入恒温40℃水浴中，500r/min磁力搅拌下，将自制手柄插入顶空瓶，且使萃取头暴露在萃取瓶上空部位进行顶空萃取40min。结束后，将萃取头收回保护套内，迅速插入气相色谱气化室，并将萃取头推出解吸进行GC-MS分离检测。

以上的萃取头分别选用实施例1-实施例4方法制得的萃取头。

实施例8：实际样品检测

为了评价方法的实用性，将本申请实施例4制得的萃取头应用于实际样品中的饼干和薯片分析。首先，按照GBGB5009.32-2016进行样品处理，其原则是固体类食品样品用正己烷溶解，用乙腈提取。具体如下：分别称取1.0000g捣碎后薯片和饼干样品，分别溶解5mL乙腈饱和的正己烷溶液，1min充分混匀，浸泡10min。加入5mL饱和氯化钠溶液，用5mL正己烷饱和的乙腈溶液涡旋2min，3000r/min离心5min，收集乙腈层于试管中。再重复使用5mL正己烷饱和的乙腈液提取2次，合并3次提取液，氮吹浓缩后，定容于10.0mL甲醇。然后，取100μL上述样品于5mL的饱和氯化钠中进行萃取分析。其结果如表2。其次，为了进一步评价测定方法，对样品进行加标回收，其回收率在101.8％～110％之间，表明这种方法可以用于实际样品的检测。该方法用于实际样品中的BHT和BHA的检测，具有样品处理检测、分析速度快和准确可靠的特点。

表2-样品回收率测定表

下面结合具体附图阐述本申请的有益效果：

一、微萃取头的微观形貌表征

1.实施例1的Poly-IAA

利用SEM表征了利用IAA制备所得萃取头的微观形貌。从图2中可以看出，所得Poly-IAA能很好地附着在不锈钢丝，同时具体多孔结构。为进一步表征其微观结构，从图3放大倍数2000倍和图4放大倍数40000倍明显看出其有多孔的三维结构。这样的结构对分子吸附，或者负载其它纳米材料提供了先天的优势。

2.实施例2的Poly-IAA-IL

如图5所示，其结构也会变更加致密。

3.实施例3的Poly-IAA-CMK-3

如图6所示，电解质中加入介孔碳，其结构也会变更加致密，这与CMK-3掺杂到涂层相关。

4.实施例4的Poly-IAA-IL-CMK-3

如图7所示，电解质中若将IL和CMK-3同时掺杂到涂层后，可观察到涂层结构具有三维多孔。为了进一步表征其组成，还采用TEM记录其微观结构，如图8所示，可明显看出中具有CMK-3的孔状结构，表面附着离子液体。

如图9所示，其为实施例4的Poly-IAA-IL-CMK-3的TEM的低倍图，图9和实施例1的Poly-IAA的图2相比，其具有较为粗糙的表面，同时，如图10所示，记录的是Poly-IAA-IL-CMK-3横截接面的厚度约为50μm，且具有多孔结构。

二、电聚合制备Poly-IAA-IL-CMK-3萃取头的制备的伏安行为

采用CV制备萃取头，从其伏安图11中可以看出，IAA的氧化电位约1.0V，在该电位下，有明显的氧化峰出现。同时，随着聚合圈数的增多，峰电流逐步增大，表明该聚合图层具有良好的导电性。

三、实施例1-实施例4方法的不同萃取头对BHA和BHT的响应比较

从图12中可以看出，当聚合中加入IL或者CMK-3后，即实施例2和实施例3，其对两者的响应的峰面积都相应增加了。

对于IL掺杂的萃取头，在聚合过程对聚合物微观结构有影响，有其掺杂其中，提高萃取头的吸附容量。

对于CMK-3掺杂的萃取头，其掺杂到Poly-IAA的结构，增加了聚合物的空隙结构，同时本身具有多孔结构，进而增加了目标分析物的吸附容量，进而达到增大响应的目的。

同时，将实施例1至实施例4所制得的萃取头与商用的PDMS萃取头相比，其响应值都优于商用PDMS萃取头。

实施例4方法制备的Poly-IAA-IL-CMK-3头对BHT和BHA响应值分别为商用萃取PDMS的11倍和14倍。

四、利用实施例4制备的萃取头进行检测BHT及BHA时的条件优化

1.IL浓度影响

考虑IL浓度对BHT和BHA两者响应峰面积的影响。如图13所示，当IL在电解中的浓度为0～5μL/mL时，响应随着浓度的增大而增大；然而，当浓度超过5μL/mL后，响应逐步减小。产生这样的原因是当过多的IL存在是会影响涂层的孔隙度，过多会导致孔太小，同时IL吸附过多，从而导致涂层的有效比表面积减少，因此相应峰面积减小。

2.CMK-3的影响

当CMK-3浓度为0～0.5时对BHT和BHA峰面积的响应。如图14所示结果表明，当CMK-3的浓度在0.3mg/mL时，响应峰面积最大。之后，响应峰面积不断减小，这跟CMK-3的溶解度和对IL有吸附相关。当CMK-3的浓度增大，其在乙腈中的有效浓度减小，导致其在电聚合时，会沉聚在底部而无法聚合到涂层之中，同时其多孔结构会吸附部分的IL，从而导致涂层中IL量较小，导致萃取容量减小而致。

3.搅拌速率

如图15所示，搅拌使BHT和BHA由液相到气相的扩散，但是过快的转速容易带来过大的误差。因此，当转速从300r/min～700r/min对峰面积的影响。如图所示，结果表明，峰面积逐渐增大，但由于搅拌速率难以控制的较为精确，速率越大越难控制，会导致误差较大，因此优选500r/min。

4.萃取温度

当萃取温度从40℃～70℃变化时，峰面积的变化。如图16所示，当随温度上升涂层的萃取效率上升，温度为40℃时萃取效率最高，温度继续升高萃取效果下降。这与萃取头的性质、分析物的挥发度和温度的关系相关，温度升高会使待测物挥发度增大，还能增加气相的蒸汽压，促进涂层的吸附过程。但同时，纤维的吸附又是一个放热过程，过高的温度会使分配系数下降，使涂层的吸附能力降低，从而导致检测灵敏度的下降。因此，本申请优选40℃进行。

5.萃取时间

萃取时间对峰面积的影响。如图17所示,从两者的曲线关系中可以看出，随着萃取时间增长，峰面积增大；当进一步增加萃取时间，响应减小，可能萃取头吸附达到动态平衡有关。因此，本申请优选的萃取时间为40min。

在以上优化的条件下，分别对不同浓度的BHT和BHA进行分析，从图18和图19可知，其响应峰面积随着浓度的增大而增大，而分别呈现两段不同的线性浓度，分别为0.01～5.0μg/mL和5.0μg/mL～100μg/mL，具有较好线性相关见表3，从中可以得出，此方法具有较好的灵敏度和检测下限(三倍信噪比，3σ)。同时，1根萃取头分别对同一浓度的BHT和BHA进行平行3次实验，相对标准偏差(RSD)分别为2.5％和3.1％。比较了5根平行制备的萃取头同样浓度的样品进行分析，其RSD值分别为3.9％和4.5％，说明萃取头的重现较好。同时，1根萃取在使用100次后，其峰面积响应还能保持原始值的98.2％，说明萃取头具有良好的稳定性。

表3-Poly-IAA-IL-CMK-3萃取头对BHT和BHA分析性参数

固相微萃取头及其制备方法及其应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。