专利摘要

本发明公开了一种中空纤维膜富集氧化亚铁硫杆菌形成生物膜的方法及中空纤维膜反应器和应用，搭建以中空纤维膜反应器为核心的反应系统，加入培养基与接种体，进行氧化亚铁硫杆菌富集培养与形成生物膜；通过中空纤维膜反应器以无泡出气的方式向膜表面供应含有氢气的混合气；采用水浴加热的方式稳定中空纤维膜反应器温度为25‑35℃；运行数天后，通过取样口排出培养液，获得膜表面富集有氧化亚铁硫杆菌生物膜的中空纤维膜反应器；运用富集有生物膜的中空纤维膜反应器可以产生硫酸铁溶液和施氏矿物；本发明实现了氧化亚铁硫杆菌培养与利用相分离，且能在“培养/利用”间循环进行，解决培养液不能重复利用的问题。

权利要求

1.一种中空纤维膜富集氧化亚铁硫杆菌形成生物膜的方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)搭建以中空纤维膜反应器为核心的反应系统，然后通过取样口向中空纤维膜反应器中加入液体培养基与接种体的混合物，接种体与液体培养基的体积比为5～20％，然后打开培养液循环泵，进行富集培养与形成生物膜；

(2)打开气源开关，调整减压阀控制进气压力，通过中空纤维膜反应器以无泡出气的方式向膜表面供应含有氢气的混合气；

(3)打开水浴循环系统，采用水浴加热的方式稳定中空纤维膜反应器温度为25-35℃；

(4)待中空纤维膜反应器运行数天后，关闭培养液循环泵，通过取样口排出培养液，获得膜表面富集有氧化亚铁硫杆菌生物膜的中空纤维膜反应器。

2.如权利要求1所述中空纤维膜富集氧化亚铁硫杆菌形成生物膜的方法，其特征在于：步骤(1)中所述液体培养基由下述组分组成：(NH4)2SO4,132mg/L；K2HPO4,41mg/L；MgSO4·7H2O,490mg/L；CaCl2·2H2O,9mg/L；KCl,52mg/L；ZnSO4·7H2O,1mg/L；CuSO4·5H2O,2mg/L；FeSO4·7H2O,70mg/L；MnSO4·H2O,1mg/L；NaMoO4·5H2O,0.5mg/L；CoCl2·6H2O,0.5mg/L；Na2SeO4·10H2O,1mg/L；NiCl2·6H2O,1mg/L，余量是水，培养基pH为2。

3.如权利要求1所述中空纤维膜富集氧化亚铁硫杆菌形成生物膜的方法，其特征在于：步骤(1)中所述接种体为含有氧化亚铁硫杆菌的混菌接种体。

4.如权利要求1所述中空纤维膜富集氧化亚铁硫杆菌形成生物膜的方法，其特征在于：步骤(2)中所述气源为含有氢气的混合气，混合气中的氢气体积比不小于50％。

5.一种采用权利要求1-4任一项所述方法得到的中空纤维膜表面附着氧化亚铁硫杆菌生物膜的中空纤维膜反应器。

6.一种基于权利要求5所述中空纤维膜反应器用于在生物浸出时产生硫酸铁浸出液的应用，其特征在于：包括用于产生高浓度硫酸铁浸出液的间断流方式和用于产生低浓度硫酸铁浸出液连续流方式；

间断流方式的具体步骤为：

采用附着生物膜的中空纤维膜反应器搭建反应系统；通过反应系统的取样口加入硫酸亚铁溶液，然后打开培养液循环泵，开始亚铁离子氧化；打开空气泵通过中空纤维膜反应器以无泡出气的方式供应空气；打开水浴循环系统，通过水浴加热的方式稳定中空纤维膜反应器温度为25-35℃；反应48小时后，关闭培养液循环泵，通过取样口，获得硫酸铁溶液；当中空纤维膜反应器氧化Fe2+的能力下降50％后，重新对中空纤维膜反应器进行生物膜恢复；

连续流方式下的具体步骤为：

采用附着生物膜的中空纤维膜反应器搭建新的反应系统；向培养罐加入硫酸亚铁溶液，然后打开培养液循环泵，开始亚铁离子氧化；打开空气泵通过中空纤维膜反应器以无泡出气的方式供应空气；打开水浴循环系统，通过水浴加热的方式稳定中空纤维膜反应器温度为25-35℃；待培养液中三价铁离子浓度达到需要的浓度，产生的硫酸铁溶液进入储液罐；

当中空纤维膜反应器氧化Fe2+的能力下降50％后，重新对中空纤维膜反应器进行生物膜恢复。

7.一种基于权利要求5所述中空纤维膜反应器用于在生物浸出时产生施氏矿物的应用，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将附着生物膜的中空纤维膜反应器搭建新的反应系统；通过取样口加入硫酸亚铁溶液，然后打开培养液循环泵，开始亚铁离子氧化；打开空气泵使中空纤维膜无泡出气；打开水浴循环系统，通过水浴加热的方式稳定中空纤维膜反应器温度为25-35℃；反应48小时后，关闭培养液循环泵，通过取样口分离反应器底部的矿物；矿物经过清洗及干燥后，获得施氏矿物；

(2)当中空纤维膜反应器产生施氏矿物的能力下降50％后，重新对中空纤维膜反应器进行生物膜恢复。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物培养及运用领域，具体涉及一种中空纤维膜富集氧化亚铁硫杆菌形成生物膜的方法及中空纤维膜反应器和应用。

背景技术

实现固体废物中有价金属资源的高效回收，是实现循环经济、解决矿产资源枯竭等全球性问题的重要途径之一。利用氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans，简称A.f菌)从固体废物中淋滤有价金属，具有工艺控制简单、绿色环保等特点，是湿法冶金领域研究的热点。但是，在利用过程中，浸出液中的三价铁离子、硫酸根离子及典型一价阳离子(主要为：钾离子、钠离子与铵根离子)等极易形成黄钾铁矾、施氏矿物等三价铁矾渣紧密覆盖在浸出物表面，阻碍A.f菌与固体废物间的传质过程，进而导致A.f菌大量死亡，有价金属浸出效率显著降低；此外，浸出液中三价铁离子因大量形成三价铁矾渣，会显著降低浸出液的氧化还原电位，亦会进一步影响有价金属浸出效率。A.f菌浸出技术存在的这一缺陷，使其工业化应用受到了限制。因此，破坏三价铁矾渣形成条件，采用不含典型一价阳离子的浸出液是A.f菌浸出技术大规模应用的重要环节之一。

A.f菌为化能自养型细菌，在好氧条件下，能够将亚铁离子氧化为三价铁离子(或将氢气氧化生成水)。其生长与代谢周期较长，因此通常需先在液体培养基中活化、增殖，待液体培养基中A.f菌数量与活性最大时，再将细菌培养液作为浸出剂，直接浸出固体废物中的有价金属。由于典型一价阳离子为A.f菌生长必须的营养成分，要采用不含典型一价阳离子的浸出液，则必须将细菌从培养液中分离，再进行利用。

近年来，细胞固定化技术的快速发展为解决这一问题提供了可能。具体到氧化亚铁硫杆菌的固定方法，主要包括吸附法与包埋法。吸附法采用微孔介质或比表面积大的微粒，通过被动吸附(机械分离与物理吸附)，将细菌固定到介质表面，进而与培养液分离；包埋法则采用凝胶、海藻酸钙等固化剂，将细菌固定成小球，然后通过过滤将细菌与培养液分离。但是随着研究及应用的深入后发现，被动吸附的A.f菌容易从介质表面脱落，且存在三价铁矾渣覆盖介质表面等局限；而在包埋法中，由于细菌被包埋材料覆盖，导致细菌与浸出液之间传质受到影响，且包埋材料对细菌有一定毒性，因而存在细菌活性低、实用性弱等缺点。此外，不管是吸附法还是包埋法，原来培养细菌的培养液在分离细菌后，难以再利用，这进一步增加了实际运用的成本。

发明内容

为克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种中空纤维富集氧化亚铁硫杆菌形成生物膜的方法，实现了氧化亚铁硫杆菌培养与利用相分离，且解决了培养液不能重复利用的问题。

为实现上述目的，本发明采用技术方案如下：

一种中空纤维膜富集氧化亚铁硫杆菌形成生物膜的方法，采用中空纤维膜以无泡出气方式向膜表面供应含有氢气的混合气，进而通过富集培养氧化亚铁硫杆菌并在中空纤维膜表面形成氧化亚铁硫杆菌生物膜。

进一步地，如上所述中空纤维膜富集氧化亚铁硫杆菌形成生物膜的方法，包括如下步骤：

(1)搭建以中空纤维膜反应器为核心的反应系统，然后通过取样口向中空纤维膜反应器中加入液体培养基与接种体的混合物，接种体与液体培养基的体积比为5～20％，然后打开培养液循环泵，进行富集培养与形成生物膜；

(2)打开气源开关，调整减压阀控制进气压力，通过中空纤维膜反应器以无泡出气的方式向膜表面供应含有氢气的混合气；

(3)打开水浴循环系统，采用水浴加热的方式稳定中空纤维膜反应器温度为25-35℃；

(4)待中空纤维膜反应器运行数天后，关闭培养液循环泵，通过取样口排出培养液(此培养液可重复用于膜表面生物膜的培养及恢复)，获得膜表面富集有氧化亚铁硫杆菌生物膜的中空纤维膜反应器。

进一步地，如上所述中空纤维膜富集氧化亚铁硫杆菌形成生物膜的方法，步骤(1)中所述液体培养基由下述组分组成：(NH4)2SO4,132mg/L；K2HPO4,41mg/L；MgSO4·7H2O,490mg/L；CaCl2·2H2O,9mg/L；KCl,52mg/L；ZnSO4·7H2O,1mg/L；CuSO4·5H2O,2mg/L；FeSO4·7H2O,70mg/L；MnSO4·H2O,1mg/L；NaMoO4·5H2O,0.5mg/L；CoCl2·6H2O,0.5mg/L；Na2SeO4·10H2O,1mg/L；NiCl2·6H2O,1mg/L，余量是水，培养基pH为2。

进一步地，如上所述中空纤维膜富集氧化亚铁硫杆菌形成生物膜的方法，步骤(1)中所述接种体为含有氧化亚铁硫杆菌的混菌接种体。

进一步地，如上所述中空纤维膜富集氧化亚铁硫杆菌形成生物膜的方法，步骤(2)中所述气源为含有氢气的混合气，混合气中的氢气体积比不小于50％。

一种采用如上任一项所述方法得到的中空纤维膜表面附着氧化亚铁硫杆菌生物膜的中空纤维膜反应器。

一种基于如上所述中空纤维膜反应器用于在生物浸出时产生硫酸铁浸出液的应用。

如上所述的应用，包括用于产生高浓度硫酸铁浸出液的间断流方式和用于产生低浓度硫酸铁浸出液连续流方式；

间断流方式的具体步骤为：

采用附着生物膜的中空纤维膜反应器搭建反应系统；通过反应系统的取样口加入硫酸亚铁溶液，然后打开培养液循环泵，开始亚铁离子氧化；打开空气泵通过中空纤维膜反应器以无泡出气的方式供应空气；打开水浴循环系统，通过水浴加热的方式稳定中空纤维膜反应器温度为25-35℃；反应48小时后，关闭培养液循环泵，通过取样口，获得硫酸铁溶液；当中空纤维膜反应器氧化Fe2+的能力下降50％后，重新对中空纤维膜反应器进行生物膜恢复；

连续流方式下的具体步骤为：

采用附着生物膜的中空纤维膜反应器搭建新的反应系统；向培养罐加入硫酸亚铁溶液，然后打开培养液循环泵，开始亚铁离子氧化；打开空气泵通过中空纤维膜反应器以无泡出气的方式供应空气；打开水浴循环系统，通过水浴加热的方式稳定中空纤维膜反应器温度为25-35℃；待培养液中三价铁离子浓度达到需要的浓度，产生的硫酸铁溶液进入储液罐；

当中空纤维膜反应器氧化Fe2+的能力下降50％后，重新对中空纤维膜反应器进行生物膜恢复。

一种基于如上所述中空纤维膜反应器用于在生物浸出时产生施氏矿物的应用。

如上所述的应用，包括如下步骤：

(1)将附着生物膜的中空纤维膜反应器搭建新的反应系统；通过取样口加入硫酸亚铁溶液，然后打开培养液循环泵，开始亚铁离子氧化；打开空气泵使中空纤维膜无泡出气；打开水浴循环系统，通过水浴加热的方式稳定中空纤维膜反应器温度为25-35℃；反应48小时后，关闭培养液循环泵，通过取样口分离反应器底部的矿物；矿物经过清洗及干燥后，获得施氏矿物；

(2)当中空纤维膜反应器产生施氏矿物的能力下降50％后，重新对中空纤维膜反应器进行生物膜恢复。

本发明中空纤维膜表面生成富集氧化亚铁硫杆菌生物膜的方法及中空纤维膜反应器和应用，具有如下优点：

采用的细菌接种体使用含有氧化亚铁硫杆菌的混菌接种体，如酸性矿山废水、煤矿废水等，相比使用氧化亚铁硫杆菌纯菌，混菌培养不怕染菌，可极大降低反应器操作要求与管理费用；此外，可节约购买氧化亚铁硫杆菌纯菌或从混菌接种体中筛选纯化细菌的费用。

本发明采用绿色能源—氢气作为电子供体替代传统的硫酸亚铁来培养细菌，可避免传统氧化亚铁硫杆菌培养阶段产生的三价铁矾渣，且氢气的最终产物是水，无二次污染。

本发明采用中空纤维膜提供氢气，细菌“主动吸附”到中空纤维膜表面获取生长能源进而形成生物膜，克服了传统吸附法“被动吸附”易脱落的问题。

本发明方法操作简单，实现了氧化亚铁硫杆菌培养与利用相分离，且能在“培养/利用”间循环进行，解决培养液不能循环利用的问题。

附图说明

图1为实施例1中的反应系统；

图2为实施例2中的反应系统；

图3为实施例3中的反应系统；

图4A为实施例1中培养前中空纤维膜表面照片；

图4B为实施例1中富集生物膜后的中空纤维膜表面照片；

图4C为实施例1中生物膜在显微镜下的照片(放大400倍)；

图5A为实施例1中培养前后物种在门水平下的相对占比情况；

图5B为实施例1中培养前后物种在种水平上的相对占比情况；

图6为实施例3中合成的施氏矿物电镜图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面通过具体实施例介绍使本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

如图1所示，本发明反应系统中的中空膜纤维反应器可以采用商业购买的中空纤维膜膜组件，本发明采用自制普通玻璃双层反应器组装：反应器主体呈圆柱状，底部为锥形，高度20厘米，直径8厘米。反应器主体带夹层，夹层厚1cm(夹层用于水浴恒温)。主体内层设置中空纤维膜，并通过管道与外部进气管线连接，有效容积为450mL(减去中空纤维膜占用容积)；培养系统中的跌水器为跌水曝气装置，本发明采用普通玻璃制成，呈圆柱状，底部为锥形，高度10厘米，直径3厘米，有效容积40mL，跌水器顶部采用微孔滤膜覆盖密实，孔径为0.22微米。

中空纤维膜反应器采用的中空纤维膜为在一定压力范围内能够实现无泡出气的气体透气膜，而对其具体尺寸及品牌没有特别的限制。本发明采用日本三菱公司生产的氢气透气膜，其在0.001～0.1MPa范围内可实现无泡出气。

实施例1

富集氧化亚铁硫杆菌并形成生物膜：

按附图1构建以中空纤维膜反应器为核心的反应系统，然后通过取样口向中空纤维膜反应器中加入450mL液体培养基(成分为：(NH4)2SO4,132；K2HPO4,41；MgSO4·7H2O,490；CaCl2·2H2O,9；KCl,52；ZnSO4·7H2O,1；CuSO4·5H2O,2；MnSO4·H2O,1；FeSO4·7H2O,70；NaMoO4·5H2O,0.5；CoCl2·6H2O,0.5；Na2SeO4·10H2O,1；NiCl2·6H2O,1，余量是水(单位是：mg/L，培养基pH用5mol/L的硫酸调整到2.0))与50mL酸性矿山废水，打开培养液循环泵，进行富集培养与形成生物膜；打开高压气瓶阀门，调整减压阀控制进气压力为0.06Mpa，通过中空纤维膜反应器以无泡出气的方式供应氢气与二氧化碳的混合气(混合气中氢气与二氧化碳的体积比为4:1)；打开水浴循环系统，通过水浴加热的方式稳定中空纤维膜反应器温度为25-35℃；待反应器成功运行10天后，关闭培养液循环泵，通过取样口排出培养液(此培养液可重复用于膜表面生物膜的培养及恢复)，获得膜表面富集有氧化亚铁硫杆菌生物膜的中空纤维膜反应器。

结果如图4A-图4C和图5A-图5B所示。从图4A-图4C可以看出，在培养10天后，中空纤维膜表面由光滑到附着丰富的生物膜，通过显微镜图片可以看出，中空纤维膜由表面到外覆盖着丝状的生物膜，里层较厚，外层较薄；图5A-图5B展示了接种体到生物膜的物种变化，从图5A-图5B可以看出，经过富集培养并形成生物膜后，物种由酸性矿山废水中的多物种变得较为单一，且氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)占比高达93％。

实施例2

产生可用于生物浸出的硫酸铁浸出液，含间断流方式(高浓度硫酸铁浸出液)和连续流方式(低浓度硫酸铁浸出液)：

(1)间断流方式下的具体步骤：将附着生物膜的中空纤维膜反应器按附图2搭建新的反应系统；通过反应系统的取样口加入500mL硫酸亚铁溶液(溶液中Fe2+浓度为9g/L，并用5mol/L的硫酸调整pH＝2.0)，然后打开培养液循环泵及水阀2(水阀1及水阀3关闭)，开始亚铁离子氧化；打开空气泵(空气泵进气口设置有滤膜防止粉尘进入空气泵)，调整减压阀控制空气进入压力，通过中空纤维膜反应器以无泡出气的方式供应空气；打开水浴循环系统，通过水浴加热的方式稳定中空纤维膜反应器温度为25-35℃；反应48小时后，关闭培养液循环泵，通过取样口，可一次性获得500mL的硫酸铁溶液(溶液中Fe3+浓度为8.75±0.25g/L)。

(2)连续流方式下的具体步骤：将附着生物膜的中空纤维膜反应器按附图2搭建新的反应系统；向培养罐加入硫酸亚铁溶液(溶液中Fe2+浓度为0.5～5g/L，并用5mol/L的硫酸调整pH＝2.0)，然后打开培养液循环泵、水阀2与水阀3(关闭水阀1)；待培养液充满中空纤维膜反应器后，关闭水阀3，开始亚铁离子氧化；打开空气泵(空气泵进气口设置有滤膜防止粉尘进入空气泵)，调整减压阀控制空气进入压力，通过中空纤维膜反应器以无泡出气的方式供应空气；打开水浴循环系统，通过水浴加热的方式稳定中空纤维膜反应器温度为25-35℃；待培养液中三价铁离子浓度达到需要的浓度，合理控制水阀1-3，使中空纤维膜反应器连续产生浓度稳定的硫酸铁溶液进入储液罐(此方式下可溶液Fe3+浓度为0.5～5g/L，具体详见表1)。

表1实施例2中连续流方式下产生硫酸铁浓度的情况

(3)当中空纤维膜反应器氧化Fe2+的能力下降50％后，采用实施例一的方法(此时不再加入接种体)，并重复利用培养液对中空纤维膜反应器进行生物膜恢复，实现“培养/利用”循环连续进行。

实施例3

产生施氏矿物：

(1)将附着生物膜的中空纤维膜反应器按附图3搭建新的反应系统；通过取样口加入500mL的硫酸亚铁溶液(溶液Fe2+浓度为9g/L，并用5mol/L的硫酸调整pH＝3.0)，然后打开培养液循环泵，开始亚铁离子氧化；打开空气泵向中空纤维膜通入空气，调整减压阀使中空纤维膜无泡出气；然后打开水浴循环系统，通过水浴加热的方式稳定中空纤维膜反应器温度为25-35℃；反应48小时后，关闭培养液循环泵，通过取样口分离反应器底部的矿物；矿物经过清洗及干燥后，获得施氏矿物，施氏矿物形貌如附图6所示。

(2)当中空纤维膜反应器氧化Fe2+的能力下降50％后，采用实施例一的方法(此时不再加入接种体)，并重复利用培养液对中空纤维膜反应器进行生物膜恢复，实现“培养/利用”循环连续进行，并可以实现培养液的重复利用。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

一种中空纤维膜富集氧化亚铁硫杆菌形成生物膜的方法及中空纤维膜反应器和应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。