专利摘要

本发明提供一种从玉米蛋白粉酶解胶状物中提取玉米黄素的方法，该方法中所述玉米蛋白粉酶解胶状物为处理玉米蛋白粉得到的红棕色胶状物；所述对玉米蛋白粉的处理方法包括：对玉米蛋白粉进行第一次碱处理后酶解、醇提后取滤液蒸干。本发明的方法能够较好的实现玉米黄素和玉米多肽类物质的有效分离，提高了玉米黄素的产量以及纯度。

权利要求

1.一种从玉米蛋白粉酶解胶状物中提取玉米黄素的方法，所述方法中，玉米蛋白粉酶解胶状物为处理玉米蛋白粉得到的红棕色胶状物；

所述对玉米蛋白粉的处理方法包括：对玉米蛋白粉进行第一次碱处理后酶解、醇提后取滤液蒸干，具体步骤为：玉米蛋白粉粉碎，过40~80目筛；取过筛后的玉米蛋白粉加水拌匀后加入10~30%的NaOH溶液进行第一次碱处理调pH至6.8~7.2，静放浸透2~4h，得料液；在搅拌下水浴加热料液至温度为38~45℃时，加入复合蛋白酶酶解12~36h；倒出酶解后的料液，在55~75℃温度下干燥14~20h，得干燥物；粉粹干燥物至细粉，醇提4~12h，过滤后取滤液；滤液静放沉淀后取上清液蒸干至干物质上出现红棕色胶状物，取该红棕色胶状物即为玉米蛋白粉酶解胶状物；

其中，所述复合蛋白酶的加入比例为：过筛后的玉米蛋白粉与复合蛋白酶的重量比为100：2.5~4.5；所述复合酶由枯草杆菌蛋白酶、链霉素蛋白酶和氨肽酶组成，复合比例4：3：3,w/w/w；

所述醇提操作进行至少二次，其中，第一次醇提操作包括加入95~100%的乙醇提取4~12h，过滤得第一次滤液和滤渣，滤液备用；第二次醇提操作包括在第一次醇提后的滤渣中加入与第一次醇提等量的95~100%的乙醇，于55~65℃提取1~2h，过滤得第二次滤液和滤渣；

所述从玉米蛋白粉酶解胶状物中提取玉米黄素的方法包括：玉米蛋白粉酶解胶状物中加95%的酒精，搅拌，搅拌过程中加入10%的NaOH溶液进行第二次碱处理调pH至11-13，碱处理后液面出现白色泡沫状漂浮物，取漂浮物下的黄色液体调pH至5-6，在55~70℃下浓缩，浓缩液进行萃取后取滤液蒸干即得。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述对玉米蛋白粉的处理方法中，所述醇提采用95~100%的乙醇。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述醇提操作进行三次，其中，第三次醇提操作重复第二次醇提操作的步骤，过滤取第三次滤液和滤渣，滤液备用。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，对玉米蛋白粉的处理方法中，所述醇提后合并滤液静放沉淀后取上清液55~70℃下旋转蒸发，接近至干时，干物质上出现可与干物质分离、滚动的红棕色胶状物，取出该红棕色胶状物即为玉米蛋白粉酶解胶状物。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述萃取采用QuECHERS柱。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于，所述提取玉米黄素的方法包括：玉米蛋白粉粉碎，过40~80目筛；取过筛后的玉米蛋白粉100g，加自来水400~600mL拌匀；用10~30%NaOH溶液调pH=6.8~7.2，静放浸透2~4h，得料液；在搅拌下水浴加热至料液温度为38~45℃时，按蛋白粉和复合蛋白酶=100:2.5~4.5,w/w的比例加入复合蛋白酶2.5~4.5g，酶解12~36h；倒出酶解后的料液，在55~75℃烘箱内干燥14~20h，得干燥物；干燥物粉碎成细粉，加入400~600mL 95~100%乙醇进行第一次提取4~12h，过滤取第一次滤液，备用；向滤渣中加入400~600mL 95~100%乙醇，55~65℃下进行第二次提取，提取1~2h，过滤取第二次滤液，备用；重复第二次提取过程一次，过滤取第三次滤液，合并三次滤液，得滤液1340~1600mL，自然静放沉淀1-3h，上清液澄清；取上清液在55~70℃旋转蒸发，接近至干时，可见旋转过程中在干物质上有可与干物质分离、滚动的红棕色胶状物；将红色胶状物取出，向胶状物加95%酒精至100mL，搅拌，在搅拌下向该液体中再加入10%的氢氧化钠调pH至11-13，液面出现白色泡沫状漂浮物，取漂浮物下的黄色液体使用10%HCL调pH至5-6，在55~70℃旋转蒸发至12-15mL，经QuECHERS柱过滤，滤液经旋蒸得产物。

说明书

技术领域

本发明涉及化工、医药、食品领域，具体涉及一种从玉米蛋白粉酶解胶状物中提取玉米黄素的方法。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

玉米黄素的分子结构中有11个双键，构成了一个大的共轭体系，能阻断自由基链式传递，在生物体中通过降低自由基单线氧和光敏感剂的反应活性起到抗氧化作用。两端环上的羟基强化了抗氧化作用。玉米黄素能防止紫外线对细胞蛋白和酶和DNA的破坏，如DNA断裂，嘧啶二聚体内旋等，能降低生物体某些疾病的发生风险。它作为光过滤器对眼部代谢和功能有直接影响，它能提高婴儿视觉损伤的免疫作用，防止白内障的形成，降低老年失明危险。玉米黄素有抗癌作用，可显著降低心肌梗塞的发病率，降低心血管疾病的发生。玉米黄素可以增加蛋黄的红黄色，增加肉鸡的肉质和风味，具有重要饲用价值。玉米黄素也可用作药品、保健品和饮料的开发。

前人的理论和实验研究为玉米黄素的开发利用奠定了基础，但是玉米黄素提取的规模化生产还未真正实施。

发明人发现其症结在于玉米黄素和玉米多肽(特别是玉米醇溶蛋白，醇溶蛋白链接更多的玉米黄素，该蛋白脂溶性强，因为由较多的疏水性氨基酸组成，属高F值蛋白，尤其含亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸，甘氨酸，苯丙氨酸等较多。脂溶性的玉米黄素最易以疏水性与其结合)等物质结合牢固，单一方法比如微波提取法、超临界提取法、多溶剂萃取法等很难在玉米蛋白酶解物将玉米黄素提取干净，由此获得的玉米黄素收率很低，比如在中国专利CN103073914A“一种从玉米蛋白中提取玉米黄色素的方法”中，其使用微波提取法在玉米蛋白中提取玉米黄素，根据其背景技术及发明内容，虽然其能够克服普通溶剂浸提和高新技术辅助浸提，比如专利CN1306045A“玉米黄色素的制备方法”中公开的采用极性由小到大的不同溶剂浸提，极性小的采用己烷和乙酸乙酯，极性大选丙醇等，萃取后再经酶制剂处理，时间长，操作复杂的问题；以及能够克服比如专利CN 99106874A所公开的，采用超临界萃取，虽纯度较高但设备昂贵，难以应用于工业化生产，并且提取率低的问题；以及能够克服比如专利申请CN101280121A所公开的，采用微波-超声波提取玉米黄色素，缩短提取时间，但是高功率微波导致的热效应使反应系统温度难以控制、不利工业化生产、而且正己烷洗脱可能导致难以处理的溶剂残留、以及在食品加工业较难应用的问题，但CN103073914A公开的技术方案本身对提取率的提高有限，提取率仍然较低。

发明内容

为解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种从玉米蛋白粉酶解胶状物中有效提取玉米黄素的方法，该方法能够较好的实现玉米黄素和玉米多肽类物质的有效分离，提高了玉米黄素的产量以及纯度。

具体地，本发明的技术方案如下所示：

本发明提供了一种提取玉米黄素的方法，其包括从玉米蛋白粉酶解胶状物中提取玉米黄素，其中，所述玉米蛋白粉酶解胶状物为处理玉米蛋白粉得到的红棕色胶状物。

所述对玉米蛋白粉的处理方法包括：对玉米蛋白粉进行第一次碱处理后酶解、醇提后取滤液蒸干。

在本发明的某些实施方式中，所述对玉米蛋白粉的处理方法包括：玉米蛋白粉粉碎，过40～80目筛；取过筛后的玉米蛋白粉加水拌匀后加入10～30％的NaOH溶液进行第一次碱处理调pH至6.8～7.2，静放浸透2～4h，得料液；在搅拌下水浴加热料液至温度为38～45℃时，加入复合蛋白酶酶解12～36h；倒出酶解后的料液，在55～75℃温度下干燥14～20h，得干燥物；粉粹干燥物至细粉，醇提4～12h，过滤后取滤液；滤液静放沉淀后取上清液蒸干至干物质上出现红棕色胶状物，取该红棕色胶状物即为玉米蛋白粉酶解胶状物。

玉米蛋白粉颗粒干而坚硬，而且玉米蛋白粉中的蛋白(尤其是玉米醇溶蛋白)和玉米黄素的脂溶性结合牢固，水分子难以进入蛋白颗粒当中，玉米蛋白粉在水中始终呈粉粒状态，而本发明的第一次碱处理可以破坏蛋白质的高级结构(四级、三级、二级)成一级结构，为酶提供作用于底物的条件，而且使复合酶有效工作；否则，仅靠调整酶的类型、或者调整酶解条件对本发明技术效果的实现所做出的贡献十分有限。

本发明所述细粉，如无特殊说明，均指能全部通过五号筛，并含能通过六号筛不少于95％的粉末状态。

在本发明的某些实施方式中，所述复合蛋白酶的加入比例为：过筛后的玉米蛋白粉与复合蛋白酶的重量比为100：2.5～4.5(w/w)，在一些实施方式中，所述过筛后的玉米蛋白粉与复合蛋白酶的重量比为100：3～4.5时酶解更为充分，尤其为100：3时酶解效果更好。

本发明所述的复合蛋白酶由枯草杆菌蛋白酶、链霉素蛋白酶和氨肽酶组成，复合比例4：3：3(W:W:W)。枯草杆菌蛋白酶无特异性，可分解各种蛋白，工作温度37-59℃，最佳温度40-45℃，pH 6.0-10.0，最佳pH 8.5；链霉素蛋白酶无特异性，可水解各种蛋白直到单个氨基酸，最佳工作温度40℃左右，工作范围pH 5.5-9.0，最佳工作pH 8.5；玉米蛋白中含较多的亮氨酸以及疏水性的苯丙氨酸等，这些多是氨肽酶的特异性酶切位点。氨肽酶的最佳工作pH 6-9，在枯草杆菌蛋白酶和链霉素蛋白酶将玉米蛋白切成肽段后，一些玉米黄素得以释放，当氨肽酶酶解肽段后因疏水性被破坏，玉米黄素与玉米蛋白的结合被破坏，从而又释放出大量玉米黄素。这为本发明后续玉米黄素的提取极为有利。

在本发明的某些实施方式中，醇提采用95～100％的乙醇，采用95％的乙醇或无水乙醇时效果较好，尤其采用95％乙醇效果更好。

在本发明的醇提操作后，滤渣干燥后微黄几乎近白色时，表明玉米黄素提取较完全。

在本发明的实施方式中，为保证玉米黄素的提取较为完全，醇提的操作进行至少二次，其中，第一次醇提操作包括加入95～100％的乙醇提取4～12h，过滤得第一次滤液和滤渣，滤液备用；第二次醇提操作包括在第一次醇提后的滤渣中加入与第一次醇提等量的95～100％的乙醇，于55～65℃提取1～2h，过滤得第二次滤液和滤渣，滤液备用。

在本发明的一些实施方式中，醇提操作进行三次，其中，第三次醇提操作重复第二次醇提操作的步骤，过滤得第三次滤液和滤渣，滤液备用。

在本发明的某些实施方式中，醇提后合并滤液静放沉淀后取上清液55～70℃下旋转蒸发，接近至干时，干物质上出现可与干物质分离、滚动的红棕色胶状物，取出该红色胶状物即为玉米蛋白粉酶解胶状物。

在本发明的一些实施方式中，所述从玉米蛋白粉酶解胶状物中提取玉米黄素的方法包括：玉米蛋白粉酶解胶状物中加95％的酒精，搅拌，搅拌过程中加入10％的NaOH溶液进行第二次碱处理调pH至11-13，碱处理后液面出现白色泡沫状漂浮物，取漂浮物下的黄色液体调pH至5-6，在55～70℃下浓缩，浓缩液进行萃取后取滤液蒸干即得产物。萃取可采用QuECHERS柱。

在本发明的一些实施方式中，所述提取玉米黄素的方法包括：玉米蛋白粉粉碎，过40～80目筛；取过筛后的玉米蛋白粉100g，加水(比如自来水)400～600mL拌匀；用10～30％NaOH溶液调pH＝6.8～7.2，静放浸透2～4h，得料液；在搅拌下水浴加热至料液温度为38～45℃时，按过筛后的玉米蛋白粉和复合蛋白酶＝100：2.5～4.5(w/w)的比例加入复合蛋白酶2.5～4.5g，酶解12～36h；倒出酶解后的料液，在55～75℃烘箱内干燥14～20h，得干燥物；干燥物粉碎成细粉，加入400～600mL 95～100％乙醇进行第一次提取4～12h，过滤得第一次滤液和滤渣，滤液备用；向滤渣中加入400～600mL 95～100％乙醇，55～65℃下进行第二次提取，提取1～2h，过滤得第二次滤液和滤渣，滤渣备用；重复第二次提取过程一次，过滤得第三次滤液和滤渣，滤渣干燥后60～61g，微黄几乎近白色，表明玉米黄素提取较完全，合并三次提取所得的滤液，得滤液1340～1600mL，自然静放沉淀1-3h(沉淀干燥后为黄色，约3～6g)，上清液澄清；取上清液在55～70℃旋转蒸发，接近至干时，可见旋转过程中在干物质上有可与干物质分离、滚动的红棕色胶状物；将红色胶状物取出，向胶状物加95％酒精至100mL，搅拌，在搅拌下向该液体中再加入10％的氢氧化钠调pH至11-13，液面出现大量白色泡沫状漂浮物，取漂浮物下的黄色液体使用10％HCL调pH至5-6，在55～70℃旋转蒸发至12-15mL(该浓缩物中含干物质3.3～4.0g)，经QuECHERS柱过滤，滤液经旋蒸得0.8～1.2g产物，经检测玉米黄素含量在78％以上。

本发明所述的玉米黄素采用高效薄层硅胶板进行检测，方法如下：

取GF254高效薄层硅胶板(10cm×20cm)，经120度活化2小时备用。

玉米黄素标准品溶液的制备：玉米黄素标准品购自中国药品、生物制品检定所。称取1mg玉米黄素标准品，加入95％乙醇10mL溶解配成母液，然后按比例用95％乙醇配成2、4、6、8、10μg/mL梯度质量浓度的玉米黄素标准品溶液。

样品液制备：取按照本发明制备的玉米黄素样品(比如上文中所称的“产物”)，溶解在95％乙醇中，制成6μg/mL样品液。

在活化好的GF254硅胶板上点标准品溶液5个点，同时点一个样品点，制作标准曲线。展开剂为正己烷：丙酮＝3：1，展距16-18cm，晾干。AgNO₃甲醇溶液喷雾显色，用CamagⅢ薄层扫描仪在445nm扫描定量。得标准曲线，方程为：Y＝0.00834+0.0972X(R²＝0.9994)，X表示玉米黄素浓度，单位为μg/mL，Y表示吸光值，并对制备样品定量。

相较于现有技术，本发明具备以下优势：玉米蛋白粉经碱处理调pH至6.8～7.2、浸透后水浴加温酶解的操作释放出色素(玉米黄素及其他色素物质)，用乙醇提取后，色素和多肽等物质溶解于乙醇提取液，提取液放置取上清液后经浓缩制备得到玉米蛋白粉酶解胶状物。该胶状物中仍然有玉米黄素和多肽物质结合着，再次采用乙醇溶解该酶解胶状物，第二次碱处理用NaOH溶液调pH至11-13，实现玉米黄素和多肽物质的有效分离。本发明的两次碱处理(玉米蛋白粉酶解前的碱处理和醇提后的碱处理)促进了玉米黄素的释放，促进了玉米蛋白粉中叶黄素向玉米黄素的转化，并提高了玉米黄素的产量。其中，玉米黄素醇提取液的碱处理和quEcheRs柱的过滤纯化也提高了玉米黄素的纯度。

此外，本发明所述的玉米黄素的提取过程仅用乙醇一种溶剂，简化了工艺，减少了多溶剂提取带来的复杂的溶剂回收和设备投资问题，有利于生产。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。本发明所用试剂和材料均为本领域常规使用的试剂和材料，可通过常规途径购买获得，比如玉米蛋白粉可在淀粉厂购买获得，使用方法为本领域的常规使用方法，或者可依试剂或材料的使用说明进行操作。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1

取玉米蛋白粉粉碎过60目筛，取筛过的玉米蛋白粉100g，加自来水500mL拌匀；用30％NaOH溶液调pH＝7，静放浸透3h。在搅拌下水浴加热至料液温度为42℃时，按所取的过筛后的玉米蛋白粉和复合蛋白酶(枯草杆菌蛋白酶、链霉素蛋白酶和氨肽酶组成，复合比例4：3：3(W:W:W)，三种酶分别购自诺维信公司)＝100：3(w/w)的比例加入复合蛋白酶3g，酶解24h。倒出酶解后的料液，在65℃烘箱内干燥16h。粉碎成细粉。加入500mL 95％乙醇提取12h，过滤得第一滤液和滤渣，滤液备用，向该滤渣中加入500mL 95％乙醇，55℃提取1h，过滤得第二滤液和滤渣，滤液备用，重复第二次提取过程一次，即共进行加热提取2次，过滤得第三滤液和滤渣，滤渣干燥后为白色，有轻微黄色，约60g，表明玉米黄素提取较完全，合并上述三次提取得到的滤液，约1340mL，自然静放沉淀2h，上清液体澄明，分离上清液和沉淀，沉淀干燥后约5g，为黄色，上清液在55℃旋转蒸发，接近至干时，可见旋转过程中在干物质上有可与干物质分离、滚动的红棕色胶状物。将胶状物取出，干重约14g。向胶状物中加95％酒精至100mL，搅拌，在搅拌下向该液体中加入10％的氢氧化钠调pH至11，可见有白色泡沫状物漂浮在液面，取出漂浮物下面的黄色液体并用10％HCL调pH至5。在55℃旋转蒸发至12mL(含干物质3.3g)，经QuECHERS柱过滤，滤液经旋蒸得产物0.8g，产物经检测玉米黄素含量为81％。

玉米黄素的检测方法：

取GF254高效薄层硅胶板(10cm×20cm)，经120度活化2小时备用。

制备玉米黄素标准品溶液：玉米黄素标准品购自中国药品、生物制品检定所。称取1mg玉米黄素标准品，加入95％乙醇10mL溶解配成母液，然后按比例用95％乙醇配成2、4、6、8、10μg/mL梯度质量浓度的玉米黄素标准品溶液。制备样品溶液：取上述产物溶解在95％乙醇中，制成6μg/mL样品液。

在活化好的GF254硅胶板上点标准品溶液5个点，同时点一个样品点，制作标准曲线。展开剂为正己烷：丙酮＝3：1，展距16-18cm，晾干。AgNO₃甲醇溶液喷雾显色，用CamagⅢ薄层扫描仪在445nm扫描定量。得标准曲线，标准曲线方程为：y＝0.00834+0.0972X(R²＝0.9994)，并对制备样品定量。

实施例2

取玉米蛋白粉粉碎过80目筛，取筛过的玉米蛋白粉100g，加自来水400mL拌匀；用10％NaOH溶液调pH＝7.2，静放浸透2h，得料液。在搅拌下水浴加热至料液温度为38℃时，按所取的过筛后的玉米蛋白粉和复合蛋白酶＝100:2.5(w/w)的比例加入复合蛋白酶2.5g，酶解36h。倒出酶解后的料液，在75℃烘箱内干燥14h。粉碎成细粉。加入无水乙醇400mL搅拌提取8h，过滤得第一滤液和滤渣，滤液备用；向该滤渣种加入400mL无水乙醇，65℃提取2h，过滤得第二滤液和滤渣，滤液备用；重复第二次提取过程一次，即共进行加热提取2次，过滤得第三滤液和滤渣，滤渣干燥后为白色，微黄，约61g，表明玉米黄素提取较完全，合并上述三次提取所得的滤液，约1050mL。自然静放沉淀1h，上清液澄明，分离上清液和沉淀，沉淀干燥后约6g，黄色，上清液在70℃旋转蒸发，接近至干时，可见旋转过程中在干物质上有可与干物质分离、滚动的红棕色胶状物。将胶状物取出，干重约16g。向该胶状物种加95％酒精至100mL，搅拌，在搅拌下向该液体中加入10％的氢氧化钠调pH至13，可见有白色泡沫状物漂浮在液面，取出漂浮物下面的黄色液体并用10％HCL调pH至5.5。在65℃旋转蒸发至14mL(含干物质4.0g)，经QuECHERS柱过滤，滤液经旋蒸得该物质1.2g，按实施例1中所述方法检测玉米黄素，其含量为78％。

实施例3

取玉米蛋白粉粉碎过40目筛，取筛过的玉米蛋白粉100g，加自来水600mL拌匀；用20％NaOH溶液调pH＝6.8，静放浸泡4h。在搅拌下水浴加热至料液温度为45℃时，按所取过筛的玉米蛋白粉和复合蛋白酶＝100:4.5(w/w)的比例加入复合蛋白酶4.5g，酶解12h，倒出酶解后的料液，在55℃烘箱内干燥20h，粉碎成细粉。加入95％乙醇600mL，搅拌提取4h，过滤得第一滤液和滤渣，滤液备用，向该滤渣加入600mL95％乙醇，50℃提取1.5h，过滤得第二滤液和滤渣，滤液备用。重复第二次提取过程一次，即共进行加热提取2次，过滤得第三次滤液和滤渣，滤渣干燥后为白色，微有灰黄，约60g，表明玉米黄素提取较完全；合并三次提取所得的滤液，约1600mL，自然静放沉淀3h，上清澄明，分离上清液和沉淀，沉淀干燥后黄色，约3g，上清液在65℃旋转蒸发，接近至干时，可见旋转过程中在干物质上有可与干物质分离、滚动的红棕色胶状物。将胶状物取出，干重约15g，向胶状物中加95％酒精至100mL，搅拌。在搅拌下向该液体中加入10％的氢氧化钠调pH至12，可见有白色泡沫状物漂浮在液面，取出漂浮物下面的黄色液体并用10％HCL调pH至6，在70℃旋转蒸发至15mL(含干物质3.7g)，经QuECHERS柱过滤，滤液经旋蒸得该物质1.0g，按实施例1中所述方法检测玉米黄素，其含量为80％。

实施例4

将玉米蛋白粉超微粉碎成500目的超微粉，称取2g玉米蛋白超微粉于反应装置中，加入去离子水，控制超微粉质量浓度为5％，加入占超微粉质量0.5％的酶活力为15000IU/g的木聚糖酶和占超微粉质量1.2％的酶活力为60000IU/g的米曲霉蛋白酶，在42±5℃条件下酶解5h，酶解液离心，弃上清液，得沉淀；步骤(1)中的沉淀中加入乙醇，按料液比1:15加入30mL95％的乙醇，于微波反应系统中进行提取，微波功率为480W，时间115s，温度为42±5℃，反应完毕，以10000r/min转速高速离心10min，收集上清液；上清液于-18℃下贮藏10h，室温下过低速滤纸减压抽滤，除去已呈絮状的蛋白质；滤液减压浓缩，得到膏状物，真空冷冻干燥至恒重，即得产物，按实施例1中所述方法检测玉米黄素，其含量为65％。

实施例5

取玉米蛋白粉500g(实施例1中过筛后的玉米蛋白粉)，加入水，控制料液质量体积比为1:10(体积单位为L，质量单位为kg)，加入Alcalase2.4L蛋白酶，加酶量为玉米蛋白粉质量的5％，酶解温度为50℃，pH值为8.0，酶解时间为60min。酶解结束后90℃水浴灭酶处理，并调节pH值为4.0，8000g离心30分钟。得到的粗提物沉淀用无水乙醇溶解萃取。料液比为1：10(L/kg)，提取时间为4h。萃取完成后用真空旋转蒸发仪对提取液进行旋蒸，旋蒸操作温度为60℃，旋蒸时间为25min，最终获得精制玉米黄素3.81g。按实施例1中所述方法检测玉米黄素，其含量为72％。

实施例6

取玉米蛋白粉粉碎过60目筛，取筛过的玉米蛋白粉100g，加自来水500mL拌匀；用30％NaOH溶液调pH＝7。在搅拌下水浴加热至料液温度为42℃时，按所取的过筛后的玉米蛋白粉和复合蛋白酶＝100：3(w/w)的比例加入复合蛋白酶3g，酶解24h。倒出酶解后的料液，在65℃烘箱内干燥16h。粉碎成细粉。加入500mL 95％乙醇提取12h，过滤得第一滤液和滤渣，滤液备用，向该滤渣中加入500mL 95％乙醇，55℃提取1h，过滤得第二滤液和滤渣，滤液备用，重复第二次提取过程一次，即共进行加热提取2次，过滤得第三滤液和滤渣，滤渣干燥后为白色，有轻微黄色，约60g，表明玉米黄素提取较完全，合并上述三次提取得到的滤液，约1340mL，自然静放沉淀2h，上清液体澄明，分离上清液和沉淀，沉淀干燥后约5g，为黄色，上清液在55℃旋转蒸发，接近至干时，可见旋转过程中在干物质上有可与干物质分离、滚动的红棕色胶状物。将胶状物取出，干重约14g。向胶状物中加95％酒精至100mL，搅拌，在搅拌下向该液体中加入10％的氢氧化钠调pH至11，可见有白色泡沫状物漂浮在液面，取出漂浮物下面的黄色液体并用10％HCL调pH至5。在55℃旋转蒸发至12mL(含干物质3.4g)，经QuECHERS柱过滤，滤液经旋蒸得产物0.7g，按实施例1中所述方法检测玉米黄素，其含量为71％。

实施例7

取玉米蛋白粉粉碎过60目筛，取筛过的玉米蛋白粉100g，加自来水500mL拌匀；用30％NaOH溶液调pH＝7，静放浸透3h。在搅拌下水浴加热至料液温度为42℃时，按所取的过筛后的玉米蛋白粉和复合蛋白酶＝100：3(w/w)的比例加入复合蛋白酶3g，酶解24h。倒出酶解后的料液，在65℃烘箱内干燥16h。粉碎成细粉。加入500mL 95％乙醇提取12h，过滤得第一滤液和滤渣，滤液备用，向该滤渣中加入500mL 95％乙醇提取1h，过滤得第二滤液和滤渣，滤液备用，重复第二次提取过程一次，过滤得第三滤液和滤渣，滤渣干燥后为白色，有轻微黄色，约60g，表明玉米黄素提取较完全，合并上述三次提取得到的滤液，约1340mL，自然静放沉淀2h，上清液体澄明，分离上清液和沉淀，沉淀干燥后约5g，为黄色，上清液在55℃旋转蒸发，接近至干时，可见旋转过程中在干物质上有可与干物质分离、滚动的红棕色胶状物。将胶状物取出，干重约14g。向胶状物中加95％酒精至100mL，搅拌，在搅拌下向该液体中加入10％的氢氧化钠调pH至11，可见有白色泡沫状物漂浮在液面，取出漂浮物下面的黄色液体并用10％HCL调pH至5。在55℃旋转蒸发至12mL(含干物质约3.3g)，经QuECHERS柱过滤，滤液经旋蒸得产物0.79g，按实施例1中所述方法检测玉米黄素，其含量为63％。

实施例8

取玉米蛋白粉粉碎过60目筛，取筛过的玉米蛋白粉100g，加自来水500mL拌匀；在搅拌下水浴加热至温度为42℃时，按所取的过筛后的玉米蛋白粉和复合蛋白酶＝100：3(w/w)的比例加入复合蛋白酶3g，酶解24h。倒出酶解后的料液，在65℃烘箱内干燥16h。粉碎成细粉。加入500mL 95％乙醇提取12h，过滤得第一滤液和滤渣，滤液备用，向该滤渣中加入500mL95％乙醇，55℃提取1h，过滤得第二滤液和滤渣，滤液备用，重复第二次提取过程一次，即共进行加热提取2次，过滤得第三滤液和滤渣，滤渣干燥后为白色，有轻微黄色，约60g，表明玉米黄素提取较完全，合并上述三次提取得到的滤液，约1340mL，自然静放沉淀2h，上清液体澄明，分离上清液和沉淀，沉淀干燥后约5g，为黄色，上清液在55℃旋转蒸发，接近至干时，可见旋转过程中在干物质上有可与干物质分离、滚动的红棕色胶状物。将胶状物取出，干重约14g。向胶状物中加95％酒精至100mL，搅拌，在搅拌下向该液体中加入10％的氢氧化钠调pH至11，可见有白色泡沫状物漂浮在液面，取出漂浮物下面的黄色液体并用10％HCL调pH至5。在55℃旋转蒸发至12mL(含干物质约3.3g)，经QuECHERS柱过滤，滤液经旋蒸得产物0.81g，按实施例1中所述方法检测玉米黄素，其含量为70％。

实施例9

取玉米蛋白粉粉碎过60目筛，取筛过的玉米蛋白粉100g，加自来水500mL拌匀；用30％NaOH溶液调pH＝7，静放浸透3h。在搅拌下水浴加热至料液温度为42℃时，按所取的过筛后的玉米蛋白粉和复合蛋白酶＝100：3(w/w)的比例加入复合蛋白酶3g，酶解24h。倒出酶解后的料液，在65℃烘箱内干燥16h。粉碎成细粉。加入500mL 95％乙醇提取12h，过滤得第一滤液和滤渣，滤液备用，向该滤渣中加入500mL 95％乙醇，55℃提取1h，过滤得第二滤液和滤渣，滤液备用，重复第二次提取过程一次，即共进行加热提取2次，过滤得第三滤液和滤渣，滤渣干燥后为白色，有轻微黄色，约60g，表明玉米黄素提取较完全，合并上述三次提取得到的滤液，约1340mL，自然静放沉淀2h，上清液体澄明，分离上清液和沉淀，沉淀干燥后约5g，为黄色，上清液在55℃旋转蒸发，接近至干时，可见旋转过程中在干物质上有可与干物质分离、滚动的红棕色胶状物。将胶状物取出，干重约14g。向胶状物中加95％酒精至100mL，搅拌，在搅拌下向该液体中加入10％的氢氧化钠调pH至10，可见有白色泡沫状物漂浮在液面，取出漂浮物下面的黄色液体并用10％HCL调pH至5。在55℃旋转蒸发至12mL(含干物质约3.0g)，经QuECHERS柱过滤，滤液经旋蒸得产物0.7g，按实施例1中所述方法检测玉米黄素，其含量为70％。

实施例10

取玉米蛋白粉粉碎过60目筛，取筛过的玉米蛋白粉100g，加自来水500mL拌匀；用30％NaOH溶液调pH＝7，静放浸透3h。在搅拌下水浴加热至料液温度为42℃时，按所取的过筛后的玉米蛋白粉和复合蛋白酶＝100：3(w/w)的比例加入复合蛋白酶3g，酶解24h。倒出酶解后的料液，在65℃烘箱内干燥16h。粉碎成细粉。加入500mL 95％乙醇提取12h，过滤得第一滤液和滤渣，滤液备用，向该滤渣中加入500mL 95％乙醇，55℃提取1h，过滤得第二滤液和滤渣，滤液备用，重复第二次提取过程一次，即共进行加热提取2次，过滤得第三滤液和滤渣，滤渣干燥后为白色，有轻微黄色，约60g，表明玉米黄素提取较完全，合并上述三次提取得到的滤液，约1340mL，自然静放沉淀2h，上清液体澄明，分离上清液和沉淀，沉淀干燥后约5g，为黄色，上清液在55℃旋转蒸发，接近至干时，可见旋转过程中在干物质上有可与干物质分离、滚动的红棕色胶状物。将胶状物取出，干重约14g。向胶状物中加95％酒精至100mL，搅拌，在搅拌下向该液体中加入10％的氢氧化钠调pH至13.5，可见有白色泡沫状物漂浮在液面，取出漂浮物下面的黄色液体并用10％HCL调pH至5。在55℃旋转蒸发至12mL(含干物质约3.1g)，经QuECHERS柱过滤，滤液经旋蒸得产物0.75g，按实施例1中所述方法检测玉米黄素，其含量为75％。

实施例11

取玉米蛋白粉粉碎过60目筛，取筛过的玉米蛋白粉100g，加自来水500mL拌匀；用30％NaOH溶液调pH＝7，静放浸透3h。在搅拌下水浴加热至料液温度为42℃时，按所取的过筛后的玉米蛋白粉和复合蛋白酶＝100：3(w/w)的比例加入复合蛋白酶3g，酶解24h。倒出酶解后的料液，在65℃烘箱内干燥16h。粉碎成细粉。加入500mL 95％乙醇提取12h，过滤得第一滤液和滤渣，滤液备用，向该滤渣中加入500mL 95％乙醇，55℃提取1h，过滤得第二滤液和滤渣，滤液备用，重复第二次提取过程一次，即共进行加热提取2次，过滤得第三滤液和滤渣，滤渣干燥后为白色，有轻微黄色，约60g，表明玉米黄素提取较完全，合并上述三次提取得到的滤液，约1340mL，自然静放沉淀2h，上清液体澄明，分离上清液和沉淀，沉淀干燥后约5g，为黄色，上清液在55℃旋转蒸发，接近至干时，可见旋转过程中在干物质上有可与干物质分离、滚动的红棕色胶状物。将胶状物取出，干重约14g。向胶状物中加95％酒精至100mL，搅拌，在55℃旋转蒸发至12mL(含干物质约2.5g)，经QuECHERS柱过滤，滤液经旋蒸得产物0.68g，按实施例1中所述方法检测玉米黄素，其含量为65％。

实施例12

取玉米蛋白粉粉碎过60目筛，取筛过的玉米蛋白粉100g，加自来水500mL拌匀；用30％NaOH溶液调pH＝7，静放浸透3h。在搅拌下水浴加热至料液温度为42℃时，按所取的过筛后的玉米蛋白粉和复合蛋白酶＝100：3(w/w)的比例加入复合蛋白酶3g，酶解24h。倒出酶解后的料液，在65℃烘箱内干燥16h。粉碎成细粉。加入500mL 95％乙醇提取12h，过滤得第一滤液和滤渣，滤液备用，向该滤渣中加入500mL 95％乙醇，55℃提取1h，过滤得第二滤液和滤渣，滤液备用，重复第二次提取过程一次，即共进行加热提取2次，过滤得第三滤液和滤渣，滤渣干燥后为白色，有轻微黄色，约60g，表明玉米黄素提取较完全，合并上述三次提取得到的滤液，约1340mL，自然静放沉淀2h，上清液体澄明，分离上清液和沉淀，沉淀干燥后约5g，为黄色，上清液在55℃旋转蒸发，接近至干时，可见旋转过程中在干物质上有可与干物质分离、滚动的红棕色胶状物。将胶状物取出，干重约14g。向胶状物中加95％酒精至100mL，搅拌，在搅拌下向该液体中加入10％的氢氧化钠调pH至11，可见有白色泡沫状物漂浮在液面，取出漂浮物下面的黄色液体并用10％HCL调pH至4。在55℃旋转蒸发至12mL(含干物质约3.3g)，经QuECHERS柱过滤，滤液经旋蒸得产物0.81g，按实施例1中所述方法检测玉米黄素，其含量为70％。

实施例13

取玉米蛋白粉粉碎过60目筛，取筛过的玉米蛋白粉100g，加自来水500mL拌匀；用30％NaOH溶液调pH＝7，静放浸透3h。在搅拌下水浴加热至料液温度为42℃时，按所取的过筛后的玉米蛋白粉和复合蛋白酶＝100：3(w/w)的比例加入复合蛋白酶3g，酶解24h。倒出酶解后的料液，在65℃烘箱内干燥16h。粉碎成细粉。加入500mL 95％乙醇提取12h，过滤得第一滤液和滤渣，滤液备用，向该滤渣中加入500mL 95％乙醇，55℃提取1h，过滤得第二滤液和滤渣，滤液备用，重复第二次提取过程一次，即共进行加热提取2次，过滤得第三滤液和滤渣，滤渣干燥后为白色，有轻微黄色，约60g，表明玉米黄素提取较完全，合并上述三次提取得到的滤液，约1340mL，自然静放沉淀2h，上清液体澄明，分离上清液和沉淀，沉淀干燥后约5g，为黄色，上清液在55℃旋转蒸发，接近至干时，可见旋转过程中在干物质上有可与干物质分离、滚动的红棕色胶状物。将胶状物取出，干重约14g。向胶状物中加95％酒精至100mL，搅拌，在搅拌下向该液体中加入10％的氢氧化钠调pH至10，可见有白色泡沫状物漂浮在液面，取出漂浮物下面的黄色液体并用10％HCL调pH至7。在55℃旋转蒸发至12mL(含干物质约3.3g)，经QuECHERS柱过滤，滤液经旋蒸得产物0.8g，按实施例1中所述方法检测玉米黄素，其含量为73％。

实施例14

取玉米蛋白粉粉碎过60目筛，取筛过的玉米蛋白粉100g，加自来水500mL拌匀；用30％NaOH溶液调pH＝7，静放浸透3h。在搅拌下水浴加热至料液温度为42℃时，按所取的过筛后的玉米蛋白粉和复合蛋白酶＝100：3(w/w)的比例加入复合蛋白酶3g，酶解24h。倒出酶解后的料液，在65℃烘箱内干燥16h。粉碎成细粉。加入500mL 95％乙醇提取12h，过滤得第一滤液和滤渣，滤液备用，向该滤渣中加入500mL 95％乙醇，55℃提取1h，过滤得第二滤液和滤渣，滤液备用，重复第二次提取过程一次，即共进行加热提取2次，过滤得第三滤液和滤渣，滤渣干燥后为白色，有轻微黄色，约60g，表明玉米黄素提取较完全，合并上述三次提取得到的滤液，约1340mL，自然静放沉淀2h，上清液体澄明，分离上清液和沉淀，沉淀干燥后约5g，为黄色，上清液在55℃旋转蒸发，接近至干时，可见旋转过程中在干物质上有可与干物质分离、滚动的红棕色胶状物。将胶状物取出，干重约14g。向胶状物中加95％酒精至100mL，搅拌，在搅拌下向该液体中加入10％的氢氧化钠调pH至10，可见有白色泡沫状物漂浮在液面，取出漂浮物下面的黄色液体在55℃旋转蒸发至12mL(含干物质约3.3g)，经QuECHERS柱过滤，滤液经旋蒸得产物0.81g，按实施例1中所述方法检测玉米黄素，其含量为69％。

实施例15

玉米蛋白粉100g与自来水500mL混合，35℃搅拌1.5h，调pH＝9。加入中性蛋白酶3.5g[蛋白粉:中性蛋白酶＝100:3.5(w/w)]，酶解18h。倒出酶解液，在55℃旋转蒸发除水，干燥后磨成细粉。加入无水乙醇800mL，在料液温度70℃搅拌回流提取2h。2500r/min离心得上清液和沉渣。向渣中再加入与上次同量的无水乙醇，重复以上提取和离心过程2次。离心后的沉渣干燥后为白色，重32g，表明玉米黄素提取较为完全，将3次上清液合并，总体积为2330mL。上清液经旋转蒸发除去乙醇后趁热立即倒出流动的棕红色膏状物(该膏状物在酶解的玉米蛋白之上，两者始终不混合，分离明显)。将胶状物取出，干重约13g。向胶状物中加95％酒精至100mL，搅拌，在搅拌下向该液体中加入10％的氢氧化钠调pH至11，可见有白色泡沫状物漂浮在液面，取出漂浮物下面的黄色液体并用10％HCL调pH至5。在55℃旋转蒸发至12mL(含干物质3.2g)，经QuECHERS柱过滤，滤液经旋蒸得产物0.85g，产物经检测玉米黄素含量为76％。

实施例16

取玉米蛋白粉粉碎过60目筛，取筛过的玉米蛋白粉100g，加自来水500mL拌匀；用30％NaOH溶液调pH＝7，静放浸透3h。在搅拌下水浴加热至料液温度为42℃时，按所取的过筛后的玉米蛋白粉和复合蛋白酶＝100：3(w/w)的比例加入复合蛋白酶3g，酶解24h。倒出酶解后的料液，在65℃烘箱内干燥16h。粉碎成细粉。加入500mL 95％乙醇提取12h，过滤得第一滤液和滤渣，滤液备用，向该滤渣中加入500mL 95％乙醇，55℃提取1h，过滤得第二滤液和滤渣，滤液备用，重复第二次提取过程一次，即共进行加热提取2次，过滤得第三滤液和滤渣，滤渣干燥后为白色，有轻微黄色，约60g，表明玉米黄素提取较完全，合并上述三次提取得到的滤液，约1340mL，自然静放沉淀2h，上清液体澄明，分离上清液和沉淀，沉淀干燥后约5g，为黄色，上清液在55℃旋转蒸发，接近至干时，可见旋转过程中在干物质上有可与干物质分离、滚动的红棕色胶状物。去除胶状物，干重约14g。向剩余物质中加95％酒精至100mL，搅拌，在搅拌下向该液体中加入10％的氢氧化钠调pH至11，可见有白色泡沫状物漂浮在液面，取出漂浮物下面的黄色液体并用10％HCL调pH至5。在55℃旋转蒸发至12mL(含干物质3.2g)，经QuECHERS柱过滤，滤液经旋蒸得产物0.83g，产物经检测玉米黄素含量为78％。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

一种从玉米蛋白粉酶解胶状物中提取玉米黄素的方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。