专利摘要

本发明涉及微生物技术领域，公开了一种酿酒酵母菌株及其应用。本发明提供一株高产虾青素的诱变酿酒酵母菌株，该诱变菌株的虾青素产量相对于出发菌株有明显提高，其中摇瓶发酵虾青素产量提高了3.98倍，达到了65.93mg/L，虾青素在类胡萝卜素中所占的比例提高了1.48倍，达到了68.56％。并且经过对发酵工艺条件的优化，使5L发酵罐中的虾青素产量最高达到了404.78mg/L。

权利要求

1.一种生产虾青素的方法，其特征在于，将保藏编号为CGMCC No.17913的酿酒酵母菌株接种到SC固体培养基中活化，然后再转接到SC液体培养基中制备种子培养液，最后将种子培养液转接到YPD发酵培养基中进行发酵罐发酵；

发酵期间，葡萄糖作为碳源以流加方式加入，并控制在0-1 g/L范围内，菌体生长进入停滞期时，加入D-(+)-半乳糖诱导剂，同时停止流加葡萄糖，进入虾青素合成阶段；此时发酵罐中碳源切换为乙醇，同样通过流加方式添加，并控制发酵罐内的乙醇浓度在5 g/L以下；

发酵期间，10 h时加入1.2倍酵母浸粉，65 h时加入1.0倍酵母浸粉，75 h时加入0.8倍酵母浸粉，120 h时加入0.3倍酵母浸粉，后期一直维持在0.3倍浓度，当细胞生长进入停滞期停止补料；所述1.2倍酵母浸粉，浓度是400 g/L，体积为75 ml；

以D-(+)-半乳糖诱导剂添加时刻为发酵过程的菌株生长阶段和虾青素生产阶段的分界点，菌株生长阶段温度为30℃，虾青素生产阶段温度为20℃；整个过程发酵至细胞OD600基本稳定，虾青素合成不再增加。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，将保藏编号为CGMCC No.17913的酿酒酵母菌株划线于SC固体培养基进行活化培养，然后接种到SC液体培养基培养至OD600=6-7，再按4%接种量转接到SC液体培养基培养至对数生长期中期制备成种子培养液，最后将种子培养液按10%接种量转接到YPD发酵培养基中进行发酵罐发酵。

3.根据权利要求1或2所述方法，其特征在于，所述YPD发酵培养基的初始葡萄糖浓度为20g/L。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，更具体的说是涉及一种酿酒酵母菌株及其应用。

背景技术

虾青素(Astaxanthin，C40H52O4，分子量为596.84)是一种广泛存在于微生物和海洋生物中的天然类胡罗卜素，也是类胡萝卜素合成的最高级别产物，依据两个手性碳在β-紫罗酮环上的存在形式，可以分为3种构型(3S,3’S)、(3R,3’S)、(3R,3’R)。虾青素具有很强的抗氧化能力，可以通过清除细胞内的活性氧防止链式反应、抑制脂质过氧化来保护膜结构，从而起到防止氧化损伤的效果。与其他类胡萝卜素不同的是，虾青素同时连接细胞的内膜和外膜，能同时清扫细胞内外膜的活性氧，因此虾青素比其他的类胡萝卜素具有更强的抗氧化性，其抗氧化能力是维生素C的65倍，β-胡萝卜素的54倍，角黄素、玉米黄质和叶黄素的10倍，维生素E的100倍。正是因为虾青素具有独特的化学结构和性质，使得其具有减缓衰老、抗肿瘤、增强免疫力、预防心血管疾病等功能，在食品、医药、保健品以及水产养殖等行业具有巨大的市场价值。作为市场规模仅次于β-胡萝卜素和叶黄素的第三大类胡萝卜素，虾青素的市场份额占到了类胡萝卜素的29％，预计2025年市场规模达到25.7亿美元。广阔的市场需求使得虾青素的研究和生产具有光明的前景。

目前，虾青素的来源主要有化学合成、藻类和红法夫酵母生物合成。化学合成的虾青素和天然虾青素构型不同，其抗氧化能力仅为天然虾青素的1/3，另外人们还担心合成虾青素的不同立体异构体和一些潜在的合成中间体的安全性。雨生红球藻(Haematococcuspluvialis)和红发夫酵母(Xanthophyllomyces dendrorhous)是目前工业上生产虾青素的主要菌种。然而雨生红球藻生长周期缓慢、细胞密度低，导致经济成本居高不下。红发夫酵母作为自然界中存在的天然生产虾青素的微生物，但由于红发夫酵母生产的虾青素为(3R,3’R)构型，抗氧化能力较低，限制了其在工业生产中的应用。因此，研究人员将目光转向其他微生物细胞工厂，用来生物合成虾青素。2017年，Kildegaard等人在解脂酵母中构建了虾青素合成路径，并通过增加CrtZ的拷贝数，平衡代谢流量提高虾青素的生产，最终使解脂酵母中虾青素产量达到了54.6mg/L。2018年，Park等人将截短的BKT基因(trCrBKT)定位到细胞膜，过表达由FVSEOF软件鉴定的ispD和ispF基因，并且优化发酵条件，使5L发酵罐中大肠杆菌的虾青素产量达到了385.04mg/L。

酿酒酵母作为一种公认的安全模式微生物，遗传背景清楚、分子操作简单，在酿酒、食品烘焙、药品、保健品等生产中被广泛应用。相比大肠杆菌，它的菌体维生素、蛋白质含量高，可作食用药用和饲料酵母；相比藻类，它的生长周期更短且更易培养。因此，实现虾青素在酿酒酵母中的高产将会在类胡萝卜素产业化上展现极大的竞争力。然而，截止目前公开报道的酿酒酵母中的虾青素产量依然未达到工业化生产水平。2017年，于宏巍课题组通过突变GGPP合酶增加前体供应以及调整限速酶之间的拷贝数平衡代谢通量等方法，将酿酒酵母的虾青素产量提高至47.18mg/L的较高水平。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种经过诱变获得的酿酒酵母菌株，使其虾青素产量得到显著提高；

本发明的另外一个目的在于提供上述诱变后的酿酒酵母菌株在生产相关化学品中的应用；

本发明的另外一个目的在于提供利用上述诱变后的酿酒酵母菌株生产虾青素的方法。

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

一种酿酒酵母菌株，保藏编号为CGMCC No.17913，已于2019年6月10日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名为酿酒酵母Saccharomycescerevisiae。

本发明以一株生产虾青素的酿酒酵母SyBE_Sc14CY10为出发菌株，运用常压室温等离子体诱变技术(Atmospheric and room temperature plasma,ARTP)对SyBE_Sc14CY10进行物理诱变，获得酿酒酵母突变文库，然后通过摇瓶发酵和HPLC测定虾青素产量，产量较高的三株突变菌为进一步优化的对象；然后以虾青素产量较高的三株突变菌为基础，通过双氧水施加的氧化压力进行化学诱变(ChemicalMutagenesis,CM)，连续诱变21代为一个周期，再次获得酿酒酵母突变文库，同样通过摇瓶发酵和HPLC测定虾青素的产量，产量较高的三株突变菌作为进一步优化的对象；依此循环，以每一周期物理或化学诱变获得虾青素产量较高的三株酵母为基础，交替进行物理或者化学诱变，最终获得了一株高产虾青素的诱变酿酒酵母菌株，命名为SyBE_Sc04030020。

经过发酵试验验证，SyBE_Sc04030020虾青素产量和比例均有明显提高，其中摇瓶发酵虾青素产量提高了3.98倍，达到了65.93mg/L，虾青素在类胡萝卜素中所占的比例提高了1.48倍，达到了68.56％。并且经过对发酵工艺条件的优化，使5L发酵罐中的虾青素产量最高可达到404.78mg/L。上述各产量数据在目前已知的酿酒酵母虾青素产量中属最高产量。

基于上述技术效果，本发明提供了所述酿酒酵母菌株在生产虾青素或以虾青素为中间化学品的其他化学品中的应用；以及在制备生产虾青素的微生物制剂或制备生产以虾青素为中间化学品的其他化学品的微生物制剂中的应用。

在本发明中提供了两种发酵生产虾青素的方法，第一种生产虾青素的方法为将保藏编号为CGMCC No.17913的酿酒酵母菌株接种到SC固体培养基中活化，然后再转接到SC液体培养基中制备种子培养液，最后将种子培养液转接到YPDG发酵培养基中发酵，至细胞OD600基本稳定，虾青素合成不再增加。

在具体实施过程中，将保藏编号为CGMCC No.17913的酿酒酵母菌株划线于SC固体培养基进行活化培养，然后接种到SC液体培养基培养至OD600＝5-8，再按OD600＝0.2转接到SC液体培养基培养至OD600＝6.5-7.5制备成种子培养液，最后将种子培养液按终OD600＝0.1转接到YPDG发酵培养基中30℃、250rpm摇床振荡发酵，至细胞OD600基本稳定，虾青素合成不再增加。经过HPLC检测，摇瓶发酵中，虾青素的产量为65.93mg/L；

第二种生产虾青素的方法为将保藏编号为CGMCC No.17913的酿酒酵母菌株接种到SC固体培养基中活化，然后再转接到SC液体培养基中制备种子培养液，最后将种子培养液转接到YPD发酵培养基中发酵，至细胞OD600基本稳定，虾青素合成不再增加；

在具体实施过程中，将保藏编号为CGMCC No.17913的酿酒酵母菌株划线于SC固体培养基进行活化培养，然后接种到SC液体培养基培养至OD600＝6-7，再按4％接种量转接到SC液体培养基培养至对数生长期中期制备成种子培养液，最后将种子培养液按10％接种量转接到YPD发酵培养基中进行发酵罐发酵，至细胞OD600基本稳定，虾青素合成不再增加。

发酵期间，葡萄糖作为碳源以流加方式加入，并控制在0-1g/L范围内(不含0)，菌体生长进入停滞期时，加入D-(+)-半乳糖诱导剂，同时停止流加葡萄糖，进入虾青素合成阶段；此时发酵罐中碳源切换为乙醇，同样通过流加方式添加，并控制发酵罐内的乙醇浓度在5g/L以下；

其中，影响发酵生物量的重要因素还有发酵培养基中的氮源。本发明优选以酵母浸粉为氮源，为了避免氮源补料过量，采用浓度梯度递减的间歇补料方式向补加酵母浸粉，每隔一段时间向发酵罐中加入一定体积的酵母浸粉母液(以初始YPD发酵培养基中酵母浸粉的浓度为1.0×)。具体补料过程如下：加入1.2×酵母浸粉在发酵的第10h，65h加入1.0×酵母浸粉、75h加入0.8×酵母浸粉，120h加入0.3×酵母浸粉，后期一直维持在0.3×浓度，180h(细胞生长进入停滞期)停止补料。在发酵10h时开始每升补加1.2×酵母浸粉，总共即30g酵母浸粉，母液浓度是400g/L，30g酵母浸粉体积为75ml。在75h细胞生长进入停滞期，OD600增长减慢，降低氮源加入至0.8×。发酵120h，菌株生长增长再度变缓，降低氮源加入至0.3×。

分批补料发酵试验结果显示，虾青素产量达到226.19mg/L，相比摇瓶发酵产量(65.93mg/L)提高了2.43倍。

为了进一步提高虾青素产量，继续对发酵罐发酵条件进行优化。除了发酵培养基的配比组成和添加方式，温度也是影响菌株生长和代谢的关键因素。在上述分批补料发酵基础上，以加入D-(+)-半乳糖诱导剂为分界点，加入之前的发酵温度为30℃，此条件下最有利于细胞生长。等细胞生长进入停滞期，此时开始加D-(+)-半乳糖诱导虾青素合成路径基因开始表达，进入发酵第二阶段，将温度降至20℃，以有利于虾青素的积累，最终虾青素产量达到了404.78mg/L，相对于摇瓶发酵产量提高了5.14倍。

由以上技术方案可知，本发明提供一株高产虾青素的诱变酿酒酵母菌株，该诱变菌株的虾青素产量相对于出发菌株有明显提高，其中摇瓶发酵虾青素产量提高了3.98倍，达到了65.93mg/L，虾青素在类胡萝卜素中所占的比例提高了1.48倍，达到了68.56％。并且经过对发酵工艺条件的优化，使5L发酵罐中的虾青素产量最高达到了404.78mg/L。

生物保藏说明

SyBE_Sc04030020，分类命名：酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae，于2019年6月10日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.17913。

附图说明

图1所示为本发明诱变菌株和出发菌株的摇瓶发酵虾青素产量；

图2所示为本发明诱变菌株和出发菌株的摇瓶发酵类胡萝卜素中各化学品的占比图；

图3所示为本发明诱变菌株发酵罐发酵的检测结果；

图4所示为优化温度后本发明诱变菌株发酵罐发酵的检测结果。

具体实施方式

本发明公开了一种酿酒酵母菌株及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述酿酒酵母菌株和应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的酿酒酵母菌株和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

下面结合实施例，进一步阐述本发明。

实施例1：摇瓶发酵试验

发酵：将-80℃甘油保存的诱变酿酒酵母菌株SyBE_Sc04030020划线于SC固体培养基进行活化培养，然后接种到5mlSC液体培养基中，培养18h至OD600＝5-8，再按OD600＝0.2转接到二级种子培养基试管中。14-16h后OD600达到7左右后，取种子培养液按终OD600＝0.1转接到50mL YPDG培养基中发酵，30℃、250rpm摇床振荡培养96h；

HPLC检测：取500uL发酵后的菌液加入1.5mLEP管，12000r离心2min，倒掉上清，加入1ml无菌水重悬细胞，离心倒上清加入1ml 3M HCl重悬细胞，沸水浴3min，冰浴3min，重复3次，离心水洗两遍，弃上清，加入1ml丙酮重悬细胞后，加入少量石英砂涡旋振荡10min，将丙酮提取液12000r离心5min后,使用0.2μm有机滤膜过滤后，取200μL加到样品瓶中进行HPLC高效液相色谱检测。将虾青素的标品分别用丙酮梯度稀释到50mg/l、25mg/L、12.5mg/L、6.25mg/L、3.125mg/L。测定参数的设置，设定波长为：450nm(番茄红素)，470nm(虾青素)。色谱柱C18柱。流动相A：乙睛：水＝9:1；流动相B：甲醇：异丙醇＝3:2。柱温25℃，样品温度20℃。

结果如图1和图2所示，虾青素产量为65.93mg/L，相对于出发菌提高了3.98倍，虾青素在类胡萝卜素中所占的比例提高了1.48倍，达到了68.56％。

实施例2：5L发酵罐发酵试验

发酵基础培养基为初始葡萄糖浓度为20g/L的YPD培养基(1％酵母膏，2％蛋白胨，2％葡萄糖)，在实验室5L发酵罐中对SyBE_Sc04030020进行分批补料发酵试验。一级种子培养：取SyBE_Sc04030020甘油菌200ul接种至装有5mL SC种子培养基的试管中，30℃、250rpm培养至OD600＝6-7；二级种子培养：将一级种子按4％接种量转接至装有50mL SC培养基的250mL摇瓶中，30℃、250rpm条件下培养至对数生长中期(OD600＝5-6)。

发酵罐接种：以10％接种量(250ml的二级种子，初始OD600约0.5)将二级种子转接至装有2.25L发酵培养基的5L发酵罐中开始发酵；发酵罐初始装液量为2.5L，初始培养基为含2％葡萄糖的YPD。

发酵罐参数设置：发酵温度为30℃，pH控制在5.8，通气量设为2.5vvm，DO为40％，转速范围400-600rpm并将搅拌关联DO。整个发酵过程分为菌株生长阶段和虾青素生产阶段，D-(+)-半乳糖诱导剂添加时刻即为两阶段的分界点。

菌株生长阶段为保证碳源的持续供应，葡萄糖以流加方式加入，并控制在0-1g/L范围内，以尽可能地减少副产物的产生，因为培养基中多余的葡萄糖会在酵母溢流代谢中被转化为甘油、乙醇和乙酸等副产物，从而导致细胞得率降低。菌体生长进入停滞期时，加入终浓度为20g/L D-(+)-半乳糖诱导剂，同时停止流加葡萄糖，进入虾青素合成阶段。此时发酵罐中碳源切换为乙醇，同样通过补料泵流加方式添加，并控制发酵罐内的乙醇浓度在5g/L以下。

此外，影响发酵生物量的重要因素还有发酵培养基中的氮源。本发明以酵母浸粉为氮源，为了避免氮源补料过量，采用浓度梯度递减的间歇补料方式向发酵罐中补加酵母浸粉，每隔一段时间向发酵罐中加入一定体积的酵母浸粉母液(以初始培养基中酵母浸粉的浓度为1.0×)。具体补料过程如下：加入1.2×酵母浸粉在发酵的第10h，65h加入1.0×酵母浸粉、75h加入0.8×酵母浸粉，120h加入0.3×酵母浸粉,后期一直维持在0.3×浓度，180h停止补料。在发酵10h时开始每升补加1.2×酵母浸粉，总共即30g酵母浸粉，母液浓度是400g/L，30g酵母浸粉体积为75ml。在75h细胞生长进入停滞期，OD600增长减慢，降低氮源加入至0.8×。发酵120h，菌株生长增长再度变缓，降低氮源加入至0.3×。

分批补料发酵试验结果如图3所示，最终5L发酵罐虾青素产量达到226.19mg/L，相比摇瓶发酵产量(65.93mg/L)提高了2.43倍。

实施例3：发酵温度优化后的5L发酵罐发酵试验

为了进一步提高虾青素产量，继续对发酵罐发酵条件进行优化。除了发酵培养基的配比组成和添加方式，温度也是影响菌株生长和代谢的关键因素，因此在实施例2基础上对发酵过程的温度进行优化。具体实施步骤：将发酵过程分为两阶段，第一阶段的温度控制为30℃，此条件下最有利于细胞生长。等细胞生长进入停滞期，此时开始加D-(+)-半乳糖诱导虾青素合成路径基因开始表达，进入发酵第二阶段，将温度降至20℃，以有利于虾青素的积累，发酵过程如图4所示，最终虾青素产量达到了404.78mg/L，相对于摇瓶发酵产量提高了5.14倍。

因此，高产虾青素突变菌株SyBE_Sc04030020在5L发酵罐中经工艺优化，最佳温度条件控制为：以D-(+)-半乳糖诱导剂添加时刻为发酵过程的菌株生长阶段和虾青素生产阶段的分界点，菌株生长阶段温度为30℃，虾青素生产阶段温度为20℃。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

一种酿酒酵母菌株及其应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。