专利摘要

本发明公开一种短乳杆菌菌株及其培养方法和用途，该短乳杆菌菌株为分离自萝卜泡菜的革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性，且形状为短杆状的短乳杆菌PL6‑1，其中包含耐热性谷氨酸脱羧酶。同时，本发明基于该菌株开发了用于提高其发酵性能的白菜提取液培养基及生产γ‑氨基丁酸的方法。该白菜提取液培养基包含20‑35重量份白菜提取液、2‑6重量份葡萄糖、0.2‑4.5重量份酵母提取液和0.3‑2.2重量份金属盐。本发明的培养基能够大大降低γ‑氨基丁酸生产成本，同时显著提高γ‑氨基丁酸的产量和转化率。

权利要求

1.一种短乳杆菌菌株，其特征在于，其为分离自萝卜泡菜的革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性，且形状为短杆状的短乳杆菌PL6-1，其中包含耐热性谷氨酸脱羧酶。

2.根据权利要求1所述的短乳杆菌菌株，其特征在于，所述耐热性是指在pH值4.5的0.2mol/L吡啶-HCl缓冲液，50-90℃温度条件下保温处理后，谷氨酸脱羧酶具有酶活性。

3.根据权利要求1所述的短乳杆菌菌株，其特征在于，所述菌株于2020年5月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.19868。

4.一种用于培养含有耐热性谷氨酸脱羧酶的短乳杆菌的方法，其特征在于，包括在适于菌株生长的环境下使含有耐热性谷氨酸脱羧酶的短乳杆菌在包含白菜提取液、葡萄糖、酵母提取液和金属盐的培养基中生长或增殖的步骤。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述培养基中包含20-35重量份白菜提取液、2-6重量份葡萄糖、0.2-4.5重量份酵母提取液和0.3-2.2重量份金属盐。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述金属盐包括乙酸钠、柠檬酸钠、硫酸铵、硫酸镁和硫酸锰。

7.根据权利要求4-6任一项所述的方法，其特征在于，所述白菜提取液为白菜废弃物提取液。

8.一种白菜提取液培养基，其特征在于，包含20-35重量份白菜提取液、2-6重量份葡萄糖、0.2-4.5重量份酵母提取液和0.3-2.2重量份金属盐。

9.根据权利要求1-3任一项所述的短乳杆菌菌株在制备泡菜和果块气泡水中的用途。

10.一种生产γ-氨基丁酸的方法，其特征在于，包括在白菜提取液培养基中发酵短乳杆菌菌株的步骤；其中，所述白菜提取液培养基包含20-35重量份白菜提取液、2-6重量份葡萄糖、0.2-4.5重量份酵母提取液、0.3-2.2重量份金属盐和5-15重量份谷氨酸钠；所述短乳杆菌菌株为根据权利要求1-3任一项所述的短乳杆菌菌株。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物发酵领域，具体地涉及一种新型短乳杆菌菌株及其培养方法和用途。

背景技术

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)是一种天然存在的四碳非蛋白质氨基酸，对中枢神经性疾病、高血压、癌症、糖尿病、人体免疫力等都具有调节作用。除植物富集外，食品级GABA主要通过微生物谷氨酸脱羧酶(glutamate decarboxylase,GAD)作用底物谷氨酸生产。乳酸菌普遍被认为安全无毒，且对人体具有较好的益生效果，利用乳酸菌发酵生产GABA是一种比较安全理想的生产方式，具有成本低、含量高及安全可用于食品的优点。

利用微生物发酵来生产γ-氨基丁酸是一种高效的方法。目前已公开了多种用于发酵生产γ-氨基丁酸的细菌。例如CN106479932A即公开了一种产γ-氨基丁酸的戊糖乳杆菌。另外，还公开了多种用于发酵生产γ-氨基丁酸的短乳杆菌。例如，CN103966139A公开了四川泡菜中一种高产γ-氨基丁酸的短乳杆菌。该菌分离于四川泡菜，具有在含谷氨酸钠的培养基中产生γ-氨基丁酸的能力。但该菌株利用糙米粉为培养基，虽然降低了成本，但是其产量仍达不到高产的要求。再例如，CN101333508A公开了一种高产γ-氨基丁酸的短乳杆菌，其培养基为MRSG液体培养基，于25-30℃培养60-90h，发酵液中的γ-氨基丁酸达到50-145mM。另外，CN1673351A公开了一种产γ-氨基丁酸的短乳杆菌，其在MRS发酵培养基中的产量为2g/L，在GYP发酵培养基中的产量为4g/L。

微生物培养时，培养基的选择要考虑生产成本、细胞生产效率和易收获性。综上所述，目前仍需要以更低成本高产γ-氨基丁酸的技术。

发明内容

为解决现有技术中的至少部分技术问题，本发明提供一种短乳杆菌菌株及其培养方法和用途。具体地，本发明包括以下内容。

本发明的第一方面，提供一种短乳杆菌菌株，其为分离自萝卜泡菜的革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性，且形状为短杆状的短乳杆菌PL6-1，其中包含耐热性谷氨酸脱羧酶。

根据本发明的短乳杆菌菌株，优选地，所述耐热性是指在pH值4.5的0.2mol/L吡啶-HCl缓冲液，50-90℃温度条件下保温处理后，谷氨酸脱羧酶具有酶活性。

根据本发明的短乳杆菌菌株，优选地，所述菌株于2020年5月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.19868。

本发明的第二方面，提供一种用于培养含有耐热性谷氨酸脱羧酶的短乳杆菌的方法，其包括在适于菌株生长的环境下使含有耐热性谷氨酸脱羧酶的短乳杆菌在包含白菜提取液、葡萄糖、酵母提取液和金属盐的培养基中生长或增殖的步骤。

根据本发明的用于培养含有耐热性谷氨酸脱羧酶的短乳杆菌的方法，优选地，所述培养基中包含20-35重量份白菜提取液、2-6重量份葡萄糖、0.2-4.5重量份酵母提取液和0.3-2.2重量份金属盐。

根据本发明的用于培养含有耐热性谷氨酸脱羧酶的短乳杆菌的方法，优选地，所述金属盐包括乙酸钠、柠檬酸钠、硫酸铵、硫酸镁和硫酸锰。

根据本发明的用于培养含有耐热性谷氨酸脱羧酶的短乳杆菌的方法，优选地，所述白菜提取液为白菜废弃物提取液。

本发明的第三方面，提供一种白菜提取液培养基及其用途，该白菜提取液培养基包含20-35白菜提取液、2-6重量份葡萄糖、0.2-4.5重量份酵母提取液和0.3-2.2重量份金属盐。

根据本发明的白菜提取液培养基，优选地，所述培养基用于乳酸菌的增殖培养及相关代谢产物如γ-氨基丁酸的生产。

本发明的第四方面，提供一种生产γ-氨基丁酸的方法，其包括在白菜提取液培养基中发酵短乳杆菌菌株的步骤；其中，所述白菜提取液培养基包含20-35重量份白菜提取液、2-6重量份葡萄糖、0.2-4.5重量份酵母提取液、0.3-2.2重量份金属盐和5-15重量份谷氨酸钠；所述短乳杆菌菌株为根据第一方面所述的短乳杆菌菌株。

本发明的短乳杆菌菌株为革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性，包含耐热性谷氨酸脱羧酶，并具有优异的发酵特性，其γ-氨基丁酸(GABA)产量以及转化率显著高于其他产γ-氨基丁酸菌株。该菌株的谷氨酸脱羧酶(GAD)具有较好的pH和温度耐受性，在较宽pH和温度范围内依然保持较高的酶活性质，具有理想的热稳定性，同时该菌株具有一定的抑菌性和耐酸性能。

此外，本发明人基于该菌株通过大量实验开发了一种用于提高其发酵性能的白菜提取液培养基，本发明的培养基与现有用于产GABA的MRS培养基(De Mon,Rogosa andSharp)的结果基本一致，目前研究中常用的MRS培养基成本较高，而本发明的培养基成本是MRS培养基的1/20。因此，该培养基有望替代MRS培养基用于工业乳酸菌发酵和GABA生产，降低食品级GABA的生产成本。

基于本发明的白菜提取液培养基，本发明人通过一系列的优化，在降低GABA生产成本的同时提高了GABA的产量和转化率。本发明的菌株在白菜提取液中发酵生产GABA反应完成后，发酵液中的主要成分即为GABA、白菜提取液，可大大降低发酵后期GABA的分离提纯等耗费的人力物力，进一步降低生产GABA的成本。为食品级GABA的工业化生产提供有力的技术支撑，同时实现白菜废弃物的综合利用。

附图说明

图1为Lactobacillus brevis PL6-1的电镜图。

图2为Lactobacillus brevis PL6-1的革兰氏染色显微图。

图3为发酵液中的谷氨酸和GABA的高效液相色谱图。

图4为白菜废弃物综合利用流程。

图5为Lactobacillus brevis PL6-1所含GAD酶的最适pH测定结果。

图6为Lactobacillus brevis PL6-1所含GAD酶的最适温度的测定结果。

图7为Lactobacillus brevis PL6-1的GAD酶在50-90℃的热稳定性(其中RA表示相对活性)。

图8为Lactobacillus brevis PL6-1的GAD酶的log D-T曲线图。

图9为Lactobacillus brevis PL6-1发酵生产萝卜-海藻泡菜中GABA的液相色谱图(黑色为标准品，淡绿色为添加海藻泡菜图谱)。

图10为接种Lactobacillus brevis PL6-1发酵泡菜的亚硝酸盐含量变化。

图11为萝卜-海藻泡菜感官评定图。

图12为天然发酵果块气泡水产品工艺流程图。

图13为发酵苹果块中的乳酸菌数。

图14为发酵苹果块酸度变化图。

图15为发酵果块感官评价。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。除非另有说明，否则“％”为基于重量的百分数。

本发明中，术语“白菜提取液培养基”是指以白菜提取液为主要成分的培养基，其用于本发明的短乳杆菌的发酵。因此其含义与“用于短乳杆菌发酵的培养基”具有相同含义。本文有时简称为“本发明的培养基”。

CGMCC是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的缩写，是根据国际认可用于专利程序的微生物保存的布达佩斯条约用于保存微生物菌株目的的国际保藏机构，其地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

本发明提供一种短乳杆菌菌株、用于培养短乳杆菌的方法、一种白菜提取液培养基、短乳杆菌菌株在制备泡菜和果块气泡水中的用途以及生产γ-氨基丁酸的方法，在提高GABA产量、产率的同时，大大降低生产成本，具体如下：

[短乳杆菌菌株]

本发明的第一方面，提供一种短乳杆菌菌株，有时称为“本发明的菌株”，其为分离自萝卜泡菜的革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性，且形状为短杆状的短乳杆菌PL6-1，其中包含耐热性谷氨酸脱羧酶。

优选地，该菌株于2020年5月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.19868，保藏地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

本发明的菌株含有耐热性谷氨酸脱羧酶。优选地，耐热性是指在50-90℃条件下孵育GAD酶3h，测定酶的剩余活性(本发明有时也称为“剩余酶活”)。酶活测定采用pH值4.5的0.2mol/L吡啶-HCl缓冲液中进行测定。优选地，本发明菌株中含有的谷氨酸脱羧酶在60℃孵育1h、2h和3h后，GAD活性分别为90.49％、78.78％和64.20％；50℃下孵育1h、2h和3h后分别为98.49％、96.29％和94.29％。本发明的GAD热稳定性明显高于以往的研究。

本发明的菌株具有优异的发酵性能，优选地，该菌株在MRS培养基中发酵72小时GABA产量为500-600mM。还优选地，GABA产量为500-550mM。在具体实施方案中，GABA产量为520mM(53.67g/L)。GABA转化率优选为95％以上，还优选为99％以上，更优选地，GABA转化率达到100％。GABA在发酵液中的含量测定可采用本领域已知方法进行，例如采用高效液相色谱法或纸层析-酶标仪法测定发酵液中GABA含量。优选地，采用高效液相色谱法进行GABA含量测定。

此外，本发明的菌株具有一定的抑菌性。优选地，经抑菌性实验测定，该菌株同时对革兰氏阳性菌的蜡样芽胞杆菌、枯草芽孢杆菌、藤黄微球菌、单增李斯特菌和革兰氏阴性菌大肠杆菌具有抗菌性。还优选地，其主要抑菌物质为细菌素。

优选地，发明的菌株具有一定的耐酸性。还优选地，按1％的接种量接种到pH 2.0(HCl调节)的酸性MRS培养基中，30℃培养24h，菌株成活率大于24％。

[用于培养短乳杆菌的方法]

本发明的第二方面，提供一种用于培养含有耐热性谷氨酸脱羧酶的短乳杆菌的方法，其包括在适于菌株生长的环境下使含有耐热性谷氨酸脱羧酶的短乳杆菌在包含白菜提取液、葡萄糖、酵母提取液和金属盐的培养基中生长或增殖的步骤。

本发明中，适于菌株生长的环境包括适宜的温度和pH。优选地，温度条件为30-70℃，还优选为50-70℃，更优选为60-70℃。pH值优选为2.5-5.0，还优选为3.0-5.0，更优选为3.8-5.0℃。

本发明中，所述培养基为基于第一方面所述的含有耐热性谷氨酸脱羧酶的短乳杆菌，用于其生长和繁殖的培养基。需要说明的是，该培养基中一些营养成分的确定，例如碳源中糖类组分的确定，以及后续培养基的优化依据表1反应结果确定。本发明中，所述培养基包括分别作为碳源、氮源的葡萄糖、酵母提取液，二者的总量优选在12％以下，例如10％以下或9.5％以下为宜。需说明的是，并非所有的碳源或氮源均可添加至本发明的培养基。

优选地，本发明的培养基中包含20-35重量份白菜提取液、2-6重量份葡萄糖、0.2-4.5重量份酵母提取液和0.3-2.2重量份金属盐。还优选地，培养基中包含20-30重量份白菜提取液、4-6重量份葡萄糖、2-4.5重量份酵母提取液和1.5-2.2重量份金属盐。

优选地，金属盐包括乙酸钠、柠檬酸钠、硫酸铵、硫酸镁和硫酸锰。还优选地，金属盐包含0.1-0.3重量份乙酸钠、0.1-0.2重量份柠檬酸钠、0.1-0.2重量份硫酸铵、0.002-0.007重量份硫酸镁、0.0015-0.0035重量份硫酸锰。

本发明的白菜提取液为白菜废弃物提取液，在减少资源的浪费和环境的污染的同时降低培养基的生产成本。优选地，白菜废弃物是在大白菜的收获、运输、加工和销售过程、泡菜制作过程中对白菜进行修剪整形产生的白菜废弃物或盐渍白菜废弃物。

本发明的培养基的主要成分为白菜提取液，进一步包括水，水的添加量不特别限定，可根据得到的白菜提取液的浓度等具体情形而变化。在某些情况下，水的添加量可能大于白菜提取液的量，此时仍然属于以白菜提取液为主要成分。

需要说明的是，MRS(De Mon,Rogosa and Sharp)培养基是乳酸菌培养最常用的培养基，但其应用成本较高。而本发明中第一方面所述的菌种的GABA转化率达100％，与MRS培养基的结果基本一致，但其成本是MRS培养基的1/20。因此，本发明所开发的培养基有望替代MRS培养基并用于工业乳酸菌发酵和GABA生产，且具有较高的性价比。

[白菜提取液制备方法]

本发明进一步提供一种白菜提取液的制备方法，其包括使白菜废弃物与水混合，高温加热后萃取一定时间后经压榨后得到白菜提取液。

本发明的白菜提取液是指用白菜废弃物原料提取而得到的液体。在该原料为鲜白菜原料的情况下，白菜提取液通过压榨原料或原料与水的混合物提取获得。在该原料为干白菜原料的情况下，白菜提取液一般需要通过向干白菜原料添加水进行加热来提取。

优选地，白菜废弃物与水以0.8-1.2:0.8-1.2的重量比混合，还优选为0.8-1.2:1的重量比混合，更优选为1:1的重量比混合。白菜废弃物与水混合后需灭菌处理。例如将混合物在高温例如100～120℃下加热，然后进行萃取8-12min，优选萃取9-10min。

白菜废弃物经压榨后的残渣进一步可用于开发高纤维食品，提高农副产品的利用价值，并减少农产副产物造成的环境污染。

[白菜提取液培养基及其用途]

本发明第三方面，提供一种白菜提取液培养基及其用途，白菜提取液培养基具体组分不再赘述。本发明的白菜提取液培养基可用于乳酸菌的增殖培养及相关代谢产物如γ-氨基丁酸的生产。

[生产γ-氨基丁酸的方法]

本发明的第四方面，提供一种生产γ-氨基丁酸的方法，其包括在白菜提取液培养基中发酵短乳杆菌菌株的步骤；其中，所述白菜提取液培养基包含20-35重量份白菜提取液、2-6重量份葡萄糖、0.2-4.5重量份酵母提取液、0.3-2.2重量份金属盐和5-15重量份谷氨酸钠，所述短乳杆菌菌株为根据第一方面所述的短乳杆菌菌株。

本发明的生产γ-氨基丁酸的方法进一步包括采用反应曲面法对白菜提取液培养基进一步优化的步骤。优选地，该菌株在优化后的培养基中发酵48小时GABA产量为500-600mM。还优选地，GABA产量为500-550mM。GABA转化率优选为95％以上，还优选为99％以上，更优选地，GABA转化率达到100％。

实施例

本发明从泡菜中分离筛选出1株高产GABA的乳酸菌株，经鉴定该菌株为短乳杆菌，其电镜图如图1所示，命名为Lactobacillus brevis PL6-1。该菌株为革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性，形状为短杆状，发酵pH为4.81，来源为萝卜泡菜，革兰氏染色显微结果如图2所示。现已将该菌株于2020年5月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.19868。

1.生理生化特性测定

菌株PL6-1的API 50 CHL反应结果如表1所示：

表1菌株PL6-1的API 50 CHL反应结果

注：“+”代表阳性，“-”代表阴性，“V”代表可变的，“D”代表延迟反应

2.菌株PL6-1在MRS培养基中GABA产量测定

该菌株在添加10％谷氨酸钠(MSG)的MRS培养基中，发酵72小时GABA产量达到520mM(53.67g/L)，转化率达到97.4％，高于文献中其它菌株在优化的MRS培养基中GABA的产量，具体如表2所示。发酵液中的谷氨酸(Glu)和GABA的高效液相色谱图如图3所示。

表2不同菌株在MRS培养基中GABA的产量

a:GABA于优化培养基中发酵生产。

3.菌株PL6-1在白菜提取液培养基中GABA产量测定

3.1白菜提取液培养基开发

取白菜废弃物与水混合(1:1，w/v)，100℃萃取10min，压榨后，提取液用来开发乳酸菌培养基，残渣用来开发高纤维粗粮饼干(白菜废弃物综合利用流程如图4所示)。

选定白菜废弃物提取液浓度、不同碳源(葡萄糖、果糖、麦芽糖)、不同氮源(酵母提取物、蛋白胨、牛肉膏蛋白胨)、不同盐浓度及培养基初始pH为主要优化参数。通过优化得到白菜废弃物培养基最佳组成为每升30％白菜废弃物提取液、3％葡萄糖、0.25％酵母提取液和金属盐(0.25％乙酸钠、0.1％柠檬酸钠、0.1％硫酸铵、0.005％硫酸镁、0.0025％硫酸锰)，初始pH值为5.0。在该培养基中，细胞计数为4.16×109CFU/mL，GABA转化率达100％，与MRS培养基的结果基本一致，但其成本是MRS培养基的1/20，所开发的培养基有望用于工业乳酸菌发酵和GABA生产，具有较高的性价比。

3.2培养基优化

为获得较高的GABA转化率，用反应曲面法优化了含10％MSG的白菜废弃物培养基。最佳组成为21.84％的白菜废弃物提取液、5.5％葡萄糖、4％酵母提取液、1％乙酸钠、0.4％柠檬酸钠、0.4％硫酸铵、0.02％硫酸镁、0.01％硫酸锰，0.2％磷酸二钠，初始pH值为4.5。在优化的培养基中，GABA转化率在48h达到100％，最终GABA产量为534mM，与其他文献作对比，Lactobacillus brevis PL6-1的产率和产量都较大。尤其是在48h就能达到如此大的产量，且纯度较高，其生产效率显著高于其他文献中的GABA产量(如表3所示)。

表3文献中不同菌株生产GABA的效率

4.菌株PL6-1所含GAD酶的最适pH和最适温度测定

4.1最适pH测定

在37℃条件下，利用0.2mol/L甘氨酸-HCl缓冲液(pH 2.5～3.5)、0.2mol/L吡啶-HCl缓冲液(pH 3.5～6.0)和0.2mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 6.0～8.0)中加入20mM谷氨酸钠和0.1mM磷酸吡哆醛(PLP)，在pH 2.5～8.0范围内测定GAD酶活性的最佳pH值。最适pH测定结果如图5所示，GAD活性的最适pH值在3.0～5.0的范围内，这与以往研究中的其他乳酸菌GAD酶的最适pH有显著不同(不同菌株所含GAD酶的特征如表4所示)。GABA在乳酸菌中的生物合成受到严格的pH调节，微生物GAD酶的最适pH值一般为3.8～5.0，其中乳酸菌GAD酶的最适pH值在4.0～5.0之间。pH值的升高或降低可能导致GAD酶活性的部分丧失。本发明菌株PL6-1所含GAD酶在较宽的pH范围内能保持较高的活性。即使在pH 2.5条件下，其相对活性也为70.59％，明显高于其它乳酸菌。本发明菌株PL6-1所含GAD酶与GAD酶的辅酶磷酸吡哆醛(PLP)呈负相关，菌株PL6-1生产GABA的能力不受PLP添加量的影响。

表4不同菌株所含GAD酶的特征

NI：未检测；+：正相关；-：负相关。

4.2最适温度测定

在pH值为4.5的0.2mol/L吡啶-HCl缓冲液中，用20～80℃的温度范围确定GAD酶活性的最佳温度。测得GAD的最适温度为65℃，如图6所示。乳酸菌的GAD酶最适温度一般为30～50℃，本发明中短乳杆菌PL6-1中GAD酶的最适温度明显高于表4中所示的其他乳酸菌种。

5.菌株PL6-1所含GAD酶的耐热性

在50～90℃条件下孵育GAD酶3h，测定酶的热稳定性，并测定酶的剩余活性。GAD热稳定性曲线如图7所示。GAD活性在80℃以上迅速下降。在70℃孵育1h后，GAD活性保持在原来的40.13％左右。60℃孵育1h、2h和3h后，GAD活性分别为90.49％、78.78％和64.20％。50℃下孵育1h、2h和3h后分别为98.49％、96.29％和94.29％。其它文献中，副干酪乳杆菌的GAD在20～40℃的温度范围内是稳定的。唾液链球菌GAD在pH 4.0下50℃孵育1h后，保留了97.19％以上的GAD活性。本发明的菌株PL6-1所含GAD酶的热稳定性明显高于以往的研究。

此外，本发明的菌株PL6-1所含GAD酶在50℃、60℃和70℃的D值如表5所示，分别为7143min、971min和124min。图8为Z值GAD的logD-T图，Z值为11.36。

表5 Lactobacillus brevis PL6-1的GAD酶热稳定性参数

6.菌株PL6-1的抑菌性

经抑菌性实验测定，该菌同时对革兰氏阳性菌的蜡样芽胞杆菌、枯草芽孢杆菌、藤黄微球菌、单增李斯特菌和革兰氏阴性菌大肠杆菌具有抗菌性。将PL6-1发酵上清液pH值调至7.0，排除了有机酸的干扰；经过氧化氢酶处理后抑菌效果无明显差别，排除了过氧化氢的干扰。发酵上清液经α-胰凝乳蛋白酶、链霉蛋白酶和胰蛋白酶处理后，抑菌性发生了不同程度的改变，从而证明主要抑菌物质为细菌素。

7菌株PL6-1的其它功能性

(1)降解亚硝酸盐：利用该菌株发酵泡菜，亚硝酸盐含量始终低于国标(20mg/kg)。

(2)耐酸性：

按1％的接种量接种到pH 2.0(HCl调节)的酸性MRS培养基中，30℃培养24h，菌株成活率达到24.35％。

8菌株PL6-1的用途

本发明的高产GABA的短乳杆菌Lactobacillus brevis PL6-1，可利用其发酵生产GABA应用于食品及医药行业。另外，可利用该菌株生产富含GABA的泡菜及发酵果块气泡水等口感丰富营养健康的发酵食品。本发明的PL6-1菌株对多种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都具有抑菌性，对于发酵过程中防止其他有害微生物的生长繁殖具有十分重要的意义，且能有效降低发酵果蔬制品过程中亚硝酸盐的生成所产生的食品安全问题。

8.1高产GABA的萝卜-海藻泡菜的加工方法

泡菜加工配方：白萝卜1kg，小葱30g，大蒜10g，姜5g，食盐40g，干海藻4g(或水发海藻36g)，水1L。以5％的接种量接种PL6-1，15℃发酵5d后4℃保藏。短乳杆菌PL6-1发酵生产萝卜-海藻泡菜中GABA的液相色谱图结果如图9所示(黑色为标准品，淡绿色为添加海藻泡菜图谱)。本发明中主要分别添加了干制海带、干制裙带菜、水发海带、水发裙带菜，发现水发海带效果最好，发酵7d后GABA的含量达到70.60mg/100ml，且泡菜口感好，有碳酸感和刹口感，给人带来清爽的感觉。

加入的海带作为天然谷氨酸的主要来源，为GAD酶提供生产GABA的底物，从而赋予泡菜更多的鲜味和功能性。接种Lactobacillus brevis PL6-1发酵泡菜的亚硝酸盐含量变化结果如图10所示，本发明的菌株同时能够降低泡菜亚硝酸盐，使亚硝酸盐含量始终低于国家标准。此外，添加的食盐用量为1.5％，由于PL6-1具有抑菌性，有效防止低盐浓度条件下其它微生物产生的异味，盐度低，口感好。萝卜-海藻泡菜感官评定结果如图11所示，通过感官评定发现，利用PL6-1发酵生产的泡菜总体感官指标高于自然发酵，尤其由于脱羧反应导致GABA的生成，酸味降低，另外，鲜味和碳酸感(清爽感)增强。添加海藻尤其是添加水发海带的泡菜，除酸味外的各项感官评分均比较高。

8.2天然发酵果块气泡水的加工方法

原料配方：水果(苹果、水蜜桃等)25g，白砂糖3g，纯净水75g。

将富士苹果洗净切块，加入纯净水、白砂糖，接入乳酸菌发酵剂，置于35℃恒温发酵。用短乳杆菌PL6-1及高产胞外多糖的植物乳杆菌PJ4-2与益生菌鼠李糖乳杆菌依次添加混合发酵的方式，发酵生产果块气泡水，最后加入食品调味剂调味，其工艺流程如图12所示。接种次序：短乳杆菌PL6-1，接种量2％，发酵12h后，菌株CFU达到3.1×107CFU/ml，此时接入植物乳杆菌PJ4-2继续发酵至24h后，接入鼠李糖乳杆菌，继续发酵至72h。发酵苹果块中的乳酸菌数如图13所示，酸度变化如图14所示，发酵果块感官评价如图15所示。

尽管本发明已经参考示例性实施方案进行了描述，但应理解本发明不限于公开的示例性实施方案。在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的示例性实施方案做多种调整或变化。权利要求的范围应基于最宽的解释以涵盖所有修改和等同结构与功能。

短乳杆菌菌株及其培养方法和用途专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。