专利摘要

本发明公开了一种密花核果木茎提取物的制备方法，是在密花核果木茎的干燥粉末中加入溶剂提取；提取液经过滤、减压浓缩得到总提取物，加水混悬，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取，减压回收分别得到石油醚部分、氯仿部分、乙酸乙酯部分和正丁醇部分，所得石油醚部分包括3个三萜类化合物、7个甾醇类化合物和1个甘油酯衍生物。本发明制得的提取物得率高，工艺流程简单，成本低廉，适合较大规模的制备，提取物具有很好的抗肿瘤活性，可以应用于预防和治疗肿瘤药物中。

权利要求

1.一种密花核果木茎提取物的制备方法，其特征在于，其步骤如下：

1）、在密花核果木茎的干燥粉末中加入溶剂提取，溶剂为85～95%的乙醇或甲醇；

2）、将密花核果木茎提取液经过滤、减压浓缩得到总提取物，加水混悬，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取，减压回收分别得到石油醚部分、氯仿部分、乙酸乙酯部分和正丁醇部分；

3）、石油醚部分经反复柱层析，得到3个三萜类化合物、7个甾醇类化合物和1个甘油酯衍生物。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述密花核果木茎干燥粉末是将密花核果木的茎经阴干后粉碎得到。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述提取方法包括室温浸泡、加热或超声提取。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：密花核果木茎药材与溶剂的体积比为1：1～1：10。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：柱层析用填料为柱层析用硅胶或葡聚糖凝胶。

说明书

技术领域

本发明属于天然植物有效成分的提取分离技术领域，涉及一种密花核果木茎提取物的制备方法。

背景技术

大戟科（Euphorbiaceae）核果木属（Drypetes）植物全世界约200种，分布于亚洲、美洲和非洲中西部等热带、亚热带地区。该属植物在非洲民间为传统药材，主要用于治疗淋病、恶性肿瘤、黑热病、类风湿、支气管炎等症，药用史由来已久。核果木属植物作为恶性肿瘤的传统治疗药物，对其开展抗肿瘤活性研究具有极大的开发潜力。

中药的抗肿瘤作用得到广泛关注。许多临床及实验证实，很多中药的作用明显，且毒副作用小。而紫杉醇、喜树碱、长春碱及长春新碱等的研发成功进一步佐证了天然产物作为抗肿瘤药物研究战略的可行性。因此，从中药中寻找高效低毒的抗肿瘤药物已成为该类药物研究的一个重要方向。

虽然核果木属植物作为恶性肿瘤的传统治疗药物由来已久，但目前国内外尚未对该属植物进行抗肿瘤方面的相关研究。密花核果木（Drypetes congestiflora）分布于海南、广东、云南等省的山地疏林中，是一新拟种，为海南主要经济林木，国内外未见其化学成分和药理活性的研究报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足而提供一种密花核果木茎提取物的制备方法，利用简单的提取分离方法对密花核果木茎不同极性部位进行抗肿瘤活性筛选，找到活性部位，经多次柱层析，阐明活性部位的化学成分。

一种密花核果木茎提取物的制备方法，其步骤如下：

1、在密花核果木茎的干燥粉末中加入溶剂提取，溶剂为85～95%的乙醇或甲醇。

2、将密花核果木茎提取液经过滤、减压浓缩得到总提取物，加水混悬，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取，减压回收分别得到石油醚部分、氯仿部分、乙酸乙酯部分和正丁醇部分。

3、石油醚部分经反复柱层析，得到3个三萜类化合物、7个甾醇类化合物和1个甘油酯衍生物。

上述方法中，所述密花核果木茎干燥粉末是将密花核果木的茎经阴干后粉碎得到。

上述方法中，所述提取方法包括室温浸泡、加热或超声提取。

上述方法中，密花核果木茎药材与溶剂的体积比为1：1～1：10。

上述方法中，柱层析用填料为柱层析用硅胶或葡聚糖凝胶。

上述方法中，3个三萜类化合物、7个甾醇类化合物和1个甘油酯衍生物，分别为β-香树酯、3α-羟基齐墩果酸、木栓酮、麦角甾-6,22-二烯-3β,5α,8α-三醇、豆甾醇-7-酮、7β-羟基豆甾醇、7α-羟基豆甾醇、6β-羟基-豆甾-3-酮、豆甾-4-烯-3,6-二酮、β-谷甾醇和正十六碳酸α-甘油酯。

本发明的提取物具有抗肿瘤活性，可以广泛应用于预防和治疗肿瘤药物中。

本发明的优点在于：

1）利用简单的提取分离方法，对密花核果木茎不同极性部位进行抗肿瘤活性筛选，找到活性部位，经多次柱层析，阐明活性部位的化学成分。

2）本发明所得提取物的化学成分明确。

3）所得提取物具有很好抗肿瘤活性，可以广泛用于预防和治疗肿瘤药物中。

4）本法明制得的提取物得率高，工艺流程简单，成本低廉，适合较大规模的制备。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,或按照制造厂商所建议的条件。

密花核果木茎提取物的制备方法步骤如下：

1）将粉碎后的密花核果木茎药材（过20-80目筛）中加入85-95%的乙醇或甲醇，室温浸泡、加热或超声提取，提取时间为60分钟至7天，料液比为1：1～1：10；

2）将密花核果木茎药材提取液过滤、减压回收得到总提取物，加水混悬，加水混悬，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取，减压回收分别得到石油醚部分、氯仿部分、乙酸乙酯部分和正丁醇部分；

3）对已确定具有广泛抗肿瘤活性的石油醚部分进行反复柱层析：石油醚：乙酸乙酯（20：1）硅胶柱层析分别得到化合物（1）、（3）和（10）；石油醚：丙酮（20：1）接着是石油醚：乙酸乙酯（10：1）硅胶柱层析分离得到化合物（2）和（4）；氯仿：乙酸乙酯（20：1）硅胶柱层析接着是氯仿：甲醇（1：1）葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱层析分离得到化合物（5），重结晶得到化合物（9）；石油醚：乙酸乙酯（8：1）和石油醚：丙酮（10：1）硅胶柱层析分离得到化合物（6）和（7）；氯仿：乙酸乙酯（8：1）以及石油醚：丙酮（5：1）硅胶柱层析得到化合物（8）；氯仿：乙酸乙酯（6：1）硅胶柱层析以及氯仿：甲醇（1：1）葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱层析分离得到化合物（11）。

4）综合应用多种光谱波谱技术（包括IR、UV、MS、1D/2D NMR）结合相关文献参考，对纯化得到的单体化合物进行结构鉴定，分别为3个三萜类化合物、7个甾醇类化合物和1个甘油酯衍生物，具体结构为β-香树酯（1）、3α-羟基齐墩果酸（2）、木栓酮（3）、麦角甾-6,22-二烯-3β,5α,8α-三醇（4）、豆甾醇-7-酮（5）、7β-羟基豆甾醇（6）、7α-羟基豆甾醇（7）、6β-羟基-豆甾-3-酮（8）、豆甾-4-烯-3,6-二酮（9）、β-谷甾醇（10）和正十六碳酸α-甘油酯（11），测定结构可靠。

下面结合实施例对本发明作详细说明。

实例一密花核果木茎有效部位的制备

密花核果木茎（20Kg），室温下采用95%乙醇室温浸泡3次，7天/次，合并提取液，减压浓缩得总提取物（1.0Kg），加水悬浮分散，分别用石油醚，氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取，得石油醚部分（80g），氯仿部分（120g），乙酸乙酯部分（15g）和正丁醇部分（450g）。

石油醚部分经过反复硅胶、葡聚糖凝胶（Sephdex LH-20）柱层析，得到3个三萜类化合物、7个甾醇类化合物和1个甘油酯衍生物，分别为石油醚：乙酸乙酯（20：1）硅胶柱层析分别得到β-香树酯（1）30mg、木栓酮（3）47mg和β-谷甾醇（10）356mg；石油醚：丙酮（20：1）接着是石油醚：乙酸乙酯（10：1）硅胶柱层析分离得到3α-羟基齐墩果酸（2）17mg和麦角甾-6,22-二烯-3β,5α,8α-三醇（4）8mg；氯仿：乙酸乙酯（20：1）硅胶柱层析接着是氯仿：甲醇（1：1）葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱层析分离得到豆甾醇-7-酮（5）26mg，重结晶得到豆甾-4-烯-3,6-二酮（9）17mg；石油醚：乙酸乙酯（8：1）和石油醚：丙酮（10：1）硅胶柱层析分离得到7β-羟基豆甾醇（6）6mg和7α-羟基豆甾醇（7）3mg；氯仿：乙酸乙酯（8：1）以及石油醚：丙酮（5：1）硅胶柱层析得到6β-羟基-豆甾-3-酮（8）16mg；氯仿：乙酸乙酯（6：1）硅胶柱层析以及氯仿：甲醇（1：1）葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱层析分离得到正十六碳酸α-甘油酯（11）26mg。化学结构如下：

实施例二密花核果木茎石油醚部位抗肿瘤活性研究

1.实验方法：将三种肿瘤细胞株K562、SPCA-1、SGC-7901，用含10%小牛血清的RPMI-1640培养基，在37℃、5%CO₂培养箱中培养。采用MTT法进行细胞增殖抑制试验，主要操作为取对数生长期的肿瘤细胞株，用0.25%的胰蛋白酶消化，10%新生小牛血清的RPMI-1640培养液调制成5×10⁴个/ml^-1的细胞悬液，接种于96孔板中，每孔接种180μL。在37℃、5%CO₂饱和湿度条件下培养8-10h，待其贴壁，每个孔加入用PBS配制的样品液，使得样品终浓度分别为1,10,和100μg/mL。每个浓度平行3孔，继续培养44h后，每孔加入50μL MTT(1mg/mL^-1,PBS配制），在37℃、5%CO₂条件下继续温育4h，吸弃孔内培养上清液，每孔加入150μL DMSO，在微型振荡器上摇匀15min，结晶溶解后，在酶联免疫检测仪上选择570nm，测定各孔的吸光值，同时设置空白组（仅加入含细胞的培养液）和对照组（以培养液替代药物），计算细胞增殖抑制率。抑制率(%)=(1-实验组3孔OD值平均值/对照组3孔OD值平均值)×100%。

IC₅₀值的测定：根据MTT实验初步筛选结果，选择浓度为100μg/mL时抑制率>50%的样品，进一步测定其半数抑制浓度IC₅₀。以同一样品浓度对数值为横坐标，以抑制率作纵坐标，作回归曲线，计算出样品IC₅₀值。采用SPSS13.0统计软件包进行数据处理及统计分析。

2.实验结果（见表1）

由实施例1得到的密花核果木茎石油醚部位对所选肿瘤细胞株K562、SPCA-1、SGC-7901均显示不同程度的增殖抑制活性，IC₅₀值分别为59.26,100.20,70.27μg/mL；氯仿萃取部位对SGC-7901细胞显示微弱抑制增殖活性，IC₅₀值为130.41μg/mL。

表1密花核果木不同溶剂提取物的抗肿瘤活性

注：N为样品浓度为100μg/mL时，肿瘤细胞增殖抑制率<50%。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

一种密花核果木茎提取物的制备方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。