专利摘要

本发明提供了一种氧钒配合物及其制备方法，以及该配合物作为蛋白酪氨酸磷酸酶1B（PTP1B）抑制剂的应用。本发明提供的一种氧钒配合物，是5-氯水杨醛缩-4-氨基-5-巯基-1,2,4-三唑席夫碱氧钒，其制备方法为：将5-氯水杨醛缩-4-氨基-5-巯基-1,2,4-三唑席夫碱配体溶于无水乙醇，滴加等摩尔量的三乙胺，加热搅拌使配体溶解，然后加入溶有等摩尔量的乙酰氧钒的无水乙醇溶液，搅拌回流，冷却，过滤，收集母液，析出黄色块状晶体。本发明的配合物合成方法简单，原料易得，在纳摩尔级浓度时就对PTP1B的活性有显著抑制作用，制得的配合物可作为蛋白酪氨酸磷酸酶1B抑制剂。

权利要求

1.一种氧钒配合物，其结构式为：

2.如权利要求1所述的一种氧钒配合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）合成4-氨基-5-巯基-1,2,4-三唑；

（2）合成5-氯水杨醛缩-4-氨基-5-巯基-1,2,4-三唑席夫碱配体：将等摩尔量4-氨基-5-巯基-1,2,4-三唑和5-氯水杨醛分别溶于无水乙醇，搅拌下，将5-氯水杨醛的无水乙醇溶液滴加到4-氨基-5-巯基-1,2,4-三唑的无水乙醇溶液中，然后滴加1-2倍摩尔量的浓硫酸，回流4小时后，冷却，过滤,固体在无水乙醇中重结晶；

（3）合成本发明氧钒配合物：将等摩尔量的乙酰丙酮氧钒和5-氯水杨醛缩-4-氨基-5-巯基-1,2,4-三唑席夫碱配体分别溶于无水乙醇，加热搅拌5-氯水杨醛缩-4-氨基-5-巯基-1,2,4-三唑席夫碱配体的无水乙醇溶液，滴加等摩尔量的三乙胺使配体溶解，然后，再加入乙酰丙酮氧钒的无水乙醇溶液，搅拌回流4小时后，冷却，过滤，收集母液，析出黄色块状晶体。

3.如权利要求1所述的一种氧钒配合物作为蛋白酪氨酸磷酸酶1B抑制剂的应用。

说明书

技术领域

本发明涉及过渡金属配合物，具体涉及一种氧钒配合物及其制备方法，以及该配合物作为蛋白酪氨酸磷酸酶1B抑制剂的应用。

背景技术

蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPs)是广泛存在于生物体内的一类不含金属的酶类，它与蛋白激酶共同调控蛋白酪氨酸磷酸化这一可逆的动态过程，其中，蛋白酪氨酸使蛋白磷酸化，而蛋白激酶则使蛋白去磷酸化。在人体内，有100多种PTPs被认为与各种增强或抑制信号转导的途径有关。PTPs能够调控细胞周期和信号的转导，在细胞信号的响应方面，它能够通过和蛋白酪氨酸磷酸激酶联合来调控蛋白酪氨酸磷酸化的作用程度。这些信号系统的异常调控路径被发现和许多疾病有关。不正常的PTPs活性可导致包括癌症、糖尿病和风湿性关节炎等在内的许多疾病的发生。

蛋白酪氨酸磷酸酶1B（PTP1B）是PTPs家族中一个经典的非受体型酪氨酸磷酸酶，在胰岛素信号通路中起着重要的负调控作用，目前体内外研究发现，由胰岛素抵抗引起的II型糖尿病患者体内的胰岛素靶组织中PTP1B的表达大大增加，PTP1B的过度表达阻断了胰岛素受体酪氨酸的激活和胰岛素的信号传导，所以PTP1B已经成为糖尿病和肥胖症公认的治疗靶点，也成为世界上很多科研单位和制药公司研发新药的热点，而寻找与PTP1B进行特异性结合和作用的小分子，研究小分子和PTP1B相互作用，则成为研发以PTP1B为靶点的新药的基础。近年来，PTP1B抑制剂的研究引起了人们广泛的兴趣，目前国内外关于PTP1B抑制剂的报道已很多，但大部分都集中在有机小分子化合物方面。由于金属离子特有的生物活性，能够有效抑制PTP1B的无机小分子化合物越来越多的引起人们的关注，一些高效、低毒、特异性的无机小分子化合物有望成为新型的抗糖尿病药物。

近几年来人们对具有胰岛素活性的VO(IV)氧钒类配合物研究最为活跃、发展也最快，各个国家也都在加紧开发研制此类抗糖尿病药物。目前除BMOV外，一些配位形式为VO(N2O2)、VO(O2S2)、VO(N2S2)、VO(N4)、VO(S4)的配合物也具有类胰岛素性质，但是配位形式为VO2(NSO)的配合物类胰岛素性质还未见报道，所以我们制备并研究了基于PTP1B靶点的具有类胰岛素性质的席夫碱氧钒配合物，为糖尿病的治疗提供了一种新的药物开发途径。

发明内容

本发明的目的在于提供一种氧钒配合物及其制备方法，以及该配合物作为蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂的应用。

本发明提供的一种氧钒配合物，是5-氯水杨醛缩-4-氨基-5-巯基-1,2,4-三唑席夫碱氧钒，其分子式为C₉H₆ClN₄O₃SV，分子量为336.63，结构式为：

本发明提供的一种氧钒配合物的制备方法，包括如下步骤：

（1）合成（如：化学试剂，2009，31(10)，785-788）4-氨基-5-巯基-1,2,4-三唑；

（2）合成5-氯水杨醛缩-4-氨基-5-巯基-1,2,4-三唑席夫碱配体：将等摩尔量4-氨基-5-巯基-1,2,4-三唑和5-氯水杨醛分别溶于无水乙醇，搅拌下，将5-氯水杨醛的无水乙醇溶液滴加到4-氨基-5-巯基-1,2,4-三唑的无水乙醇溶液中，然后滴加1-2倍摩尔量的浓硫酸，出现淡黄色沉淀，回流4小时后，冷却，过滤,固体在无水乙醇中重结晶；

（3）合成本发明氧钒配合物：将等摩尔量的乙酰丙酮氧钒和5-氯水杨醛缩-4-氨基-5-巯基-1,2,4-三唑席夫碱配体分别溶于无水乙醇，加热搅拌5-氯水杨醛缩-4-氨基-5-巯基-1,2,4-三唑席夫碱配体的无水乙醇溶液，滴加等摩尔量的三乙胺使配体溶解，然后，再加入乙酰丙酮氧钒的无水乙醇溶液，搅拌回流4小时后，冷却，过滤，收集母液，析出黄色块状晶体。

上述合成方法的反应式为：

本发明制得的配合物可作为蛋白酪氨酸磷酸酶1B抑制剂。该配合物对PTP1B的半数抑制浓度为78nm。抑制类型为竞争型抑制剂，抑制常数K_i值为109nM，配合物与PTP1B相互作用的键合比是0.95082，键合常数是：1.06×10⁶M^-1。

本发明的优点和效果

本发明的配合物合成方法简单，原料易得，在纳摩尔级浓度时就对蛋白酪氨酸磷酸酶1B（PTP1B）的活性有显著抑制作用，因此，本发明的配合物具有类胰岛素活性，为糖尿病的治疗提供了一种新的药物开发途径。

附图说明

图1本发明氧钒配合物的晶体结构图；

图2本发明氧钒配合物抑制PTP1B活性的IC₅₀值测定曲线；

图3本发明氧钒配合物对PTP1B的抑制类型曲线；

图4本发明氧钒配合物对PTP1B的抑制常数曲线；

图5本发明氧钒配合物对PTP1B的荧光淬灭图谱；

图6本发明氧钒配合物与PTP1B的键合常数和键合比曲线；

具体实施方式

下面结合附图和实例对本发明作进一步说明。

实施例1

配合物的制备

（1）合成4-氨基-5-巯基-1,2,4-三唑：取10mmol（1.06g）双氨基硫脲于圆底烧瓶中,加入10mL甲酸溶液，搅拌回流4h,冷至室温,减压蒸馏出未反应的甲酸,水洗得粗产品,用水重结晶得到白色结晶产物；

（2）合成5-氯水杨醛缩-4-氨基-5-巯基-1,2,4-三唑席夫碱配体：取5mmol（0.58g）4-氨基-5-巯基-1,2,4-三唑于圆底烧瓶中，加入50ml无水乙醇溶解，搅拌下滴加5mmol（0.78g）的5-氯水杨醛的无水乙醇溶液40ml和0.4ml浓硫酸，出现大量淡黄色沉淀，加热回流4小时后，冷却，过滤,固体粉末在无水乙醇中重结晶,析出淡黄色微晶；

元素分析测定：C₉H₇ClN₄OS，括号内为理论值（%）：C42.56(42.44)；H2.79(2.77)；N22.13(22.00)。

红外光谱测定：IR(KBr),ν:3110,1613,1541,1474,1453,1283,947,663。

（3）合成本发明氧钒配合物：取1mmol（0.255g）5-氯水杨醛缩-4-氨基-5-巯基-1,2,4-三唑席夫碱配体放入圆底烧瓶中，加入20ml无水乙醇，滴加1mmol（150μl）的三乙胺，加热搅拌使配体溶解，然后加入溶有1mmol（0.364g）乙酰丙酮氧钒的无水乙醇溶液10ml，搅拌回流4小时后，冷却，过滤，滤液中析出黄色块状晶体；

元素分析测定：C₉H₆ClN₄O₃SV·C₆H₁₅N，括号内为理论值（%）：C 41.28(41.15)；H 4.90(4.83)；N 16.13(16.00)。

配合物单晶结构

在高倍显微镜下，挑选规则、透明的黄色块状单晶颗粒用X-ray晶体衍射方法测试，并用SHELXTL-NT5.10版程序包解析出配合物晶体结构。配合物的晶体结构如附图1（为使结构清晰，删除溶剂分子），有关晶体其它一些详细的信息列于表1和表2。在该配合物中，中心原子钒为五价，配合物结构中除了两个VO双键以外，钒原子还与5-氯水杨醛缩4-氨基-5-巯基-1,2,4-三唑席夫碱配体中亚胺氮原子，酚基氧原子和三唑硫酮的硫原子配位形成五配位的扭曲四方锥结构(VO₃NS)。

表1配合物[VO₂(C₉H₆ClN₄OS)·C₆H₁₅N]晶胞及测量参数

表2配合物[VO₂(C₉H₆ClN₄OS)·C₆H₁₅N]部分主要键长 和键角数据(°)。

实施例2本发明氧钒配合物对PTP1B抑制效果检测。

将氧钒配合物晶体用二甲基亚砜（DMSO）溶解，配成10^-2M的母液，再用DMSO稀释成不同浓度的溶液（10^-4M、10^-5M、10^-6M、10^-7M、10^-8M、10^-9M、10^-10M）。酶活性抑制实验的测定是以2mM对硝基苯磷酸二钠盐(pNPP)为反应底物在pH为7.20的MOPS缓冲体系[20mM吗啉代丙烷磺酸(MOPS)，50mM NaCl]中进行的，实验方法为：该实验是在96孔板中进行，依次加入83μl含酶缓冲溶液，10μl不同浓度梯度的抑制剂，用2μl(0.1M)的pNPP启动反应，放置约15分钟以后，再加5μl（2M）的NaOH终止反应，通过酶标仪测定底物的分解产物在A₄₀₅的紫外吸收强度，确定生成的对硝基苯酚（pNP）的量，每个样平行做三次，同时扣除空白，运用Origin通过配合物对PTP1B的抑制曲线来计算出其IC₅₀值，表明配合物抑制效果的IC5₀值取多次实验的平均值。如附图2所示计算得到本发明钒氧配合物对PTP1B的IC₅₀为78nM。说明该氧钒配合物对PTP1B酶活性具有高效抑制效果。

实施例3本发明氧钒配合物对PTP1B抑制类型的确定。

将氧钒配合物晶体用二甲基亚砜（DMSO）溶解，配成10^-2M的母液，再用DMSO稀释成不同浓度的溶液（200nM、100nM、50nM、25nM），底物pNPP的浓度分别是4mM、2mM、1mM、0.5mM、0.3mM、0.2mM。实验反应体系为：88μl含酶（PTP1B）缓冲溶液含有：20mM吗啉代丙烷磺酸(MOPS)，50mM NaCl，10μl不同浓度梯度的抑制剂，反应体系中加入2μl不同浓度pNPP启动反应，在405nm处测定光吸收的变化值。分别测定每个抑制剂浓度对每个底物浓度的吸光度值，根据公式A=εbc（b=1cm，ε=1.78×10⁴，A为405nm吸光度，C为反应物浓度mol/L）得出每个抑制剂浓度下的反应速率ν，如附图3所示，以底物浓度倒数1/[S]为横坐标，以1/ν为纵坐标作图，得到一组纵轴截距不变的直线，表示该配合物的抑制类型是竞争型抑制剂。如附图4所示，根据Lineweaver-Burk方程直线的斜率对配合物浓度作图为一条直线，该直线与X-轴的交点为抑制常数即K_i为109nM。

实施例4本发明氧钒配合物与PTP1B相互作用的键合常数与键合比。

用MOPS缓冲溶液稀释PTP1B母液至2ml，浓度为5.9×10^-7M，设定激发波长为280nm，激发和发射狭缝宽度均为5nm，实验温度为310K，测定PTP1B溶液的荧光强度，然后用氧钒配合物滴定，每次加4μl（1×10^-3M）的溶液，反应5分钟后，测定290～500nm范围的荧光光谱。附图5表明随着配合物的加入，PTP1B荧光强度不断降低，表明氧钒配合物与PTP1B键合形成复合物，根据Sterm一Volme荧光淬灭方程，如附图6所示，计算得到氧钒配合物与PTP1B的键合常数为1.06×10^-6M^-1，键合比为0.095082，实验结果说明，氧钒配合物与PTP1B是以1:1的比例稳定结合的。

一种氧钒配合物及其制备方法和应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。