专利摘要

本发明公开了一种玉米赤霉烯酮的竞争ELISA无毒检测方法。本发明所述方法是利用ZEN-BSA、ZEN单克隆抗体和ZEN的β型抗独特型单抗建立的竞争ELISA方法，以ZEN的β型抗独特型单抗替代ZEN标准品，从而避免了毒素对操作者的危害及向环境中散毒的可能，实现无毒检测；该方法不需使用ZEN标准品，可大大降低成本，可以大规模地对食品、谷物和饲料等污染的玉米赤霉烯酮进行快速、灵敏的检测，因此将具有良好的市场前景。

说明书

技术领域

本发明涉及化合物检测领域，具体涉及一种玉米赤霉烯酮的竞争ELISA无毒检测方法。

背景技术

玉米赤霉烯酮（Zenralenone, ZEN）是由多种镰刀菌产生的一种类雌激素样的真菌毒素，污染范围广泛，谷实类原料在田间、收获过程、收获后储藏期间以及饲料和食品成品储存、使用等诸多环节，都有可能受到ZEN 的污染。ZEN具有较强生殖毒性和致畸作用，可引起动物发生雌激素亢进症，导致动物不孕或流产，对猪、家禽、反刍动物均影响较大，给畜牧业带来很大经济损失；ZEN还具有细胞毒性、免疫毒性、肝毒性、潜在致癌性等，并且ZEN对高温稳定，不易去除，严重危害人类健康。

鉴于玉米赤霉烯酮对人类及其他动物具有较强的毒性作用，2000年JECFA公布了人类对于ZEN的临时最大摄入量为40μg/ kg体重。截至2004年，已有27个国家或地区对ZEN在食品和饲料中的含量进行了限制，而且该数目还在继续增加之中。2006 年7 月1 日欧盟实施的EEC 253/ 2004 法规明确细分了不包含玉米的未加工谷物、谷粉、快餐和早餐食品的ZEN 最大限量为100、75 和50 μg/ kg，还规定了以加工谷物为主要成分的婴幼儿食品ZEN 最大限量为20 μg/ kg。我国2006年饲料卫生标准规定玉米类饲料中ZEN最大含量为500μg/kg，而粮食卫生标准规定ZEN不超过60 μg/kg。

目前，免疫检测方法已成为食品安全快速检测的重要方法之一，在食品安全检测中发挥了重要作用。ZEN是一种小分子毒素，目前用于ZEN残留定量检测的免疫学方法需使用ZEN标准品，ZEN标准品的使用不仅给操作人员带来危害，同时也增加了环境中有毒有害物质的排放，因此，寻求ZEN的替代物用于ZEN的无毒检测具有重要的现实意义。β型抗独特型抗体（β-Anti- idiotype antibody，β-AId or Ab2β）具有与初始（半）抗原相同抗原决定簇的“内影像”作用，可以替代小分子物质。

发明内容

    本发明的目的在于根据现有技术中存在的上述不足，利用ZEN的β型抗独特型单抗替代ZEN标准品，提供一种玉米赤霉烯酮竞争ELISA无毒检测方法及其应用。

本发明通过以下技术方案实现上述目的：

本发明一种玉米赤霉烯酮竞争ELISA无毒检测方法，它是以检测抗原ZEN-BSA包被96孔酶标板，加入ZEN的β型抗独特型单抗（Ab2β-1D5）的标准品竞争物或待测样品（疑是有ZEN污染的食品、谷物、饲料等处理试样），再加入ZEN单克隆抗体（Ab1-1G4），检测抗原ZEN-BSA与游离的Ab2β-1D5或游离的ZEN竞争结合ZEN单克隆抗体，洗去游离的Ab2β-1D5与Ab1-1G4- Ab2β-1D5复合物或ZEN与Ab1-1G4-ZEN复合物，与包被抗原ZEN-BSA结合的Ab1-1G4再与酶标记的二抗结合，经底物显色后终止反应，用酶标仪测定各孔的吸光度（OD）。OD值越大，样品中自由的ZEN含量越少，对照标准品所得的曲线回归方程，计算样品中ZEN的含量。该方法的特征是具有以下检测过程和步骤：

1. ZEN单克隆抗体（Ab1-1G4）的制备

采用活泼酯法将ZEN与OVA偶联制备免疫抗原，ZEN与BSA偶联制备检测抗原，免疫BALB/c小鼠，细胞融合，经过筛选后获得杂交瘤细胞，通过小鼠体内诱生法大量制备腹水型ZEN单克隆抗体；分泌ZEN单克隆抗体的杂交瘤细胞1G4G10D3于2012年4月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：C201237。

2. ZEN抗独特型单抗（Ab2β-1D5）的制备

ZEN单克隆抗体与KLH偶联，偶联物免疫BALB/c小鼠，经血清效价和灵敏度检测合格后，再进行偶联物腹腔注射，3天后取小鼠脾细胞，与骨髓瘤细胞融合，用HAT或HT选择培养基培养融合细胞，同时采用间接ELISA和间接竞争ELISA法筛选阳性克隆，得到杂交瘤细胞株1D5；通过小鼠体内诱生法大量制备腹水型ZEN抗独特型单抗；杂交瘤细胞株1D5于2012年4月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：C201238。

3. 腹水型ZEN单克隆抗体、ZEN抗独特型单抗的纯化

腹水经饱和硫酸铵沉淀法初纯后，再用Protein G亲和层析柱进行纯化。

（1）饱和硫酸铵粗纯

 ①从-20℃冰箱中取6.5 mL 腹水，4℃缓慢融化，12000r/min离心30min，取上清；

 ②在冰浴搅拌下，逐滴加入6.5 mL饱和硫酸铵溶液，4℃放置过夜；

 ③7500 r/min离心30min，弃上清，沉淀用6.5 mL 0.1M结合缓冲液（20mM磷酸盐缓冲液，pH 7.0）溶解，混匀；

将上述抗体溶液装入已处理过的透析袋，在层析柜中，结合缓冲液透析6h以上，每隔2h更换一次透析液。

 （2）上柱前的处理

 抗体用20mM结合缓冲液稀释5 倍，用0.45μm 滤膜超滤后再上Protein G 柱。

 （3）装柱及过柱

 ①装柱：垂直安置柱体，接好恒流泵管，并用结合缓冲液填充柱子，进行平衡柱子，大约5-10 倍柱体积，平衡完毕后将核酸蛋白检测仪调零；

 ②上样：用恒流泵进样，将样品泵入柱子，进样时注意不要有气泡；

 ③清洗：用约10倍柱体积结合缓冲液清洗柱子至核酸蛋白检测仪数值不再变化；

 ④洗脱：用5倍柱体积洗脱缓冲液（0.1M Gly-HCl，pH 2.7）洗脱，此时的峰为免疫球蛋白峰，收集目的产物，待核酸蛋白检测仪数值开始变化时进行收集，待数值降至最低时停止收集，并在收集过程中不停地加入适量中和液（60-200uL，1M Tris-HCl ，pH 9.0），将pH调至7.0；

 ⑤平衡：用约10 倍柱体积结合缓冲液平衡柱子；

 ⑥用约5 倍柱体积20%乙醇清洗柱子，盖好柱子两头盖子，储存于4℃冰箱；

 ⑦浓缩收集的抗体用50kD 的超滤管，4℃，5000g离心超滤；

 ⑧用1ml 左右的PBS将抗体从超滤管上冲下来，分装保存于-20℃。取少量的样品进行抗体浓度及纯度的测定。

 （4）纯化抗体浓度的测定

 应用BCA^TM蛋白定量试剂盒测定抗体的浓度。

 （5）纯化抗体纯度的鉴定

 应用SDS-PAGE鉴定腹水纯化效果。

 4. ZEN毒素与ZEN抗独特型单抗间相关性的建立

 采用间接竞争ELISA分别建立ZEN和Ab2β-1D5的标准抑制曲线

 ① 包被缓冲液将ZEN-BSA稀释至1 μg/mL，100μL/孔，37 ℃孵育3 h；

 ② 弃反应液，300 μL PBST洗板3次，3 min/次；

 ③ 加入200 μL 5%脱脂奶粉封闭，37℃孵育1 h；

 ④ 弃反应液，300 μL PBST洗板3次，3 min/次；

 ⑤ 加入50μL不同浓度的ZEN标准品（0-50ng）或不同浓度Ab2β-1D5（0-2.48 μg），同时加入50μL 浓度为0.025μg/mL 的ZEN单克隆抗体，37℃孵育1 h；

 ⑥ 弃反应液，300 μL PBST洗板3次，3 min/次；

 ⑦ 加入100 μL 1:4000稀释的HRP标记羊抗鼠IgG，37℃孵育40 min；

 ⑧ 弃反应液，300 μL PBST洗板5次，3 min/次；

 ⑨ 加入100 μL TMB底物，避光显色10 min；

 ⑩ 加入50 μL 2M硫酸终止反应，酶标仪测定OD450值。

 依据实验结果绘制ZEN及 AId -1D5的标准抑制曲线及相应的线性回归方程。同时根据抑制率在20%-80%间，在相同抑制率条件下，ZEN与抗ZEN抗独特型单抗间浓度对应关系，绘制替代标准曲线及对应的线性回归方程，作为定量换算公式。

5. 预包被条的制备：

（1）包被：用包被缓冲液即pH9.6的0.05M碳酸钠缓冲液将检测抗原ZEN-BSA稀释至1 μg/mL，每孔100μL加入到聚苯乙烯微孔板中，37℃孵育3h；

（2）洗涤：倒出微孔板孔中包被缓冲液后，用洗瓶或多通道移液器将200μl 洗涤液加入孔中；3～5分钟后再次倒出孔中的液体，完全除去孔中的液体；洗涤3~5次；所述洗涤液为PBS-T即含0.05％吐温-20的0.01M磷酸盐缓冲液（KH₂PO₄ 0.2g，Na₂PO₄·12H₂O 2.9g，NaCl 8g，定容至1000ml，pH7.4，再加0.5ml吐温-20）；

（3）封闭：在微孔板每孔加入150～200μL含0.5%～3％BSA(牛血清白蛋白）的0.01M PBS（磷酸盐缓冲液，pH7.4），37℃封闭0.5h～1.5h；

（4）按步骤（2）洗涤微孔3～5次；

（5）加入20％蔗糖磷酸盐缓冲液室温保护3h；

（6）干燥：微孔板干燥后，装入含干燥剂的包装袋中保存待用；

6. ZEN的检测：

（1）每个板孔内分别加入50μl系列浓度的ZEN的β型抗独特型单抗（Ab2β-1D5）标准品液或处理好的食品、谷物、饲料等样品提取液到微孔中，混匀；

（2） 加入50μL 浓度为0.025μg/mL 的ZEN单抗（Ab1-1G4）到微孔，混合，37℃孵育1～2h；

（3）洗涤微孔3～5次； 

（4）加入100 μL 1:4000稀释的HRP标记的羊抗小鼠IgG抗体，37℃孵育40 min；

（5）洗涤微孔3～5次；

（6）每个微孔加入100μL 显色液TMB（3 ,3′,5 ,5′-四甲基联苯胺）底物工作液，反应10～20min；

（7）每个微孔加入50μL 2M H₂SO₄（终止液）终止反应，并轻轻振荡混匀；

（8）在15min内用酶联读数仪测定在450nm波长下的OD（吸光度）值；

（9）将所得标准液和样品吸光度值除以0标准（0浓度的标准液）的吸光度值再乘以100%，以此标准液计算值为纵坐标，ZEN抗独特型单抗浓度（μg/kg）的半对数为横坐标绘制标准曲线，根据每个样品的B/B0值从标准曲线上读出对应的ZEN抗独特型单抗的浓度；再根据质量转换公式 [y = 5901.1x - 4.5101（r=0.9862），y为ZEN浓度（ng/mL）；x为抗独特型抗体浓度（ng/mL）] 计算出对应的ZEN浓度，再乘以相应的稀释倍数，计算出样品中实际的ZEN的浓度。

7. 食品、谷物和饲料中玉米赤霉烯酮的分离

食品、谷物和饲料经粉碎后使其90%通过20目网筛。称取5g加到100mL具塞锥形瓶中，加入25mL 70%甲醇/水溶液（v:v,70:30）。震荡器提取10min，提取液通过快速滤纸过滤。取1mL滤液，加4mL蒸馏水稀释，摇匀，为试样液。

保藏信息：

杂交瘤细胞株1D5，保藏日期：2012年4月5日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：中国. 武汉. 武汉大学，保藏编号：CCTCC NO：C201238。

杂交瘤细胞1G4G10D3，保藏日期：2012年4月5日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：中国. 武汉. 武汉大学，保藏编号CCTCC NO：C201237。

附图说明

图1. ZEN的标准抑制曲线。

图2. β-AId-1D5的标准抑制曲线。

图3. ZEN毒素与抗独特型抗体间浓度转换曲线。

具体实施方式

实施例1 制备玉米赤霉烯酮单克隆抗体

1. 免疫抗原ZEN-OVA、检测抗原ZEN-BSA的制备

采用活泼酯法将ZEN与OVA偶联制备免疫抗原（ZEN-OVA），ZEN与BSA偶联制备检测抗原（ZEN-BSA）。

ZEN衍生为ZEN-CMO

（1）称取6.5mg ZEN，加入1ml吡啶，然后加入13mg O-羧甲基羟胺，室温搅拌反应24h，最后真空抽干。

（2）4m蒸馏水溶解溶解残留物，用1M NaOH将pH调至8.0。

（3）用4ml苯萃取2次，除去未反应的ZEN，然后用1M HCl将pH调至3.0。

（4）用8ml乙酸乙酯萃取4次，收集萃取液，真空抽干，残留物即玉米赤霉烯酮羧甲基肟（ZEN-CMO）

ZEN-BSA合成：

（1）制备活化酯：称取3.0mg ZEN-CMO ，溶入1mlDMF，然后再加入1.8mg NHS、1.8mg EDC，室温搅拌反应过夜，5000rpm离心10min，取上清获得A液。

（2）偶联：用1.2ml PBS溶解 8.6mg OVA，将A液缓慢加入OVA溶液，室温搅拌过夜。

（3）透析：用0.015M,pH7.4 PBS透析偶联物，除去为偶联的半抗原共透析3d，每天换3次透析液。透析后5000rpm离心10min，取上清，分装保存于-20℃。

ZEN-OVA合成：

（1）制备活化酯：称取2.7mg ZEN-CMO ，溶入1ml DMF，然后再加入1.6mg NHS、1.6mg EDC，室温搅拌反应过夜，5000rpm离心10min，取上清获得A液。

（2）偶联：用1.2ml PBS溶解 6.3mg OVA，将A液缓慢加入OVA溶液，室温搅拌过夜。

（3）透析：用0.015M，pH7.4 PBS透析偶联物，除去为偶联的半抗原共透析3d，每天换3次透析液。透析后5000rpm离心10min，取上清，分装保存于-20℃。

2. ZEN单抗的制备。

取3只6～8周龄健康BALB/c小鼠（购自南方医科大学动物所），分别编号，每只小鼠每次免疫剂量为100 μg，免疫原ZEN-OVA与等体积弗氏完全佐剂（初免）或者不完全佐剂（加强）乳化（0.2 mL），背部皮下多点注射，免疫周期为14 d，每次加强免疫后7 d，断尾取血，获得血清，保存于-20℃备用。ZEN-BSA作为包被原，间接ELISA测定抗血清效价，间接竞争ELISA测定抗血清的灵敏度。

经3次加强免疫，检测结果表明1号小鼠的灵敏度最高，IC50值为39.8 ng/mL，选择1号小鼠脾脏作为脾细胞供体，细胞融合前3 d腹腔注射100 μg ZEN-OVA（0.1 mL），3 d后取小鼠脾细胞（3.75×10⁸），在50% PEG 4000作用下与骨髓瘤细胞SP2/0（购买自中国典型培养物保藏中心）（3.75×10⁷）进行融合，用HAT或HT选择培养基培养融合细胞，同时采用间接ELISA和间接竞争ELISA法筛选阳性克隆，经过三次克隆化，获得1株稳定分泌高灵敏度抗ZEN单抗的杂交瘤细胞，命名为1G4G10D3，其分泌的抗ZEN单抗命名为单抗1G4G10D3，简称Ab1-1G4。通过小鼠体内诱生法制备腹水型单克隆抗体，具体参见文献（刘秀梵，单克隆抗体在农业上的应用，安徽科学技术出版社，1994年11月）。

HAT选择培养基含有次黄嘌呤（hypoxantin）、氨基蝶呤（aminopterin）和胸腺嘧啶脱氧核苷；HT选择培养基含有次黄嘌呤和胸腺嘧啶脱氧核苷。

实施例2 制备玉米赤霉烯酮抗独特型单抗

1. 以稳定分泌高灵敏度抗ZEN单抗的杂交瘤细胞1G4G10D3分泌的单抗为免疫原，免疫小鼠，细胞融合，制备玉米赤霉烯酮抗独特型单抗。

（1）免疫原1G4G10D3-KLH偶联物制备

①将25.6 mg EDC加入4 mg/mL IgG溶液（PBS，500 μL）中，室温搅拌反应30 min；

②将2 mg/mL的KLH溶液(PBS，1 mL)加入到上述溶液中，4℃搅拌反应12 h~16 h；

③最后的反应液用0.01 M PBS透析两天，即获得免疫原mAb-KLH偶联物（即1G4G10D3-KLH偶联物），分装、冻存于-20℃备用。

（2）单抗1G4G10D3 的Fab抗体片段制备及鉴定

①饱和硫酸铵沉淀初步纯化ZEN单抗1G4G10D3，然后经Protein G免疫亲和层析柱进一步纯化；

②在20 mM醋酸盐缓冲液（pH4.5）中，用250 μL固定化胃蛋白酶消化10 mg 纯化的ZEN单抗1G4G10D3，37℃水浴中摇动反应1 h；

③在4℃条件下，消化产物1000g离心3min，取上清，然后加入1.5 mL 10 mM Tris-HCl缓冲液（pH7.5），离心取上清，合并两次上清；

④所获得的上清通过Protein G免疫亲和层析柱，收集流出液并浓缩，即获得抗ZEN单抗1G4G10D3 Fab片段；

⑤采用BCA试剂盒测定Fab蛋白浓度；用间接ELISA鉴定Fab片段活性，从表1中可以看出Fab的IC50较完整IgG降低了3倍多，表明抗体片段的灵敏度较高，活性很好；同时用非还原SDS-PAGE鉴定Fab抗体片段，结果显示酶切片段分子量为50 kD，与抗体片段Fab大小吻合。

表1 ZEN单抗与抗体片段Fab特性对比

（3）小鼠免疫及单抗制备

实验选用10只健康的6-7周龄Balb/c雌性小鼠为实验对象，免疫原（1G4G10D3-KLH偶联物）免疫剂量为40 μg/只，与等体积新型佐剂Qickadjuvant充分混匀，通过小腿（后腿）肌肉注射免疫小鼠；第21天按同样方式加强免疫一针；第35天采取微量尾血，分离血清，分别采用间接ELISA和间接竞争ELISA进行效价和灵敏度测定，结果显示1号小鼠的效价和灵敏度最高，效价为1:1600，竞争物ZEN的IC50值为33.8 ng/mL，检出限为0.06 ng/mL，因此选择1号小鼠作为细胞融合时脾细胞的供体。细胞融合前3 d腹腔注射40 μg 1G4G10D3-KLH（0.1 mL）；3 d后取加强免疫小鼠脾细胞（3.75×10⁸），在50%PEG 4000作用下与小鼠骨髓瘤细胞（3.75×10⁷）融合；用HAT或HT选择培养基培养融合细胞，待杂交瘤细胞生长到板孔的1/4-1/3时，采用间接ELISA和间接竞争ELISA检测细胞上清，筛选阳性克隆；筛选到6株能稳定分泌ZEN的β型抗独特型单抗的杂交瘤细胞株，分别命名为1D5、2C11、2D9、3H8、3F8、6D8，及时保存细胞株。选取8周龄Balb/c小鼠制备腹水，提前1周注射0.5 mL/只弗氏不完全佐剂，1周后腹腔接种1×10⁶个杂交瘤细胞，大概7-8 d抽取腹水，1000 r/min离心10 min，取上清保存于-20 ℃。

其中杂交瘤细胞1D5产生的抗体的IC50为10 ng/mL，在这6株杂交瘤细胞中最低，因此选择1D5建立玉米赤霉烯酮的无毒ELISA检测技术。

实施例3 建立玉米赤霉烯酮竞争ELISA无毒检测方法

1. 预包被条的制备：

（1）包被：用包被缓冲液即pH9.6的0.05M碳酸钠缓冲液将检测抗原ZEN-BSA稀释至1 μg/mL，每孔100μL加入到聚苯乙烯微孔板中，37℃孵育3h；

（2）洗涤：倒出微孔板孔中包被缓冲液后，用洗瓶或多通道移液器将200μl 洗涤液加入孔中；3～5分钟后再次倒出孔中的液体，完全除去孔中的液体；洗涤3~5次；所述洗涤液为PBS-T即含0.05％吐温-20的0.01M磷酸盐缓冲液（KH₂PO₄ 0.2g，Na₂PO₄·12H₂O 2.9g，NaCl 8g，定容至1000ml，pH7.4，再加0.5ml吐温-20）；

（3）封闭：在微孔板每孔加入150～200μL含0.5%～3％BSA(牛血清白蛋白）的0.01M PBS（磷酸盐缓冲液，pH7.4），37℃封闭0.5h～1.5h；

（4）按步骤（2）洗涤微孔3～5次；

（5）加入20％蔗糖磷酸盐缓冲液室温保护3h；

（6）干燥：微孔板干燥后，装入含干燥剂的包装袋中保存待用。

2. ZEN的β型抗独特型单抗标准品的制备

（1）饱和硫酸铵沉淀初步纯化ZEN抗独特型单抗1D5，然后经Protein G免疫亲和层析柱进一步纯化；

（2）纯化收集的抗体用50kD 的超滤管，4℃，5000g离心超滤；0.01M PBS（磷酸盐缓冲液，pH7.4）将抗体从超滤管上冲下来，分装保存于-20℃。取少量的样品进行抗体浓度及纯度的测定。

（3）ZEN抗独特型单抗标准品浓度为100ng/mL。

3. ZEN的检测：

（1）每个板孔内分别加入50μl系列浓度的ZEN的β型抗独特型单抗（Ab2β-1D5）标准品液或处理好的食品、谷物、饲料等样品提取液到微孔中，混匀；

（2） 加入50μL 浓度为0.025μg/mL 的ZEN单抗（Ab1-1G4）到微孔，混合，37℃孵育1～2h；

（3）洗涤微孔3～5次； 

（4）加入100 μL 1:4000稀释的HRP标记的羊抗小鼠IgG抗体，37 ℃孵育40 min；

（5）洗涤微孔3～5次；

（6）每个微孔加入100μL 显色液TMB（3 ,3′,5 ,5′-四甲基联苯胺）底物工作液，反应10～20min；

（7）每个微孔加入50μL 2M H₂SO₄（终止液）终止反应，并轻轻振荡混匀；

（8）在15min内用酶联读数仪测定在450nm波长下的OD（吸光度）值；

（9）将所得标准液和样品吸光度值除以0标准（0浓度的标准液）的吸光度值再乘以100%，以此标准液计算值为纵坐标，ZEN抗独特型单抗浓度（μg/kg）的半对数为横坐标绘制标准曲线，根据每个样品的B/B0值从标准曲线上读出对应的ZEN抗独特型单抗的浓度；再根据质量转换公式[y = 5901.1x - 4.5101（r=0.9862），y为ZEN浓度（ng/mL）；x为抗独特型抗体浓度（ng/mL）] 计算出对应的ZEN浓度，再乘以相应的稀释倍数，计算出样品中实际的ZEN的浓度。

实施例4食品、谷物和饲料中污染ZEN的分离

食品、谷物和饲料经粉碎后使其90%通过20目网筛。称取5g加到100mL具塞锥形瓶中，加入25mL 70%甲醇/水溶液（v:v,70:30）。震荡器提取10min，提取液通过快速滤纸过滤。取1mL滤液，加4mL蒸馏水稀释，摇匀，为试样液。

一种玉米赤霉烯酮的竞争ELISA无毒检测方法专利购买费用说明

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1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

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A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。