对映体选择性两性离子交换材料

IPC分类号 : B01J43/00,B01J39/26,B01J41/20,B01J20/29,C07B57/00

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CN200980117838.6

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专利摘要

一种对映体选择性两性离子交换材料，其包含含有至少一个阳离子交换基团和至少一个阴离子交换基团及一个带有所述选择剂组分的载体的手性选择剂组分(SO)，其中手性选择剂组分包含至少一个以非大环方式连接所述离子交换基团的手性连接体部分，和所述手性连接体部分包含至少一个π-π相互作用位点。

说明书

技术领域

本发明涉及包含含有至少一个阳离子交换基团和至少一个阴离子交换基团及直接或经间隔基带有所述选择剂(selector)组分的载体的手性选择剂组分(SO)的对映体选择性两性离子交换材料。

技术背景

在采用离子交换剂类型手性固定相(CSPs)的对映体选择性层析法领域中，由于电荷相反的手性选择剂(SO)与分析物的对映体选择性离子配对而发生分离。在概念上，对映体选择性离子配对的手性分子识别过程主要可发生于每一种CSP中，所述CSPs在其手性选择剂部分中包含可电离基团，它们可以为例如小的SO分子-或者基于糖肽-或蛋白-分离材料的部分[1-4]。基于固定的金鸡纳生物碱衍生物作为低分子量SOs的CSPs特别地使用离子配对方法作为SOs与分析物之间的主要相互作用。于是，可随之出现第二种相互作用象例如H-键形成和π-π叠加(stacking)(相互作用)并最终导致对映体识别(enantiodiscrimination)。在该充分研究的类别的手性弱阴离子交换剂(WAX)中，基于奎宁和奎尼丁的O9-叔丁基氨基甲酸酯衍生物作为SOs的CSPs对广泛范围的手性酸提供优良的对映体分离能力[5，6]。图1显示了其也为市售可得到的(得自Chiral Technologies，France的CHIRALPAK QN-AX)奎宁型WAX CSP的SO结构。

作为对这些WAX型CSPs的补充，也已经开发了基于全合成低分子量弱和强阳离子交换剂(WCX和SCX)SOs的分离材料并研究经离子配对驱动的方法对手性碱性分析物的对映体分离[7-12]。在图1中对于基于SO例如阳离子交换剂CSPs的手性磺酸描绘的范例，已经用于不同的对映体选择性分离技术，包括毛细管电层析法(CEC)、毛细管液相层析法(CLC)和高效液相层析法(HPLC)[13]。仅仅在新近，更复杂但是非常有趣的基于硼酸的衍生于大环内二酯(macrodiolide)硼霉素的手性阳离子交换剂SO也被报导表明在对映体选择性层析法中作为离子交换剂的潜力。

然而，手性阳离子和阴离子交换剂遭遇仅致力于带有相反符号电荷的分析物的限制。

大体上，包含互补荷电基团的固定相也已经在文献中得到描述[15-19]并且主要用于分离无机的阳离子与阴离子。采用手性两性离子部分的系统先前也已经被报导用于不同的目的[20-24]，但是没有预计用于对映体分离。

发明内容

本发明的目的是提供用于有效的对映体分离多种手性化合物例如手性酸、手性胺和手性两性离子化合物的层析材料。

本发明的对映体选择性两性离子交换材料包含含有至少一个阳离子交换基团和至少一个阴离子交换基团及一个带有所述选择剂组分的载体的手性选择剂组分(SO)，其中

-手性选择剂组分包含至少一个以非大环方式连接所述离子交换基团的手性连接体(linker)部分，和

-所述手性连接体部分包含至少一个π-π相互作用位点(例如优选地具有吸电子或供电子取代基的芳族基团)。

术语“带有(carrying)”的含义包括载体与选择剂组分的直接连接以及也包括经间隔基的间接连接。载体或支持体相对于靶标化合物的连接应为不活泼(惰性的)，但是具有确保分子识别材料的化学和物理稳定性的功能。在流通应用(flow-through applications)如层析法中，载体根据其物理性能决定了材料的动力学性能。载体可为无机的、有机的或者混合的无机-有机混杂型材料。这样的材料包括市售可得到的和自主开发的珠粒、整块(monolithic)或连续的材料包括硅石、氧化铝、氧化锆、二氧化钛、溶胶-凝胶衍生的材料、有机-无机含硅混杂材料、任选地为交联聚硅氧烷、自乙烯基单体得到的任何一种聚合物、任选地为交联聚(甲基)丙烯酸酯、任选地为交联聚(甲基)丙烯酰胺、任选地为交联聚苯乙烯、混合的苯乙烯-(甲基)丙烯酸酯聚合物、开环复分解聚合物、多糖、琼脂糖以及被特异性地功能化以使得能够固定手性选择剂组分的这些材料中的任何一种。在优选的支持体中有硅石珠粒、聚(甲基)丙烯酸酯聚合物珠粒、聚(甲基)丙烯酰胺珠粒、聚(甲基)丙烯酸酯单块(monoliths)、聚苯乙烯树脂，其任选地如本领域已知的那样，以用于固定选择剂的侧链反应性基团改性。

间隔基主要具有连接选择剂组分与载体的功能。间隔基的长度与化学官能性两者是易变的。优选的固定策略包括乙烯基改性的选择剂与巯基(thiol)修饰的载体经游离基加成反应的反应，尤其是巯基丙基(thiolpropyl)改性的硅石。可采用的其它固定化原理包括不对称地具有氨基或羟基烷基改性的载体的二异氰酸酯连接体与氨基或羟基改性的选择剂组分的反应；氨基、羟基或巯基改性的载体与氯代或溴代链烷酰基衍生的选择剂的反应；烷氧基或氯代有机硅烷与末端反应性官能度的反应(用于偶联选择剂组分)；烷氧基或氯代氢硅烷(chlorohydrosilane)与包含乙烯基的选择剂的硅氢化(hydrosylation)反应等。

连接离子交换基团的手性连接体部分为以单一对映体形式存在的手性化合物或者自对映体纯的手性合成子如天然或非天然的、环状或非环状氨基酸、羟基羧酸、氨基膦酸、氨基次膦酸、氨基磺酸、氨基亚磺酸、氨基硼酸、羟基膦酸、巯基膦酸、酒石酸衍生物、扁桃酸衍生物、樟脑磺酸衍生物、线性或环状的天然和非天然的肽、线性或环状磺基肽、线性或环状的膦酰基肽构建。

优选的对映体选择性两性离子交换材料其特征在于所述至少一个阳离子交换基团的pka＜5.5，优选地＜3.0，和所述至少一个阴离子交换基团的pka＞8.0，优选地＞8.0。

本发明对映体选择性两性离子交换材料的另一个优选实施方案包含含有至少两个具有pka值＜5.5的酸性基团和至少一个具有pka＞8.0的碱性基团的选择剂化合物SO。

选择剂化合物SO更优选地包含至少两个具有pka值＞8.0的碱性基团和至少一个具有pka＜5.5的酸性基团。

阳离子交换基团为例如羧酸、磺酸、亚磺酸、磷酸、膦酸或次膦酸基团。

阴离子交换基团为例如伯、仲、叔或季氨基。

更优选的阴离子交换基团为奎宁或奎尼丁残基，和阳离子交换基团为磺酸基团。

本发明也涉及采用依据本发明的对映体选择性两性离子交换材料的所有层析技术，例如制备型固-液或者液-固层析法、固-液或者液-液提取技术和膜分离技术。类似地，其在分析方法学中的用途整合为(integrated as)柱液相层析法、超临界流体层析法、毛细管电层析法、芯片技术中的吸附材料或者作为传感器技术中的分子识别材料和感光膜也是本发明的目的。

发明详述

为了证实手性酸性和碱性溶质的对映体选择性层析法，仅采用一种溶质，但两性离子选择剂基元除外，如在图2中显示的新型两性离子SOs及其相应的CSPs 1-5的设计、合成和评价将在下文中描述。另外，这样的两性离子SOs也可供两性离子溶质如氨基酸和肽的对映体选择性分子识别方法之用，两性离子溶质取决于同时发生的双离子配对。直接的氨基酸对映体分离已经被报导用于糖肽-、冠醚-、CLEC-型CSPs[25-32]和基于所选择的应用用于QN-AX[33，34]，但是全部基于不同的分子相互作用原理。然而，α-、β-和γ-氨基酸的层析法对映体分离仍然是挑战性的工作，其中两性离子SO方法可提供新的和有希望的前景。总之，就以下优选的两性离子CSPs 1-5而论，于极性有机流动相条件下评价其不仅对于手性酸和手性胺，而且还对于手性两性离子分析物如氨基酸和二肽具有对映体分离的能力。

一般信息

所有的化学反应在无水条件下采用氮气气氛和烘箱干燥的玻璃仪器实施，除非另外指明。¹H和¹³C NMR光谱在Bruker DRX 400MHz光谱仪上获得。化学位移(δ)以每百万分之几的份数(ppm)给出，采用四甲基硅烷作为内标物。质谱在配备标准电喷射源的PESciex API 365三重四极杆质谱仪(Applied Biosystems/MDS Sciex，康科德(Concord)，加拿大)上实施。比旋光度值在20℃下于来自PerkinElmer(维也纳，奥地利)的Polarimeter(旋光计)341上实施。元素分析用来自Carlo Erba的EA 1108CHNS-O实施。薄层层析法用来自Merck(Darmstadt，德国)的TLC铝片Silica gel 60F₂₅₄实施。快速层析法采用来自Merck(达姆施塔特(Darmstadt)，德国)的Silica 60(0.040-0.063mm粒度)实施。材料

与先前发表的方法类似[35]，自球形硅胶(Daisogel 120-5，孔径大小粒度5μm，来自Daiso Chemical Co.，Ltd.，日本)制备巯基改性的硅胶。通过采用2，2’-二硫代二吡啶的分光光度测定法[36]评价硫醇基接枝水平为940μmol/g。按照发表的方法[13，37]制备反式-2-氨基环己烷磺酸。用于合成的所有化学品具有试剂等级质量或者更高，购自Sigma-Aldrich(维也纳，奥地利)并且除了以下情况无须进一步纯化即可使用：二氯甲烷(Sigma-Aldrich，奥地利)在使用前经氢化钙蒸馏，并且奎宁购自Buchler(布伦瑞克(Braunschweig)，德国)。作为溶剂用于HPLC的甲醇和乙腈具有HPLC等级，它们得自来自Merck(达姆施塔特(Darmstadt)，德国)。流动相添加剂乙酸(HOAc)、甲酸(FA)、二乙胺(DEA)和乙酸铵(NH₄OAc)具有分析级(Sigma-Aldrich，奥地利)。在此使用的手性碱性分析物和两性离子氨基酸分析物为市售可得到的或者为来自研究伙伴的友好赠品。作为酸性分析物的N-封端氨基酸为市售可得到的或者按照文献方法合成[38]。

仪器装备

层析测量在来自Agilent Technologies(Waldbronn，德国)的1100Series HPLC系统上实施，该系统由溶剂除气器、泵、自动进样器、柱恒温器和用于检测含有足以用于UV检测的发色团的分析物的多波长UV-Vis检测器组成。对于具有弱UV吸收性能的分析物，代之以使用来自ESA Biosciences，Inc.(Chelmford，美国)的荷载的气溶胶检测器。无论是应用UV还是CAD检测，对于图和表中显示的数据应以图表符号(legends)具体指明。用来自Agilent Technologies的层析数据软件实施数据采集和分析。为了评价选择的溶质对映体的洗脱顺序，注射已知绝对构型的单一对映体或特别对映体富集的样品或者在线使用Jasco OR-990旋光度检测器(Jasco，Gross-Umstadt，德国)。以等度模式和流动相流速为1ml/分钟实施洗脱。如果没有另外指明，柱温度为25℃。在230-280nm之间选择的波长下实现UV检测。通过注射丙酮伴随在280nm处检测测定柱的空隙体积。所有分析物作为0.5-1.0mg/ml的甲醇溶液使用。

基于两性离子，金鸡纳树属CSPs 1-5的合成(图3).

用于金鸡纳树属活化的通法[39].

一般地，使金鸡纳生物碱1(5.0g，10mmol)溶于甲苯(150ml)中并采用迪安-斯塔克(Dean-Stark)装置将溶液共沸干燥。在冷却至环境温度后，分批加入氯甲酸4-硝基苯酯(2.0g，11mmol)。搅拌生成的混合物过夜。经过滤收集形成的淡黄色沉淀。用正己烷(3x50ml)洗涤并减压干燥，得到为淡黄色固体的2(7.0g，几乎为定量收率)，其无须进一步纯化即可用于下一步。

O9-(4-硝基苯基)氧基羰基奎宁盐酸盐

(O9-(4-Nitrophenyl)oxycarbonyl quinine hydrochloride)2a.MS(ESI，正的)：490.5[M+H]⁺，979.5[2M+H]⁺。

O9-(4-硝基苯基)氧羰基奎尼丁盐酸盐

(O9-(4-Nitrophenyl)oxycarbonyl quinidine hydrochloride)2b.MS(ESI，正的)：490.5[M+H]⁺，979.5[2M+H]⁺。

用于制备两性离子SOs 3-7的通法.

一般地，将N，O-双(三甲基甲硅烷基)乙酰胺BSA(4.0ml，12mmol)分批加入到细磨的氨基酸(4.0mmol)在干燥CH₂Cl₂(80ml)中的混悬液中。搅拌生成的混合物并在回流下加热，直到形成澄明的溶液(至多36小时)。在冷却至环境温度后，分批加入活化的金鸡纳生物碱2(2.5g，4.1mmol)并搅拌溶液过夜，同时变得稍微黄色。在用MeOH(2ml)猝灭后，将反应混合物直接转移至用CH₂Cl₂预先平衡的硅胶床(150g)上。经快速层析法(CH₂Cl₂/MeOH 20/1-5/1)纯化，得到两性离子的SO。

N-[[[(8S，9R)-6’-甲氧基脱氧辛可宁-9-基]氧基]羰基]-β-丙氨酸(N-[[[(8S，9R)-6’-methoxycinchonan-9-yl]oxy]carbonyl]-β-alanine)3：91％，淡棕色固体。

¹H NMR[CD₃OD]：δ＝8.68(d，1H)，7.97(d，1H)，7.55(d，1H)，7.53(d，1H)，7.45(dd，1H)，6.93(d，1H)，5.75(m，1H)，5.09(d，1H)，5.01(d，1H)，4.02(s，3H)，3.75(m，1H)，3.64(m，1H)，3.53(m，1H)，3.48-3.33(m，2H)，3.27-3.14(m，2H)，2.73(m，1H)，2.47(m，2H)，2.21-2.08(m，2H)，2.03(m，1H)，1.84(m，1H)，1.71(m，1H).¹³C NMR：δ＝176.6(COOH)，160.4(C_ar)，156.2(C＝O)，148.1(C_arH)，145.0(C_ar)，143.6(C_ar)，139.4(CH＝)，131.8(C_arH)，127.4(C_ar)，123.9(C_arH)，119.7(C_arH)，117.1(CH₂＝)，102.5(C_arH)，71.4(CH)，59.8(CH)，57.1(OMe)，55.7(CH₂)，44.8(CH₂)，38.6(CH)，38.5(CH₂)，36.1(CH₂)，28.3(CH)，25.2(CH₂)，20.9(CH₂).MS(ESI，正的)：440.4[M+H]⁺，462.4[M+Na]⁺，879.6[2M+H]⁺，901.5[2M+Na]⁺.

N-[[[(8S，9R)-6’-甲氧基脱氧辛可宁-9-基]氧基]羰基]-氨基乙磺酸(N-[[[(8S，9R)-6’-methoxycinchonan-9-yl]oxy]carbonyl]-taurine)4：55％，淡黄色固体。

¹H NMR[CD₃OD]：δ＝8.73(d，1H)，8.00(d，1H)，7.64(d，1H)，7.50(s，1H)，7.48(d，1H)，6.94(s，1H)，5.78(m，1H)，5.14(d，1H)，5.05(d，1H)，4.05(s，3H)，3.87-3.74(m，2H)，3.65(m，2H)，3.50(m，1H)，3.37(m，2H)，3.01(m，2H)，2.84(m，1H)，2.30-2.19(m，2H)，2.13(m，1H)，1.99(m，1H)，1.75(m，1H).¹³C NMR：δ＝160.5(C_ar)，155.9(C＝O)，147.8(C_arH)，144.4(C_ar)，143.6(C_ar)，138.9(CH＝)，131.4(C_arH)，127.4(C_arH)，124.3(C_arH)，119.5(C_arH)，117.4(CH₂＝)，102.3(C_arH)，71.1(CH)，60.0(CH)，57.1(OMe)，55.8(CH₂)，51.5(CH₂)，45.5(CH₂)，38.4(CH₂)，38.3(CH)，28.2(CH)，25.0(CH₂)，20.7(CH₂).MS(ESI，positive)：476.4[M+H]⁺，498.4[M+Na]⁺.MS(ESI，负的)：474.2[M-H]^-.

非对映体的层析分离(参见下文)得到高纯度的5和6。

反式-(1”S，2”S)-N-[[[(8S，9R)-6’-甲氧基脱氧辛可宁-9-基]氧基]羰基]-2”-氨基环己烷磺酸

(trans-(1”S，2”S)-N-[[[(8S，9R)-6’-methoxycinchonan-9-yl]oxy]carbonyl]-2”-aminocyclo-hexanesulfonic acid)5：64％，灰白色结晶。

¹H NMR[CD₃OD]：δ＝8.70(d，1H)，7.95(d，1H)，7.60(d，1H)，7.40(dd，1H)，7.30(d，1H)，6.85(s，1H)，5.77(m，1H)，5.23(d，1H)，5.04(d，1H)，4.03(m，1H)，3.92(s，3H)，3.81(m，1H)，3.73(m，2H)，3.38(m，1H)，2.85(s，1H)，2.70(m，1H)，2.39(m，1H)，2.31(m，1H)，2.21(m，1H)，2.12(s，1H)，1.95(m，2H)，1.85-1.68(m，3H)，1.52(m，1H)，1.30(m，4H).¹³CNMR：δ＝160.3(C_ar)，155.6(C＝O)，148.2(C_arH)，145.0(C_ar)，143.1(C_ar)，139.2(CH＝)，131.9(C_arH)，127.1(C_ar)，123.6(C_arH)，119.9(C_arH)，117.3(CH₂＝)，102.2(C_arH)，71.0(CH)，63.6(CH)，60.0(CH)，56.5(OMe)，56.0(CH₂)，53.2(CH)，46.1(CH₂)，38.5(CH)，35.0(CH₂)，29.4(CH₂)，28.2(CH)，26.1(2xCH₂)，25.3(CH₂)，20.8(CH₂).MS(ESI，正的)：530.5[M+H]⁺，552.3[M+Na]⁺，1059.7[2M+H]⁺，1081.7[2M+Na]⁺.

反式-(1”R，2”R)-N-[[[(8S，9R)-6’-甲氧基脱氧辛可宁-9-基]氧基]羰基]-2”-氨基环-己烷磺酸

(trans-(1”R，2”R)-N-[[[(8S，9R)-6’-methoxycinchonan-9-yl]oxy]carbonyl]-2”-aminocyclo-hexanesulfonic acid)6：55％，灰白色固体。

¹H NMR[CD₃OD]：δ＝8.77(d，1H)，8.05(d，1H)，7.71(d，1H)，7.54(d，1H)，7.41(s，1H)，6.76(s，1H)，5.75(m，1H)，5.12(d，1H)，5.06(d，1H)，4.03(s，3H)，3.88(m，2H)，3.71(m，1H)，3.65(m，1H)，3.44(m，1H)，3.38(m，1H)，3.08(m，1H)，2.85(s，1H)，2.40-2.05(m，5H)，1.95(m，2H)，1.75(m，1H)，1.66(m，1H)，1.58(m，1H)，1.48(m，1H)，1.40-1.19(m，2H).¹³CNMR：δ＝160.0(C_ar)，155.3(C＝O)，148.4(C_arH)，144.4(C_ar)，142.7(C_ar)，138.7(CH＝)，131.8(C_arH)，126.8(C_ar)，123.7(C_arH)，120.2(C_arH)，117.2(CH₂＝)，101.9(C_arH)，71.1(CH)，61.5(CH)，59.8(CH)，57.0(OMe)，55.6(CH₂)，53.4(CH)，45.4(CH₂)，37.7(CH)，33.4(CH₂)，29.0(CH₂)，27.5(CH)，25.8(CH₂)，25.7(CH₂)，24.8(CH₂)，20.7(CH₂).MS(ESI，正的)：530.3[M+H]⁺，552.4[M+Na]⁺，1059.7[2M+H]⁺，1081.7[2M+Na]⁺.

N-[[[(8R，9S)-6’-甲氧基脱氧辛可宁-9-基]氧基]羰基]-氨基乙磺酸(N-[[[(8R，9S)-6’-methoxycinchonan-9-yl]oxy]carbonyl]-taurine)7：90％，黄色结晶。

¹H NMR[CD₃OD]：δ＝8.79(d，1H)，7.96(d，1H)，7.78(d，1H)，7.56-7.50(m，2H)，7.11(s，1H)，6.14(m，1H)，5.33-5.24(m，2H)，4.01(s，3H)，3.87(m，1H)，3.65-3.51(m，5H)，3.37(m，1H)，3.02(m，2H)，2.77(m，1H)，2.42(m，1H)，2.06(m，1H)，2.02-1.83(m，2H)，1.47(m，1H).¹³C NMR：δ＝161.2(C_ar)，155.7(C＝O)，146.8(C_ar)，145.8(C_arH)，141.2(C_ar)，137.9(CH＝)，128.8(C_arH)，127.9(C_ar)，126.1(C_arH)，120.1(C_arH)，118.4(CH₂＝)，102.6(C_arH)，71.4(CH)，59.8(CH)，57.4(OMe)，51.5(CH₂)，51.0(CH₂)，50.1(CH₂)，38.5(CH₂)，38.2(CH)，28.7(CH)，23.7(CH₂)，20.4(CH₂).MS(ESI，正的)：476.2[M+H]⁺，498.2[M+Na]⁺，951.4[2M+H]⁺，973.4[2M+Na]⁺.

SO5和6的HPLC半制备型非对映体分离

非对映体5和6的等度半制备型层析拆分用以上描述的标准分析型HPLC系统结合来自Agilent Technologies的，连接于刚好在UV检测器后面用于自动收集流分的流路的12/13-开关阀实施。所采用的固定相为装填于不锈钢柱(150x4mm I.D)腔内的β-丙氨酸基CSP 1。采用在MeOH中的25mM(0.142％，v/v)HOAc作为流动相，流速设定为1.0ml/分钟和柱温为25℃。使氨基酸非对映体以100mg/ml的浓度溶于MeOH中并分配到标准HPLC小瓶。注射到柱中的样品量分别为85μl或8.5mg。

在一系列注射中，非对映体被分离并以两个流分收集，将其真空浓缩。所收集的非对映体纯度采用类似的条件(CSP 1；25mM HOAc在MeOH中)进行分析评价。首先被洗脱的非对映体5在环己烷磺酸亚单位被确定为(1”S，2”S)-构型，并且因此，第二个被洗脱的非对映体6被确定为(1”R，2”R)-构型。这些测定的基础初步是基于5的X-射线晶体学数据。

SO固定和柱填充

用于制备基于两性离子SO的CSPs的通法

一般地，使烘箱干燥的巯基改性硅胶(2.20g)悬浮于MeOH(10ml)中。加入每一个溶于MeOH(分别为5ml和1ml)中的SO(380mg，0.89mmol)和偶氮二异丁腈AIBN(30mg，0.18mmol)。在回流下搅拌混悬液6小时。在冷却并过滤后，用MeOH(3x20ml)、乙醚(2x20ml)洗涤硅胶并在60℃下真空干燥，得到新的CSP。自通过元素分析得到的氮含量计算SO覆盖率：CSP 1(基于SO 3)：w-％C 10.60，w-％H 1.85，w-％N 0.825，w-％S 2.56；196μmol SO每g CSP。CSP 2(基于SO 4)：w-％C 10.48，w-％H 1.85，w-％N 0.863，w-％S 3.26；205μmol SO每gCSP。CSP 3(基于SO 5)：w-％C 11.53，w-％H 1.96，w-％N 0.905，w-％S 3.19；215μmol SO每g CSP。CSP 4(基于SO 6)：w-％C 11.83，w-％H1.92，w-％N 0.961，w-％S 3.19；229μmol SO每g CSP。CSP 5(基于SO7)：w-％C 10.14，w-％H 1.78，w-％N 0.881，w-％S 3.15；210μmol SO每g CSP。CSP 1-5为装填于不锈钢柱(150x4mm I.D.)内或VDSOptilab GmbH(柏林，德国)腔内的浆状物。

结果与讨论

选择剂设计

本发明目标为致力于开发其针对带正和负电荷两者的手性分析物的离子交换剂类型手性固定相。因此，目的是将其先前已经被我们用作阳离子和阴离子交换剂类型的对映体选择性层析法中成功的低分子量SOs的酸性和碱性选择剂单位融合成新型两性离子选择剂结构。在图1中显示的磺酸基SCX CSP已经被报导用于HPLC中多种手性胺的对映体分离。其手性部分由反式-2-氨基环己烷磺酸表示并且因此被选择作为两性离子CSP的阳离子交换位点。奎宁氨基甲酸叔丁基酯衍生物WAX(参见图1)也被很好地确定为手性阴离子交换剂CSP。已经在对映体分离技术中对金鸡纳树属型受体进行报导的详尽研究提示，如果对映体选择特性在很大程度上保持不变，奎宁的O9-位用于经氨基甲酸酯键引入氨基磺酸。图2中的新的两性离子CSPs图解说明了在一个单一的选择剂中融合阳离子和阴离子交换剂部分的原理，其中CSP 3和4结合WAX-和SCX同种物质的关键基元与生物碱基和环己烷磺酸。为了更详细地研究对映体选择性离子相互作用方法，在CSP 1，2和5中也结合在β-位具有氨基的非手性羧酸和磺酸。而且在CSP 5中，生物碱基奎宁用其伪对映体(pseudoenantiomer)奎尼丁替代，这预计会在对映体分离时影响洗脱顺序并因此更清晰地阐明作为基础的分子识别方法。

CSP 1-5的制备

对于在O9-位用氨基酸进行氨基甲酸酯型衍化，分别使奎宁1a和奎尼丁1b通过与4-硝基氯代甲酸酯反应活化[39]，随后自反应溶液中沉淀盐酸盐2a和2b并经过滤收集(图3)。被偶联的非手性β-氨基酸为市售可得到的化合物如氨基乙磺酸和β-丙氨酸，而建立嵌段的手性反式-2-氨基环己烷磺酸按照公开的方法作为外消旋体制备[13，37]。

为了防止发生溶解性问题，不同的氨基酸在与硝基苯基酯2a和2b反应之前用N，O-双(三甲基甲硅烷基)乙酰胺[40]转化为其三甲基甲硅烷基酯。从而可以以可接受至良好的产率快速制备两性SOs 3-7。经游离基加成反应[35]实现将SOs固定到巯基改性的硅胶上并产生具有150-230μmol每克CSP的SO载荷的新型CSPs 1-5。在CSPs 3和4的情况中，在固定化之前制备型分离非对映体SOs是必要的，以确保SO立体异构体的高纯度。当标准的反相(RP)和WAX-型层析法两者不容许便利地分离两性化合物时，采用新型CSP 1，β-丙氨酸-奎宁基两性离子材料，得到足够的分离(分析型运行：α＝2.24，R_S＝8.9)和高的载荷能力(至多10mg样品被注射到150x4mm柱上)，同时采用可易于除去的流动相，腔由MeOH中0.14％乙酸组成(数据未显示)。尽管为非对映体的分离，其表明这些新型手性两性离子固定相也用于制备型分离和纯化两性化合物的潜力。

CSPs 1-5的层析评价

在下文将提出和讨论CSPs 1-5在用于对映体分离的HPLC的层析评价结果：首先对于酸性分析物种类，其次对于碱性胺分析物，并且最后对于两性离子溶质。

对于这些研究选择极性有机流动相条件，因为它们已经成功和广泛地用于原始的、纯的阴离子或阳离子交换剂CSPs[13，41]。极性有机模式采用极性有机散装溶剂(bulk solvents)如甲醇和乙腈，而酸性和碱性添加剂起同-和反离子的作用并且调节荷电SO与溶质之间的离子相互作用。

因为新型两性离子分离材料首先应图解说明更通用的手性离子交换剂的概念、两性离子CSPs 1-5与母体WAX-和SCX CSPs的总体层析性能比较仅以基本水平出现。在这方面，优选的是其中后者CSP材料的关键特征已经得到极详细报导的文献资料[6，13，38]。

手性酸的对映体分离

在一系列实验中，CSPs 1-5被试验有关不同手性酸的对映体分离，以评价金鸡纳树属型WAX CSPs的主要性能-即手性酸性分析物如N-保护的氨基酸的对映体分离-是否能够在新型两性离子CSPs中保留。为了该目的，收集小的但是代表性的一组八种分析物，其包含用芳族、脂肪族和荷电侧链进行N-封端的氨基酸并且采用常用的N-保护的或者衍化的基团。分析物的结构及层析结果两者均列于表1中。

表1

多种手性酸性分析物在CSPs 1-5上的HPLC对映体分离a)

^a)条件：固定相：柱尺寸150x4mm I.D.；流动相：50mM甲酸和25mM二乙胺在MeOH中；流速1.0ml/分钟；T 25℃；t₀＝1.49分钟。EO＝洗脱顺序(第一种被洗脱的对映体的构型)。n.d.＝未测定。k₁＝第一种被洗脱对映体的保留因子；α＝分离因子即层析的对映体选择性；R_S＝第一种与第二种被洗脱对映体之间的分离度；EO＝洗脱顺序(第一种被洗脱对映体的构型)。

显然，使得能够分离酸性分析物对映体的对映体选择性仍然存在于全部五种两性离子CSPs中。仅伴有少许例外，所有分析物在全部CSPs被基线分离。与典型手性WAX CSP相比较(参见图1)，全部α-值被证实具有轻微的变化(数据未显示)。保护基的类型对基于金鸡纳树属型CSPs的手性识别和对映体选择性的影响先前已有详细描述[35，38]并且也可用CSPs 1-5进一步证实：3，5-二硝基苯甲酰胺确实得到优良的对映体分离(α-值高达15伴随分离度＞20)，Fmoc-、DNP-和乙酰基得到良好的分离，随后是Z-基团；与其它N-保护基比较，DNP-基团导致相反的洗脱顺序。

CSP 1和CSP 2的SOs为结构同系物，其仅在其酸功能类型方面不同。另外，CSPs两者具有几乎相同的SO载荷。CSP 1与CSP 2之间保留时间的显著差异因此可用酸强度进行解释：CSP 2中较强的磺酸与CSP 1中较弱的羧酸相比较为更主要的-在该具体情况中为分子内-反离子，并且因此导致在流动相中相似的酸浓度下保留时间更短。因此，羧酸基CSP 1的保留因子例如就二酸DNB-Glu而言为磺酸基CSP 2的至多4倍。此时应该注意固有的或分子内反离子对于离子交换剂基对映体选择性层析法的影响将成为普遍存在于制备中的另一项详细研究的课题。在相似的SO载荷下，磺酸型CSPs 3与4之间的对映体选择性与保留时间的所占份数的显著差异反映了通过其非对映体SO变化分析物的各种分子识别方法。

分析物对映体的洗脱顺序和转换洗脱顺序的能力可能是关键的，例如当其开始杂质分布(profiling)和制备型对映体分离时[42]。在本文中，合成低分子量SOs及相应的CSPs可提供其使得能够通过转换为相反构型的CSP转换洗脱顺序的有利条件。对于在此呈现的两性离子CSPs的母体CSPs两者(参见图1)，该种洗脱顺序逆转在先前已经得到显示[13，35，38]，例如对于奎宁基弱阴离子交换剂CSP及其伪对映体奎尼丁基CSP。CSPs 1-5显示类似的性能(表1)。手性酸性分析物在对映体分离时的洗脱顺序对两性离子CSPs 1-4总是相同的，后者全部为基于奎宁的，并且与标准的纯阴离子交换剂类型奎宁基CSP的文献报导的洗脱顺序一致。相反，CSP 5，其采用伪对映体奎尼丁作为SO的部分，导致与CSPs 1-4相比，洗脱顺序相反。这些结果有力地提示新型两性离子CSPs对与常规的奎宁-和奎尼丁型CSP非常相似的酸性分析物呈现金鸡纳树属基占优势的手性识别机制。因此，已经在生物碱部分的O9-位引入的酸性基团根本不改变该分子的识别情况。

手性胺的对映体分离

在证实了对于手性酸性分析物的对映体选择性之后，由于其金鸡纳树属基本基元，两性离子CSPs被研究在其阳离子交换剂位点基础上关于其对于手性胺对映体的分离潜力。尤其重要的是评价是否能够通过结合反式-2-氨基环己烷磺酸部分将对映体选择性自SCX CSP转化成新型两性SOs或者是否甚至非手性酸性侧链结合生物碱结构可提供给手性胺溶质对映体选择性。为了这个目的，研究一组12种手性碱，其主要包括药物例如β-阻滞剂、β-拟交感神经药物及其它药物(参见表2)。采用其直接选用自近来报导的对于SCX CSPs的研究的未最佳化的流动相条件实施层析法[13]。结果概述于表2中。

表2

各种手性碱性分析物在CSP 1-5上的HPLC对映体分离a)

^a)条件：柱尺寸150x4mm I.D.；流动相：50mM甲酸和25mM二乙胺在乙腈/MeOH(9/1，v/v)中；流速1.0ml/分钟；T 25℃；t₀＝1.49分钟。UV检测在254nm下。n.d.＝未测定。EO＝洗脱顺序(ORD检测)。

^b)分析物描述：名称，项目编号，结构式

^c)流动相：50mM甲酸和25mM二乙胺在MeOH中

^d)甲氟喹：赤(erythro)-α-2-哌啶基-2，8-双(三氟甲基)-4-喹啉甲醇

总之，存在两种截然不同的与酸性选择剂亚单位的手性有关的观察结果。两性离子CSPs 3和4两者-其具有手性酸性部分-对于所选择的分析物显示与母体SCX CSP相似的在α＝1.05-2.00范围内的对映体选择性。因此，CSP 3显然通过基线分离全部12种分析物提供了广泛的应用范围。然而CSP 4通过仅比CSP 3更好地分离一种分析物(表2中的项目8)和总共5种溶质，显示不太显著的对映体选择性。相反，CSPs 1，2和5-每一种具有酸性但是非手性的侧链-对于所选择的一组分析物显示可忽略不计的对映体选择性，除了抗疟药甲氟喹(项目4)可用5种两性离子CSPs中的任何一种基线进行分离以外。这导致最终结果为CSP 3和4中的手性反式-2-氨基环己烷磺酸部分确实是有益的，但是对于所讨论的两性离子CSPs对手性胺观察到的对映体选择性特性不是必须的。所测量的洗脱顺序没有显示一般趋势。

当操作CSP 3和4时，它们依赖于非对映体手性选择剂，但是在其酸亚单位具有相反构型，对于5种溶质(项目1，3，7，8和9)发现洗脱顺序相反，而对于4种其它分析物洗脱顺序保持不变(项目4，10，11和12)，这显然表示融合的两性离子实体的手性亚单位不是完全相互独立地起作用。另外，比较伪对映体CSPs 2和5(项目3和4)的洗脱顺序指出生物碱基元的引导影响。显然，仿佛像是除了手性β-氨基环己烷磺酸部分的关键作用外，生物碱亚结构的“手性环境”也在某种程度上与对在此选择的胺分析物的总体手性识别过程有关。例如，对于甲氟喹非常高的对映体选择性(α＞15基于CSP 3)提示在该具体情况中，奎宁基元是关键的，并且联合手性酸亚单位使得很好结合的甲氟喹对映体能够实现几乎“理想的拟合”，这种对映体也造成其保留时间强烈增加。

以上提及的关于手性酸和手性胺的对映体分离结果确实表明在一个SO基元结合阴离子和阳离子交换剂两者的概念已经获得成功，尤其是对于其中已经选择的手性酸性和碱性亚单位在一个单一选择剂中融合在一起时仍然如所证实的那样运行的CSPs 3和4。因此，现在新型两性离子材料如CSP 3和4使得能够用一个单一的但是两性离子交换剂类型CSP进行手性酸和手性碱的对映体分离。

手性两性离子分析物的对映体分离

通过基于两性离子SOs的CSPs直接层析法对映体分离两性离子分析物如未保护的氨基酸可对对映体选择性离子交换剂开辟新的用途。因此，第一至关重要的是确定该现象是否可具有宽的范围，和我们是否可深入了解手性两性离子交换剂的该扩展的相互作用机制。为了这些目的，收集了相当大的各组的两性离子分析物(表3)，其包括环状和非环状、天然和非天然的具有1和2个手性中心、具有伯和仲氨基、具有羧酸和磺酸及具有包含侧链的脂肪族、芳族和官能团的α-和β-氨基酸以及几种二肽。

表3

各种手性两性离子分析物在CSP 1-5上的HPLC对映体分离^a)

^a)条件：柱尺寸150x4mm I.D.；流动相：50mM甲酸和25mM NH₃在MeOH中；流速1.0ml/分钟；T 25℃；t₀＝1.49分钟。

^b)分析物描述：名称，项目编号，结构式。

^c)Tic：1，2，3，4-四氢异-喹啉-3-羧酸

^d)CHSA：反式-2-氨基环己烷磺酸(1S，2S)/(1R，2R)

已经用于对映体分离手性酸和手性胺的层析条件(参见以上部分)证明也可直接用于两性离子分析物的对映体分离。因此并且为了概念清晰起见，对于在此呈现的对两性离子溶质的研究没有实施流动相最佳化。然而，预计流动相变化使得两性离子溶质的洗脱和分离能够实现分析物特异性的最佳化，尤其是关于水溶液的pH或非水洗脱剂系统中的质子活性。

层析结果和溶质结构两者在表3中得到描绘，但是在详细地讨论这些结果之前，应提供一些另外的信息：在对照实验中，CSPs的母体类型两者(参见图1)被试验其对映体分离能力-奎宁基WAX对碱性和两性离子溶质，和2-氨基环己烷磺酸基SCX对表1-3的酸性和两性离子分析物的对映体分离能力。将碱性分析物注射到刚好在柱的空隙体积表明稍微排斥而不是吸引之前洗脱的WAX型CSP上并且未对映体分离。注射到SCX型CSP上的酸性溶质显示类似的情况。这些结果可用SO和溶质两者是否带有相同符号的电荷，主要发生静电排斥并且CSP排除而不是保留溶质的事实进行解释。对于在给定的弱酸性流动相条件下的两性离子分析物，对于CSPs两者仅观察到非常弱的保留且没有对映体分离(相应的数据未显示)-不象采用新型两性离子CSPs时。这些结果得出这样的结论，即溶质的两个带电位点，即质子化的胺和解离的酸近似同时地(quasi simultaneously)由CSPs 1-5的同样双电离两性离子SOs识别并且该双离子相互作用对于所观察的两性离子分析物基于两性离子CSPs 1-5的对映体分离具有重大意义。

对于表3中显示的所有化合物，用5种两性离子CSPs之一可实现基线分离或者至少部分分离。因为分析物组是相当不同的，关于手性两性离子分析物的对映体分离的广泛范围的适用性可被赋予新型两性离子CSPs。当然柱性能在不同的CSPs中和对于每一种分析物不是同等分布的。关于在分析物结构中的趋势，例如色氨酸及其衍生物组可被很好地分离，而对于包含芳族基团的其它氨基酸如苯丙氨酸和酪氨酸对映体选择性更低并且不能总是达到分离。另外，具有仲胺基团的环状氨基酸比亮氨酸-和甘氨酸型的非环状脂肪族氨基酸稍微分离的更好一些，这可能是由于其更刚性的结构所致。还有，令人惊讶的是对于反式-2-氨基环己烷磺酸(项目33)，一个为CSP 3和4的SOs的必需部分的部分，未发生分离，而对于1，2-二甲基氨基乙磺酸(项目37)，非环状对应物，得到相当好的对映体选择性。一种更通常的观察结果是对于α-烷基取代的α-氨基酸对映体选择性与非取代的化合物相比较明显增加，如同例如对于苯丙氨酸(项目13和14)或酪氨酸(项目18和28)可见的那样。

总之，分离有时具有峰拖尾的缺点，其中尽管对映体选择性相当好，不能观察到基线分离，例如在依氟鸟氨酸和携带另外官能团的其它氨基酸情况中。在此，可起H-键供体或受体作用的另外的荷电或部分荷电基团与官能团可干扰两性离子分析物与SO的准确定向键合，并且因此导致解析动力学降低。流动相及其pH或质子活性的最佳调节预计将减少这样的现象，但是在该项研究中没有进一步试验。

在该项工作中呈现的CSPs涉及弱阳离子/弱阴离子交换剂(CSP 1)或强阳离子/弱阴离子交换剂(CSP 2-5)。在本文中，由强阳离子交换剂和强阴离子交换剂部分两者，即磺酸如CSPs 2-4和季铵化奎宁环氮组成的两性离子SO，可以是非常独到的并且目前在我们小组的研究中。

除了全面观察在表3中显示的鉴于分析物结构的数据，CSPs选择剂的结构差异及其对映体分离和层析结果也必须加以考虑。

CSP 1和CSP 2已经被合成并试验以便比较两性离子SO中的羧酸和磺酸官能团。其SOs为结构同系物，但是仅在其酸性官能团类型方面不同(图1)并且CSPs两者具有非常相似的SO载荷，这使其能够进行直接比较。来自表3的结果表明对CSP 1和2的分离性能存在显著差异。对于羧酸基CSP 1的保留因子总是小于磺酸基CSP 2。显然，在给定的流动相条件下，SO中更强的酸部分导致与两性离子分析物的碱性取代基更强的离子相互作用。另外，CSP 2提供对于显著改善的分离度毫无例外地保持的更好的最高效率，即使对映体选择性与自项目28(表3)可例举见到的相似。CSP 1最可能对流动相最佳化敏感，但是磺酸官能团明显更好地适合于使用方便的两性离子CSP。

CSPs 3和4两者依赖于奎宁-和反式-2-氨基环己烷磺酸基选择剂，但是由于酸部分中的相反构型为非对映体。不管其基本结构的相似性，因此期望它们在结合两性离子分析物时呈现对映体选择性差异。用于直接比较的支持对于相应的CSPs 3和4两者为几乎相同的SO载荷。因此，甚至更令人惊奇的是CSP 3对表3中所有的溶质(除了仅有一种溶质(项目31)以外)显示更大的保留因子。显然，与CSP 4相比较，CSP 3’的两性离子结合位点的立体几何学使得能够普遍更紧密地结合氨基酸和肽。大体上，尽管更强的结合不必意指更高的对映体选择性。然而，全部分析物的大约75％在CSP 3上比在CSP 4上也被更好地分离。

总之，CSP 3在该研究中呈现的所有CSPs中提供最大的分离以及最好的分离两者。因此其举例说明了合成最佳化的手性SO结构的潜力并可进一步指导选择剂设计与合成。作为以上讨论的表3数据的补充例证，在图4中显示了采用CSP 3对β-氨基酸(β-新戊基甘氨酸，项目12)、环状氨基酸(脯氨酸，项目29)和色氨酸(项目35)进行对映体分离所选择的层析图。

洗脱顺序是阐明手性识别机制和在本案中认为对映体选择性相互作用是由CSPs 1-5系列中不同的SOs酸性和碱性亚单位引起的必要信息。因此，测定来自表3的几种分析物的洗脱顺序。最初，酸性亚单位的影响被认为是因为CSP 3和CSP 4的酸性部分具有相反构型并可潜在地影响洗脱顺序。如以上讨论的那样，CSP 3和4在分析两性离子溶质时保留时间和选择性也是不同的。还有，在两种环己烷磺酸基材料之间观察到对两性氨基酸分析物的洗脱顺序没有变化，表明手性酸性部分是重要的，但是在两性离子对映体识别方法中不是主要的。另外，包含非手性酸性部分的CSP 1和2也显示如CSP 3和4一样的相同洗脱顺序。换言之，所有四种采用奎宁基元的CSPs提供相同的洗脱顺序。仅有采用基于奎尼丁并且为对CSP 2的伪对映体的CSP 5的两性离子溶质的洗脱顺序颠倒。这些结果强烈提示生物碱几何形状不仅对于手性酸性溶质，而且对于手性两性离子和两性化合物而言，都是手性识别与对映体区分的核心问题。

在该项工作中呈现的新的一类手性两性离子固定相证实了不仅分离手性酸或手性胺，而且对两者-和另外地也分离两性离子化合物-通过协同支持的离子配对(离子交换)-介导的方法呈现显著的对映体选择性特性。图5用手性碱性药物甲氟喹、N-保护的苯丙氨酸和游离氨基酸以CSP 3得到的对映体分离层析图描绘了这些特征。

图6图解说明了新型两性离子分离材料CSP 4与其母体，纯的阳离子和阴离子交换剂CSPs SCX和QN-AX的比较(参见图1)。显然，洗脱性能由于存在于CSP 4的手性选择剂结构中的分子内反离子而显著变化。对映体选择性在将手性阳离子和阴离子交换剂亚结构融合为一个单一的手性选择剂时可得到很好地保持。

结论

已制备基于两性离子SOs的新型离子交换剂类型CSPs并评价其在HPLC中对手性酸、手性胺和手性氨基酸的对映体分离。

本发明的SOs类似于在一个单一手性化合物中的阳离子-与阴离子交换剂SO基元的联合。它们的合成在很大程度上直接采用常规的和市售可得到的起始原料。分离N-封端氨基酸，同种物质弱阴离子交换剂CSP的代表性酸性分析物的对映体选择性可在很大程度上被保持，而关于洗脱顺序的结果和N-衍化基团的影响表明主要是未变化的结合机制，如同对于金鸡纳树属氨基甲酸酯型CSPs描述的那样。用新型两性离子CSPs，再以与先前报导的母体SCX CSP类似的方式，也可获得对手性胺的对映体选择性。

另外，本发明使得能够经双重离子配对方法进行两性离子分析物的对映体分离：用新型两性离子CSPs 1-5可实现基线分离或者至少部分分离各种类型和结构中的40种氨基酸以及二肽。一般的分离概念可由其导出，其中根本的分子识别机制受到SO的生物碱亚结构支配，但是分离仅可相应地与酸性侧链的支撑物组合发生。在此研究的两性离子CSPs中，CSP 3提供了酸、碱和氨基酸的最多和最好的对映体分离。

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附图说明

图1.弱阴离子交换剂(WAX)和强阳离子交换剂(SCX)CSPs

图2.两性离子CSPs 1-5

图3.用于制备CSPs 1-5的合成流程.a)氯甲酸4-硝基酯，甲苯，＜95％.b)氨基酸，BS A，CH₂Cl₂，55-90％.c)巯基改性的硅胶，AIBN，MeOH.

图4.(a)DL-脯氨酸，(b)DL-β-新戊基甘氨酸，和(c)DL-色氨酸(全部来自表3)在CSP 3(150x4mm I.D.)上的对映体分离的HPLC层析图.流动相：50mM甲酸和25mM二乙胺在MeOH中.T：25℃，检测：CAD或UV在254nm处，1.0ml/分钟.

图5.显示(a)DNB-苯丙氨酸(表1)，(b)甲氟喹(表2)，和(c)DL-α-甲基色氨酸(表3)在CSP 3上的对映体分离的HPLC层析图的两性离子CSPs通用性和选择性的图解.柱尺寸150x4mm I.D.；流动相：50mM甲酸和25mM二乙胺在MeOH中；T：25℃；检测：UV在254nm处；流速1.0ml/分钟.

图6.显示在CSP 4(a)和WAX(b)上的DNB-苯丙氨酸(表1)和在SCX(c)与CSP 4(d)上的甲氟喹(表2)的对映体分离的HPLC层析图的单一离子交换剂和两性离子CSPs的不同洗脱性能的图解.柱尺寸150x4mm I.D.；流动相：50mM甲酸和25mM氨在MeOH中(在QN-AX上：100mM甲酸和50mM氨在MeOH中)；T：25℃；检测：UV在254nm处；流速1.0ml/分钟。

具体实施方式

对映体选择性两性离子交换材料专利购买费用说明