专利摘要

本发明涉及高效液相色谱固定相，具体的说是一种亲水作用色谱/离子交换色谱混合固定相及其制备和应用。亲水作用色谱/离子交换色谱混合固定相结构为式一所示，其中，X为‑OCH3或‑OCH2CH3；Y1为F‑、Cl‑、Br‑、I‑、BF4‑、Tf2N‑、CF3SO3‑、SCN‑、NO2‑或NO3‑；Y2为‑NHCH3、‑N(CH3)2、‑N+(CH3)3Y1‑、‑NHCH2CH3、‑N(CH2CH3)2或‑N+(CH2CH3)3Y1‑；n＝2或3。本发明所制备的混合型色谱固定相原料易得、制备步骤简单，对多种糖类均显示出很好的保留和分离选择性，具有良好的推广应用前景。

权利要求

1.一种亲水作用色谱/离子交换色谱混合固定相，其特征在于：亲水作用色谱/离子交换色谱混合固定相结构为式一所示，

其中，X为-OCH3或-OCH2CH3；Y1为F-、Cl-、Br-、I-、BF4-、Tf2N-、CF3SO3-、SCN-、NO2-或NO3-；Y2为-NHCH3、-N(CH3)2、 -NHCH2CH3、-N(CH2CH3)2或 n＝2或3。

2.按权利要求1所述的亲水作用色谱/离子交换色谱混合固定相，其特征在于：所述固定相是将硅烷偶联剂键合到硅胶载体上，再引入离子液体，进而获得式一所示亲水作用色谱/离子交换色谱混合固定相。

3.一种按权利要求1所述的亲水作用色谱/离子交换色谱混合固定相的制备，其特征在于：

1)将硅胶经硅烷化试剂处理得硅烷化硅胶；

2)将咪唑与末端为卤素的烷基胺反应得到N-(n-氨基烷基)咪唑，再与碘代烷烃反应得到末端为烷基胺的衍生物；

3)将步骤2)所得末端为烷基胺的衍生物与步骤1)所得硅烷化硅胶反应，得Y1为卤素的式一所示亲水作用色谱/离子交换色谱混合固定相；

4)利用上述获得Y1为卤素的式一所示亲水作用色谱/离子交换色谱混合固定相再与盐进行离子交换，进而获得式一所示亲水作用色谱/离子交换色谱混合固定相；式中Y1为BF4-、Tf2N-、CF3SO3-、SCN-、NO2-或NO3-。

4.按权利要求3所述的亲水作用色谱/离子交换色谱混合固定相的制备，其特征在于：所述步骤1)中，硅烷化试剂为3-氯丙基三甲氧基硅烷、3-氯丙基三乙氧基硅烷、3-溴丙基三甲氧基硅烷或3-溴丙基三乙氧基硅烷；其中，硅胶表面硅羟基与硅烷化试剂的摩尔比为1:1.5-1:4。

5.按权利要求3所述的亲水作用色谱/离子交换色谱混合固定相的制备，其特征在于：所述步骤2)中，N-(n-氨基烷基)咪唑数量与碘代烷烃数量的摩尔比为1:1-3.5。

6.按权利要求3所述的亲水作用色谱/离子交换色谱混合固定相的制备，其特征在于：所述步骤2)中，所述烷基胺有如下结构：

其中，R为卤素，n＝2或3。

7.按权利要求3所述的亲水作用色谱/离子交换色谱混合固定相的制备，其特征在于：所述步骤2)中碘代烷烃为ICH₃或ICH₂CH₃。

8.按权利要求3所述的亲水作用色谱/离子交换色谱混合固定相的制备，其特征在于：在所述步骤3)中，所述硅烷化硅胶表面卤素原子数量与所得咪唑衍生物数量的摩尔比为1:1.5-1:4。

9.按权利要求3所述的亲水作用色谱/离子交换色谱混合固定相的制备，其特征在于：所述步骤3)反应在以无水甲苯为反应溶剂，三乙胺为催化剂的反应体系内，于无水无氧条件下磁力搅拌回流反应24-48hr；反应完全后经丙酮洗涤、离心机离心3-8次，离心后干燥；其中，甲苯的加入量与硅胶的体积质量比均为5-10:1(mL/g)。

10.一种按权利要求1所述的亲水作用色谱/离子交换色谱混合固定相的应用，其特征在于：

所述亲水作用色谱/离子交换色谱混合固定相在高效液相色谱中对糖类分离的应用。

说明书

技术领域

本发明涉及高效液相色谱固定相，具体的说是一种亲水作用色谱/离子交换色谱混合固定相及其制备和应用。

背景技术

高效液相色谱技术(High performance liquid chromatography，HPLC)是发展于20世纪60年代的一种快速、灵敏的色谱技术，广泛应用于小分子[Ding X.,Wang X.,Chen L.,et al.J.Chromatogr.A,2011,1218,1227.]和大分子[Wattanasiritham L.,Theerakulkait C.,Maier C.Food Chem,2016,192,156.]等各种领域的分析和分离。其中，反相液相色谱(RPLC)是目前使用最为广泛的高效分离技术，但是，RPLC中使用的疏水固定相(如C18、C8等)对强极性化合物(如寡糖、糖苷和强极性寡肽等)的保留很弱，甚至不保留，因此强极性化合物在RPLC上不能得到很好的分离。亲水作用色谱(HILIC)于1990年有Alpert[Alpert,A.J.J.Chromatogr.1990,499,177.]首先提出，其采用极性固定相，能够很好地保留反相色谱中不保留或者保留弱的极性与亲水性化合物，同时采用与反相色谱类似的水和水溶性溶剂为流动相，解决了正相色谱中样品的溶解性与质谱(MS)的兼容性问题。近年来，HILIC受到了极大的关注，得到了很好的发展与应用。

尽管如此，传统HPLC本身的分离模式通常为单一模式，即利用一种溶质和固相的相互作用关系进行几种溶质之间的分离，在实际应用中，针对不同的分离对象往往需要依据其体系的理化性质选择不同的分离方法。混合模式色谱(Mixed-mode chromatography，MMC)是近年来发展起来的一类新型方法。它是利用样品与固定相之间存在多种作用力，在一次分离过程中实现两种或多种分离机制共同主导的分离，从而表现出与单一色谱模式不同的分离特性。与传统的单一模式色谱相比，MMC有更高的选择性和负载量[Fu Q.,Shen A.,et al.J.Chromatogr.A 2015,1388,110.]。目前已报道的MMC主要有RPLC/IEC，HILIC/IEC，HIC/IEC，RPLC/HILIC等几种类型，己被广泛应用到对不同类别的实际样品的分离中[Wang Q.,Long Y.,Yao L.,et al.,Talanta 2016,146,442.]，这种利用混合作用力分离溶质的色谱固定相体现出明显的优势。

近年来,离子液体作为一种新型的离子化溶剂在化学化工许多领域引起了广泛的关注。离子液体的非挥发性、低熔点、宽液程、强极性、不可燃性、良好的导电和导热性、高稳定性、选择性溶解力等特点，使得离子液体在有机合成、催化、分离分析、电化学等领域有着广泛的应用前景。一般情况下，离子液体的阳离子组成部分是有机阳离子，如咪唑、吡啶、噻唑、吡嗪、烷基季铵离子及烷基季 离子等。阴离子组成部分可以是无机的也可以是有机的离子，如Cl-、Br-、I-、[BF4]-、[PF6]-、[AICl4]-、[Al2Cl7]-、[CF3CO2]-、[CF3SO3]-、[CnH2n+1CO2]-、[Tf2N]-等。迄今为止，研究最多的离子液体是单阳离子型[Wu T.,Su S.,Gung S.,et al.Electrochim.Acta,2010,55,4475.；Bao W.,Wang Z.,Li Y..J.Org.Chem.,2003,68,591.；Zhao D.,Fei Z.,Geldbach T.J.,et al.J.Am.Chem.Soc.,2004,126,15876.；Huang J.,Jiang T.,Gao H.,et al.Angew.chem.int.edit.,2004,43,1397.]。近年来，双阳离子型离子液体以其优良的性能引起了广泛关注[Lall S.I.,Mancheno D.,Castro S.,et al.Chem.Commun.,2000,2,413.Singh R.P.,Shreeve J.M.Chem.Commun.,2003,12,1366.；Payagala T.,Huang J.,Armstrong D.W.,et al.Chem.Mater.,2007,19,5848.；Han X.,Armstrong D.W.,Org.Lett.,2005,7,4205.；Zeng Z.,Phillips B.S.,Shreeve J.M.,et al.Chem.Mater.,2008,20,2719.；Anderson J.L.,Armstrong D.W.,Anal.Chem.,2005,77,6453.；Leclercq L.,Suisse I.,Nowogrocki G.,et al.Green Chem.,2007,9,1097.；Holbrey J.D.,Visser A.E.,Rogers R.D.,et al.Green Chem.,2003,5,129.]。双阳离子型离子液体最显著的性质体现在极好的热稳定性，此外，还具有高密度、高黏度和更宽的液程等优良性能，应用领域极其广泛。

作为目前应用较为广泛的商品化氨基柱，对极性化合物的分离展现出优异的分离能力，但是其在使用过程中易氧化、易水解，从而导致柱寿命较短。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种亲水作用色谱/离子交换色谱混合固定相的制备方法和应用。

为实现上述目的，本发明采用技术方案为：

一种亲水作用色谱/离子交换色谱混合固定相，固定相结构为式一所示，

其中，X为-OCH₃或-OCH₂CH₃；Y₁为F^-、Cl^-、Br^-、I^-、BF₄^-、Tf₂N^-、CF₃SO₃^-、SCN^-、NO₂^-或NO₃^-；Y₂为-NHCH₃、-N(CH₃)₂、-N⁺(CH₃)₃Y₁^-、-NHCH₂CH₃、-N(CH₂CH₃)₂或-N⁺(CH₂CH₃)₃Y₁^-；n＝2或3。

所述固定相是将硅烷偶联剂键合到硅胶载体上，再引入离子液体，进而获得式一所示亲水作用色谱/离子交换色谱混合固定相。

一种亲水作用色谱/离子交换色谱混合固定相的制备：

1)将硅胶经硅烷化试剂处理得硅烷化硅胶；

2)将咪唑与末端为卤素的烷基胺反应得到N-(n-氨基烷基)咪唑，再与碘代烷烃反应得到末端为烷基胺的衍生物；

3)将步骤2)所得末端为烷基胺的衍生物与步骤1)所得硅烷化硅胶反应，得Y1为卤素的式一所示亲水作用色谱/离子交换色谱混合固定相；

4)利用上述获得Y1为卤素的式一所示亲水作用色谱/离子交换色谱混合固定相再与盐进行离子交换，进而获得式一所示亲水作用色谱/离子交换色谱混合固定相；式中Y₁为BF₄^-、Tf₂N^-、CF₃SO₃^-、SCN^-、NO₂^-或NO₃^-。所述盐为BF₄^-、Tf₂N^-、CF₃SO₃^-、SCN^-、NO₂^-或NO₃^-阴离子与锂、钠或钾阳离子形成的盐。

所述步骤1)中，硅烷化试剂为3-氯丙基三甲氧基硅烷、3-氯丙基三乙氧基硅烷、3-溴丙基三甲氧基硅烷或3-溴丙基三乙氧基硅烷；其中，硅胶表面硅羟基与硅烷化试剂的摩尔比为1:1.5-1:4。

所述步骤2)中，N-(n-氨基烷基)咪唑数量与碘代烷烃数量的摩尔比为1:1-3.5。

所述步骤2)中，所述烷基胺有如下结构：

其中，R为卤素，n＝2或3。

所述步骤2)中碘代烷烃为ICH3或ICH2CH3。

所述步骤3)中，所述硅烷化硅胶表面卤素原子数量与所得咪唑衍生物数量的摩尔比为1:1.5-1:4。

所述步骤3)反应在以无水甲苯为反应溶剂，三乙胺为催化剂的反应体系内，于无水无氧条件下磁力搅拌回流反应24-48hr；反应完全后经丙酮洗涤、离心机离心3-8次，离心后干燥；其中，甲苯的加入量与硅胶的体积质量比均为5-10:1(mL/g)；所述三乙胺滴加至反应体系内，滴加量约为40-120μL。

一种亲水作用色谱/离子交换色谱混合固定相的应用，所述亲水作用色谱/离子交换色谱混合固定相在高效液相色谱中对糖类分离的应用。

本发明获得的一种亲水作用色谱/离子交换色谱混合固定相具有以下优点：

1.本发明固定相在氨基柱的基础上将氨基取代为烷基胺，并引入离子液体，通过化学方法键合而成，结构稳定；

2.本发明固定相制备中原料易得，操作步骤简单；

3.本发明固定相同时拥有离子液体的特性和硅胶在使用过程中的稳定性，而且柱压小，对多种糖类均能达到较好的分离效果。

4.本发明混合模式固定相，对糖类等极性化合物展现出更强大的分离能力。

附图说明

图1为本发明实施例1制备的一种亲水作用色谱/离子交换色谱混合固定相制得的色谱柱所测柱效的色谱图。

图2为本发明实施例1制备的一种亲水作用色谱/离子交换色谱混合固定相用于分离单糖、二糖和三糖的色谱图。

图3为本发明实施例1制备的一种亲水作用色谱/离子交换色谱混合固定相(a)与商品化经典氨基柱(富士氨基硅胶填料)(b)、Waters高效碳水化合物分析柱(经典硅胶氨基柱)(c)用于分离糖类化合物的色谱图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明并不限于以下的实施例内容。

实施例1

称取硅胶4.393g置于100mL三口烧瓶中，用滴液漏斗加入40mL无水甲苯、6.418g 3-氯丙基三甲氧基硅烷，并加入80μL三乙胺作为催化剂。氩气保护下，回流反应24hr。反应结束后过滤，键合硅胶用丙酮抽提24hr，干燥后得到4.913g硅烷化硅胶。

称取4.127g咪唑和10.013g无水碳酸钾于250mL三口烧瓶中，用滴液漏斗加入50mL丙酮，搅拌下用滴液漏斗加入溶于50mL丙酮的3-氯丙胺盐酸盐，再加入50mL丙酮，氩气保护下，回流反应6hr。反应结束后过滤，滤液用水泵减压旋蒸去除丙酮，然后改用油泵蒸馏产品，收集145-155℃的馏分，制得N-(3-氨基丙基)咪唑。

称取5.330g所述N-(3-氨基丙基)咪唑和6.044g碘甲烷置于100mL三口烧瓶中，加入40mL无水四氢呋喃，回流反应24hr。反应结束后用水泵减压旋蒸去除四氢呋喃，得到5.568g末端为二甲胺基的咪唑衍生物。其结构为：

称取4.648g硅烷化硅胶置于100mL三口烧瓶中，加入40mL无水甲苯、5.131g上述获得末端为二甲胺基的咪唑衍生物，加入40μL三乙胺作为催化剂。氩气保护下，回流反应24hr。反应结束后过滤，并用丙酮抽提12-24hr，干燥至恒重，得到5.105g混合型色谱固定相。固定相的结构为：

利用高效液相色谱仪，以萘为检测物测定保留时间和柱效，流动相为甲醇，等度洗脱，检测波长为DAD 254nm，流速为1.0mL/min。对所制得的色谱柱进行柱效测定，结果见图1。

实施例2

将上述获得色谱柱在亲水作用色谱模式下分离单糖、二糖和三糖。利用高效液相色谱示差折光检测法，以乙腈/水(85/15,v/v)作为流动相，等度洗脱，流速为1.0mL/min，检测温度为30℃。色谱图如图2所示(1为鼠李糖，2为木糖，3为果糖，4为甘露糖，5为葡萄糖，6为蔗糖，7为麦芽糖，8为乳糖，9为海藻糖，10为蜜二糖，11为棉籽糖，12为松三糖)。

由图2可见，本发明的色谱柱能够一次性完全分离12种糖类化合物，显示出优异的分离能力。

实施例3

利用上述实施例制得的色谱柱(a)与商品化经典氨基柱(富士氨基硅胶填料)(b)、Waters高效碳水化合物分析柱(经典硅胶氨基柱)(c)在亲水作用色谱模式下分离糖类化合物。利用高效液相色谱示差折光检测法，以乙腈/水(85/15,v/v)作为流动相，等度洗脱，流速为1.0mL/min，检测温度为30℃。色谱图如图3所示(1为鼠李糖，2为木糖，3为果糖，4为甘露糖，5为葡萄糖，6为蔗糖，7为麦芽糖，8海藻糖)。

由图3可见，本发明的色谱柱较其它两种经典氨基柱表现出对糖类化合物更强的保留能力。

实施例4

与实施例1不同之处在于，采用碘乙烷代替碘甲烷，按实施例1的合成步骤，称取5.124g所述N-(3-氨基丙基)咪唑和6.385g碘乙烷置于100mL三口烧瓶中，加入40mL无水四氢呋喃，回流反应24hr。反应结束后用水泵减压旋蒸去除四氢呋喃，得到5.753g末端为二乙胺基的咪唑衍生物。其结构为：

称取4.526g硅烷化硅胶置于100mL三口烧瓶中，加入40mL无水甲苯、5.898g上述获得末端为二乙胺基的咪唑衍生物，加入40μL三乙胺作为催化剂。氩气保护下，回流反应24hr。反应结束后过滤，并用丙酮抽提12-24hr，干燥至恒重，得到5.327g混合型色谱固定相。固定相的结构为：

实施例5

与实施例1不同之处在于，称取3倍于实施例1中的碘甲烷，按实施例1的合成步骤，称取5.112g所述N-(3-氨基丙基)咪唑和17.391g碘甲烷置于150mL三口烧瓶中，加入60mL无水四氢呋喃，回流反应24hr。反应结束后用水泵减压旋蒸去除四氢呋喃，得到8.755g末端为三甲基季铵离子的咪唑衍生物。其结构为：

称取4.356g硅烷化硅胶置于100mL三口烧瓶中，加入40mL无水甲苯、5.269g上述获得末端为三甲基季铵离子的咪唑衍生物，加入40μL三乙胺作为催化剂。氩气保护下，回流反应24hr。反应结束后过滤，并用丙酮抽提12-24hr，干燥至恒重，得到5.240g混合型色谱固定相。可得另一种混合型色谱固定相。固定相的结构为：

实施例6

将实施例1所得咪唑类离子液体型亲水作用色谱/离子交换色谱混合固定相与四氟硼酸钠反应进行离子交换进而获得相应的固定相。

称取5g实施例1所得咪唑类离子液体型亲水作用色谱/离子交换色谱混合固定相、3g四氟硼酸钠置于150mL单口烧瓶中，加入50mL二氯甲烷，搅拌反应24hr。反应结束后过滤，依次用水和乙醇各洗涤3次，60℃下干燥10hr即得固定相。固定相结构为：

另经检测，由本发明实施例1制备的亲水作用色谱/离子交换色谱混合固定相制得的色谱柱在运行100小时，放置两个月后再进行糖类化合物的分离，实验结果表明大部分糖类化合物的分离结果基本保持不变，说明该固定相拥有较好的耐用性和稳定性。

以上所述内容，仅为本发明的较佳实施例，并非用以限定本发明的范围，即凡是依据本发明申请的权利要求书及说明书内容所作的简单、等效变化与修饰，皆落入本发明专利的权利要求保护范围。

一种亲水作用色谱/离子交换色谱混合固定相及其制备和应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。