专利摘要

本发明公开了具有通式I结构的鹅去氧胆酸衍生物或其可药用的盐、其制备方法及用途，该化合物能上调FXRmRNA和SHPmRNA的转录水平，能够明显激活FXR，可用于制备治疗或预防高血脂症、动脉粥样硬化、非酒精性脂肪肝炎、II型糖尿病糖尿病等与血脂相关疾病的药物。

权利要求

1.一种具有通式I结构的鹅去氧胆酸衍生物或其可药用的盐：

其中，

R选自-OR2或-NR3R4，其中R2、R3、R4分别选自C1～C6烷基、苯基；其中，R2不包括C1烷基；

R还可以选自其中n＝1～4。

2.根据权利要求1所述的具有通式I结构的鹅去氧胆酸衍生物或其可药用的盐，为如下任一种：

3α，7α-羟基-12-肟基-5β-胆烷酸乙酯；3α，7α-羟基-12-肟基-5β-胆烷酰甲胺；

3α，7α-羟基-12-肟基-5β-胆烷酰乙胺；3α，7α-羟基-12-肟基-5β-胆烷酰二甲胺；

3α，7α-羟基-12-肟基-5β-胆烷酰哌啶烷；3α，7α-羟基-12-肟基-5β-胆烷酰苯胺。

3.一种药物组合物，其含有治疗有效量的一种或多种如权利要求1或2所述的具有通式I结构的鹅去氧胆酸衍生物或其可药用的盐，及药学上可接受的载体。

4.权利要求1所述的具有通式I结构的鹅去氧胆酸衍生物或其可药用的盐的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

化合物1与甲醇酯化反应得到中间体2，再与乙酸酐酯化得到中间体3，中间体3氧化得中间体4，然后水解得中间体5，中间体5与甲醇酯化得化合物6，化合物6与盐酸羟胺反应得化合物Ib，化合物Ib水解得到化合物Ia，化合物Ia与醇酯化或与胺酰化得到通式I的化合物。

5.权利要求4所述的具有通式I结构的鹅去氧胆酸衍生物或其可药用的盐的制备方法，其特征在于：所述醇酯化采用的醇为乙醇。

6.权利要求4所述的具有通式I结构的鹅去氧胆酸衍生物或其可药用的盐的制备方法，其特征在于：所述胺酰化采用的胺为甲胺盐酸盐、乙胺盐酸盐、二甲胺盐酸盐、哌啶或苯胺。

7.权利要求1或2所述的具有通式I结构的鹅去氧胆酸衍生物或其可药用的盐在制备治疗或预防高血脂症、动脉粥样硬化、非酒精性脂肪肝炎、II型糖尿病药物中的用途。

说明书

技术领域

本发明涉及药物化学技术领域，特别涉及鹅去氧胆酸衍生物或其可药用的盐、其制备方法及用途。

背景技术

血脂异常是一种由于脂防代谢或运转异常使血浆一种或多种脂质高于正常值的全身性疾病，其表现为血中总胆固醇(TC)和或甘油三酯(TG)过高或高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)过低。血脂异常可导致动脉粥样硬化、非酒精性脂肪肝、II型糖尿病等代谢类疾病。心血管疾病的发病率与体内脂蛋白水平密切相关，TG增加、LDL-C的增加和HDL-C的减少都是心血管疾病的主要危险因素。

法尼醇X受体(FXR)属于核受体超家族的一员，是配体激活的转录因子，主要在肝脏、肠道、肾脏、肾上腺中高表达，FXR不仅参与调控机体胆汁酸、糖脂代谢，而且与多种代谢性疾病有关。FXR激活后，诱导肠道细胞合成及分泌人成纤维细胞生长因子(FGF)19，FGF19入肝后激活肝细胞表面的FGF受体4，进而抑制胆汁酸合成限速酶胆固醇7羟化酶1的表达，减少胆汁酸的合成。激活FXR能促进B类I型清道夫受体的表达，抑制固醇调节元件结合蛋白1c表达，诱导过氧化物酶体增殖物激活受体α表达，促进胆固醇逆向转运入肝，减少脂质合成，促进脂肪酸β氧化。

鹅去氧胆酸(Chenodeoxycholic acid，CDCA)是天然的初级胆汁酸，在人、畜、禽的胆汁中广泛存在，是鸡、鸭和鹅等家禽胆汁中的主要有机成分。20世纪70年代以来，鹅去氧胆酸在临床上主要用于治疗胆结石疾病和其他肝胆疾病。鹅去氧胆酸还具有抗菌、抗炎、解热及调节免疫等药理作用，对胰岛素的耐受性也有一-定的效果。鹅去氧胆酸是FXR的天然内源性配体。FXR激动剂主要分为甾体类和非甾体类结构，目前上市药物较少，且主要用于NASH、胆汁性肝硬化和胆管炎的治疗，而作为调血脂药物的研发鲜有报道。因此，以FXR为靶点，开展调血脂药物研究，对降低残留的心血管风险具有重要意义。

发明内容

发明目的：本发明目的是提供鹅去氧胆酸衍生物或其可药用的盐。

本发明的另一目的是提供所述鹅去氧胆酸衍生物或其可药用的盐的制备方法。

本发明的另一目的是提供一种药物组合物。

本发明的最后一目的是提供所述鹅去氧胆酸衍生物或其可药用的盐的用途。

技术方案：本发明具有通式I结构的鹅去氧胆酸衍生物或其可药用的盐：

其中，

R选自-OR₂或-NR₃R₄，其中R₂、R₃、R₄分别选自氢、C1～C6烷基、C3～C6环烷基、苯基或吡啶基；

R还可以选自 其中n＝1～4。

进一步地，所述的具有通式I结构的鹅去氧胆酸衍生物或其可药用的盐，为如下任一种：

3α，7α-羟基-12-肟基-5β-胆烷酸；3α，7α-羟基-12-肟基-5β-胆烷酸甲酯；

3α，7α-羟基-12-肟基-5β-胆烷酸乙酯；3α，7α-羟基-12-肟基-5β-胆烷酰甲胺；

3α，7α-羟基-12-肟基-5β-胆烷酰乙胺；3α，7α-羟基-12-肟基-5β-胆烷酰二甲胺；

3α，7α-羟基-12-肟基-5β-胆烷酰哌啶烷；3α，7α-羟基-12-肟基-5β-胆烷酰苯胺。

一种药物组合物，其含有治疗有效量的一种或多种如权利要求1或2所述的具有通式I结构的鹅去氧胆酸衍生物或其可药用的盐，及药学上可接受的载体。

一种药物组合物，其含有治疗有效量的一种或多种如权利要求1或2所述的具有通式(I)结构的鹅去氧胆酸衍生物或其可药用的盐，及药学上可接受的辅料。

所述的具有通式I结构的鹅去氧胆酸衍生物或其可药用的盐的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

化合物1与甲醇酯化反应得到中间体2，再与乙酸酐酯化得到中间体3，中间体3氧化得中间体4，然后水解得中间体5，中间体5与甲醇酯化得化合物6a，中间体6与盐酸羟胺反应得化合物Ib，化合物Ib水解得到化合物Ia，化合物Ia与醇酯化或与胺(氨)酰化得到通式I的化合物。

进一步地，所述醇酯化采用的醇为甲醇或乙醇。所述胺(氨)酰化采用的胺为甲胺盐酸盐、乙胺盐酸盐、二甲胺盐酸盐、哌啶或苯胺。

进一步地，所述的具有通式I结构的鹅去氧胆酸衍生物或其可药用的盐在制备治疗或预防高血脂症、动脉粥样硬化、非酒精性脂肪肝炎、II型糖尿病糖尿病药物中的用途。

有益效果：本发明化合物能上调FXR mRNA和SHP mRNA的转录水平，能够明显激活FXR，可用于制备治疗或预防高血脂症、动脉粥样硬化、非酒精性脂肪肝炎、II型糖尿病糖尿病等与血脂相关疾病的药物。

附图说明

图1为本发明3T3-L1前脂肪细胞的增殖活性实验结果图；

图2为本发明化合物对FXR mRNA转录的影响结果图；

图3为本发明化合物对SHP mRNA转录的影响结果图；

图4为本发明化合物对BSEP mRNA转录的影响结果图；

图5为本发明化合物对BSREBP-1c mRNA转录的影响结果图；

图6为本发明FXR激动活性测试活性测试结果图。

具体实施方式

本发明部分化合物7(7a、7b、7c、7d、7e、7f、7g、7h)的合成方法，包括以下步骤：

Reagents and conditions：(a)CH₃OH；(b)Ac₂O，DCM；(c)NaOCl，CH₃COOH，EA；(d)NaOH，HCl；(e)CH₃OH；(f)NH₂OH·HCl，NaOH，EtOH；(g)LiOH，CH₃COOH；(h)R-OH，H₂SO₄ or R-NH，EDCI，HOBt，Et₃N.

部分化合物的制备如下：

熔点用XRC-1显微熔点仪测定(温度计未经校正)，IR用Nicolet iS10型傅立叶变换红外光谱仪测定(KBr压片)，1H-NMR核磁共振由BrukerAV300型(300MHz)核磁共振仪测定(TMS为内标)，质谱分别由Agilent Q-TOF 6520(HR-MS)、Agilem 1100 LC-MSD-Trap/SL型质谱仪(ESI-MS)测定。

柱层析硅胶为100-200目或200-300目硅胶(青岛海洋化工厂)，洗脱剂为石油醚-乙酸乙酯体系或二氯甲烷-甲醇体系。薄层层析(TLC)用GF254薄层层析板(烟台江友硅胶开发有限公司)；TLC展开体系为石油醚-乙酸乙酯系统或二氯甲烷-甲醇系统，必要时加入少量乙酸或三乙胺；TLC在ZF7型三用紫外分析仪(河南巩义予华仪器有限公司)下照射显示。

实施例1

中间体3α，7α，12α-三羟基-5β-胆烷酸甲酯(2)的合成

胆酸(5g，12.2mmol)溶于甲醇中，加入数滴H₂SO₄，加热至60℃，回流反应5h。减压除去甲醇，得粗品5g，直接下投。产率：96.7％。MS m/z[M+H]⁺＝423.3。

实施例2

中间体3α，7α-乙酰氧基-12α-羟基-5βα-胆烷酸甲酯(3)的合成

中间体2(粗品5g，11.8mmol)溶于DCM中，加入三乙胺(2.6ml)、DMAP(75mg，0.61mmol)，逐滴加入乙酸酐(3.6g，35.4mmol)，室温下反应3h。加H₂O淬灭反应，搅拌2h。用DCM和H₂O萃取，饱和食盐水除水，无水Na₂SO₄干燥，减压旋干。柱层析纯化，化合物3.3g。产率：58.9％。MS m/z[M+H]⁺＝507.3。

实施例3

中间体3α，7α-乙酰氧基-12-氧代-5β-胆烷酸甲酯(4)的合成

中间体3(3.3g，6.51mmol)溶于乙酸乙酯。将次氯酸钠(10ml)、醋酸(2ml)和乙酸乙酯(15ml)混合均匀，配制氧化液。将氧化液逐滴加入其中，室温下，反应5h。加适量的饱和NaHSO₃溶液终止反应，加入乙酸乙酯和水萃取，饱和食盐水除水，无水Na₂SO₄干燥，减压旋干。柱层析纯化。产物1.7g。产率：51.7％。MS m/z[M+H]⁺＝505.3。

实施例4

中间体3α，7α-羟基-12-氧代-5β-胆烷酸(5)的合成

中间体4(1.7g，3.36mmol)溶于甲醇中。NaOH溶于H₂O中，冰浴下，缓慢加入其中，保持温度＜25℃。撤去冰浴，升温至40℃，反应5h。减压除去甲醇，用乙酸乙酯和水萃取，加入1mol/L的盐酸溶液，饱和食盐水除水，无水Na₂SO₄干燥，减压旋干。产物0.86g。产率：62.7％。MS m/z[M+H]⁺＝406.3。

实施例5

中间体3α，7α-羟基-12-氧代-5β-胆烷酸甲酯(6)的合成

中间体5(0.86g，2.11mmol)溶于甲醇中，加入数滴H₂SO₄，加热至60℃，回流反应5h。减压除去甲醇，直接下投。产物：0.7g。产率：82.1％。MS m/z[M+H]⁺＝421.3.

实施例6

3α，7α-羟基-12-肟基-5β-胆烷酸甲酯(7b)的合成

中间体6(0.7g，1.66mmol)溶于甲醇中。醋酸钠(2.1g，15.4mmol)、盐酸羟胺(0.23g，3.31mmol)溶于H₂O中，缓慢滴入其中。升高温度至60℃，回流反应5h。减压除去甲醇，用乙酸乙酯和水萃取，饱和食盐水除水，无水Na₂SO₄干燥，减压旋干。柱层析纯化。得白色固体0.62g。产率：81.9％。mp：235-237℃；¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)δ 7.72(d，J＝5.8Hz，1H)，4.11(s，1H)，3.97(s，1H)，3.61(s，1H)，3.55(s，3H)，0.86(d，J＝6.5Hz，6H)，0.59(s，3H).¹³C NMR(75MHz，DMSO-d₆)δ113.6，66.2，55.4，51.2，49.9，45.4，41.9，36.6，35.0，34.3，33.0，31.7，30.6，30.3，27.7，24.2，23.1，20.5，18.1，12.0，11.6，10.5.HRMS(ESI)m/zcalcd[M+H]⁺436.2985，found 436.3507.

实施例7

3α，7α-羟基-12-肟基-5β-胆烷酸(7a)的合成

化合物7b(100mg，0.23mmol)溶于甲醇中。NaOH溶于H₂O中，冰浴下，缓慢加入其中，保持温度＜25℃。撤去冰浴，升温至40℃，反应5h。减压除去甲醇，用乙酸乙酯和水萃取，加入1mol/L的盐酸溶液，饱和食盐水除水，无水Na₂SO₄干燥，减压旋干。得白色固体65mg。产率：67.1％。mp：281-285℃。¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)δ12.01(s，1H)，7.74(s，1H)，4.14(s，1H)，4.02(s，1H)，3.66(s，1H)，0.91(s，6H)，0.64(s，3H).¹³C NMR(75MHz，DMSO-d₆)δ 113.6，66.2，55.5，49.9，45.4，41.9，36.6，35.0，34.3，33.0，31.7，30.7，27.8，24.2，23.1，20.5，18.1，12.0，11.6，10.5.HRMS(ESI)m/z[M+H]⁺421.2820，found 421.2720.

实施例8

3α，7α-羟基-12-肟基-5β-胆烷酸乙酯(7c)的合成

将化合物7a(150mg，0.36mmol)溶于5ml无水乙醇中，加入5滴浓硫酸，80℃下回流3h，减压除去乙醇，柱层析得白色固体化合物102mg，收率64.1％。mp：256-259℃。¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)δ 5.94(d，J＝7.0Hz，1H)，5.72(t，J＝5.2Hz，1H)，4.25(s，1H)，3.84(s，1H)，3.33-3.15(m，2H)，1.10(t，J＝7.2Hz，3H)，0.95(s，3H)，0.91(d，J＝6.3Hz，3H)，0.64(s，3H).¹³C NMR(75MHz，CDCl₃)δ112.51，68.16，55.85，50.36，45.66，42.63，39.44，38.13，35.56，34.33，33.56，32.23，31.71，29.65，28.18，24.75，23.72，20.86，18.37，14.88，12.81，11.72.HRMS(ESI)m/z[M+H]⁺450.3141，found 450.3045.

实施例9

3α，7α-羟基-12-肟基-5β-胆烷酰甲胺(7d)的合成

将化合物7a(150mg，0.36mmol)溶于5mlDMF中，依次加入EDCI(110mg，0.57mmol)、HOBT(40mg，0.29mmol)、Et₃N(0.2ml)和甲胺盐酸盐(60mg，0.89mmol)，氮气保护，室温反应12h。反应结束用乙酸乙酯萃取，依次用水和饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥。减压蒸馏至干。柱层析得白色固体0.17g，收率82.5％。mp：215-219℃。¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)δ5.94(d，J＝7.0Hz，1H)，5.72(t，J＝5.2Hz，1H)，4.25(s，1H)，3.84(s，1H)，3.33-3.15(m，2H)，1.10(s，3H)，0.95(s，3H)，0.91(s，3H)，0.64(s，3H).¹³C NMR(75MHz，CDCl₃)δ112.5，68.2，55.9，50.4，45.7，42.6，39.4，38.1，35.6，34.3，33.6，32.2，31.7，29.7，28.2，24.8，23.7，20.9，18.4，14.9，12.8，11.7.HRMS(ESI)m/z[M+H]⁺435.3145，found 435.4507.

实施例10

3α，7α-羟基-12-肟基-5β-胆烷酰乙胺(7e)的合成

采用与化合物7d相同的合成方法合成化合物7e，得白色固体，收率75.2％。mp：221-223℃。¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)δ5.94(d，J＝7.0Hz，1H)，5.72(t，J＝5.2Hz，1H)，4.25(s，1H)，3.84(s，1H)，3.33-3.15(m，2H)，2.58(s，3H)，2.40(s，3H)，1.10(t，J＝7.2Hz，3H)，0.95(s，3H)，0.91(d，J＝6.3Hz，3H)，0.64(s，3H).¹³C NMR(75MHz，CDCl₃)δ173.4，171.1，161.3，157.5，112.5，68.2，55.9，50.4，45.7，42.6，39.4，38.1，35.6，34.3，33.6，32.2，31.7，29.7，28.2，24.8，23.7，20.9，18.4，14.9，12.8，11.7.HRMS(ESI)m/z[M+H]⁺449.3301，found 449.3635.

实施例11

3α，7α-羟基-12-肟基-5β-胆烷酰二甲胺(7f)的合成

采用与化合物7d相同的合成方法合成化合物7f，得白色固体，收率69.2％。mp：225-228℃。¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)δ5.94(d，J＝7.0Hz，1H)，5.72(t，J＝5.2Hz，1H)，4.25(s，1H)，3.84(s，1H)，3.33-3.16(m，2H)，1.10(s，3H)，0.95(s，3H)，0.91(s，3H)，0.64(s，3H).¹³C NMR(75MHz，CDCl₃)δ113.5，67.2，55.9，50.4，45.7，42.6，39.3，38.8，35.6，34.3，33.6，32.3，31.8，29.8，28.2，24.8，23.7，20.9，18.4，14.88，12.81，11.72.HRMS(ESI)m/z[M+H]⁺449.3301，found 449.3652.

实施例12

3α，7α-羟基-12-肟基-5β-胆烷酰哌啶烷(7g)的合成

采用与化合物7d相同的合成方法合成化合物7g，得白色固体，收率56.3％。熔点：230-232℃。¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)δ5.97(d，J＝7.0Hz，1H)，5.72(t，J＝5.2Hz，1H)，4.25(s，1H)，3.84(s，1H)，3.33-3.15(m，2H)，2.58(s，3H)，2.40(s，3H)，1.10(t，J＝7.2Hz，3H)，0.95(s，3H)，0.91(d，J＝6.3Hz，3H)，0.64(s，3H).¹³C NMR(75MHz，CDCl₃)δ112.51，68.16，55.85，50.26，48.52，46.68，45.66，42.63，39.44，38.23，35.59，34.33，33.44，32.23，31.71，29.65，28.18，25.75，23.72，20.86，18.37，14.88，12.81，11.72.HRMS(ESI)m/z[M+H]⁺489.3614，found 489.3652.

实施例13

3α，7α-羟基-12-肟基-5β-胆烷酰苯胺(7h)的合成

采用与化合物7d相同的合成方法合成化合物7h，得白色固体，收率56.3％。熔点：254-256℃。¹H NMR(300MHz，CDCl₃)δ7.92(s，1H)，7.54-7.44(m，5H)，6.97(t，J＝8.7Hz，2H)，5.95(s，1H)，5.93(s，1H)，4.28(s，1H)，3.86(s，1H)，0.97(s，3H)，0.94(d，J＝6.0Hz，3H)，0.66(s，3H).¹³C NMR(75MHz，CDCl3)δ 133.8，121.2，115.1，114.8，112.0，67.7，58.9，55.3，49.9，45.2，42.2，38.9，38.6，35.0，33.8，33.3，32.7，31.2，28.2，25.4，23.2，20.5，17.9，13.7，12.3，11.3.HRMS(ESI)m/z[M+H]⁺497.3301，found 497.3868.

实施例14：本发明部分化合物的药理试验及结果。

1.MTT法测试3T3-u1细胞增殖实验

将浓度为1×10⁵ml^-1的3T3-L1细胞接种到96孔细胞培养板中，每孔100μl。在细胞培养箱中静置培养(37℃，5％CO₂)24h后，向每孔中加入100μl含不同浓度样品的培养基，使最终的样品浓度分别为5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L和40μmol/L，每个浓度设置3个复孔。空白对照组为等体积含0.1％的DMSO培养基。继续培养48h后，向每孔加20μL浓度为5mg/mL的MTT溶液，培养4h。4h后小心吸出孔中的液体，向每孔中加入150μL DMSO，于振荡器上低速振荡20min，用酶标检测仪检测各孔在490nm处吸光度OD值，计算细胞存活率。

公式为：存活率＝(实验组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)×100％

3T3-L1前脂肪细胞的增殖活性实验结果见图1。可以看出大部分化合物在低浓度时(5μmol/L和10μmol/L)对细胞增殖没有影响，个别化合物如7e等在5μmol/L浓度下具有促进细胞增殖的作用。在高浓度时(20μmol/L和40μmol/L)，化合物对细胞都有一定的抑制活性，其中化合物7a、7g和7h在40μmol/L的浓度下，对细胞的抑制率达到50％以上。因此，我们选取化合物浓度为10μmol/L进行下一步的活性测试。

2.对HepG2肝癌细胞(购自江苏凯基生物技术股份有限公司)内FXR和FXR下游基因mRNA表达的影响

选择处于指数生长期的HepG2肝癌细胞，用0.25％胰酶消化。消化完成后，用完全培养基终止。离心，加完全培养基使细胞重悬，在六孔板的每个孔中接种1×10⁵个细胞。24h后，加入浓度为10μM的GW4064和目标化合物。待处理24h后，去除培养基，往六孔板中加PBS洗一遍细胞，去除PBS。加入1ml trizol，室温放置2min，将trizol转移至无RNA酶的EP管中。加入氯仿200μl，用力振摇15s，室温静置15min，离心(4℃，12000g，15min)。离心后液体分三层，小心吸取上层无色液体，移入新的EP管中。加入等体积异丙醇，上下颠倒使之混匀，室温静置5min，离心(4℃，12000g，10min)。除去上清液，向沉淀中加入1ml 75％乙醇，轻微振荡15s，离心(4℃，7500g，5min)。小心除去上清液，管内沉淀在超净台中鼓风静置干燥3-5min。加入50μl DEPC水溶解，nanodrop检测浓度，-80℃冰箱保存。将提取后的RNA逆转录为cDNA，逆转录实验步骤按照逆转录试剂盒说明书操作(takara，RR047)。逆转录所得cDNA于Stepone plus荧光定量PCR(ABI)上反应。产物双链DNA通过与SYBR Green I染料结合进行荧光定量，mRNA的相对表达量通过公式2-^ΔΔCt计算得到。结果见图2-5。

实验结果表明，化合物7a能上调FXR mRNA和SHP mRNA的转录水平，上调FXR mRNA和SHP mRNA的转录水平与阳性药GW4064相当，上调BSEP mRNA的转录水平比阳性药GW4064强，下调BSREBP-1c mRNA的转录水平比阳性药GW4064弱。

3.FXR激动活性测试

将对数生长期的HepG2细胞(购自江苏凯基生物技术股份有限公司)制备为细胞悬液(细胞浓度约为2×10⁵个细胞/ml)接种于96孔板中，37℃、5％CO₂培养箱中培养。待细胞90％融合后，对于每孔细胞，取25μLOPTI-MEM培养基稀释30ng质粒(GAL4-FXRLBD)+50ng报告质粒pGL4.35+20ng renilla荧光素酶对照载体+40ng pGEM carrier DNA，轻轻混匀后于室温放置约5min；取25μL OPTI-MEM培养基稀释0.35μL脂质体3000试剂，轻轻混匀后于室温放置约5min。混合两溶液，轻柔吹打均匀，室温静置约20min。将96孔板中的细胞用PBS冲洗细胞2遍，加入混合溶液轻轻混合均匀，细胞培养箱中继续培养约8h。8h后，将旧的培养基更换为含0.1％DMSO或10μmol/L的GW4064和化合物A12的DMEM培养基，继续培养约18h后，检测荧光素酶活性时，操作间温度设定为22℃，避光。双荧光素酶报告基因系统检测步骤如下：裂解细胞，弃去旧的细胞培养液，每孔加100uL报告基因细胞裂解液，充分裂解细胞。细胞完成裂解后，每孔细胞转移至EP管，离心混合均匀。缓慢融解萤火虫荧光素酶检测试剂和海肾荧光素酶检测缓冲液至室温。海肾荧光素酶检测底物(100×)置于冰浴备用。按照1∶100比例，向海肾荧光素酶检测缓冲液加入海肾荧光素酶检测底物(100×)，配制成海肾荧光素酶检测工作液。开启GLO-MAX 20/20荧光检测仪，设置检测参数，检测间隔时间为2s，检测时间为10s。检测萤火虫荧光素酶活性值F(Firely Lueiferase)时，每个细胞样品加入100μL萤火虫荧光素酶检测试剂，混匀后将EP管立即放入Berthold LB941微孔板式多功能酶标仪，计算F值。加入100μl海肾荧光素酶检测工作液，混匀后立即放入Berthold LB941微孔板式多功能酶标仪，计算海肾荧光素酶活性值R(Renilla Luciferase)。完成所有样品测定后，由Berthold LB941微孔板式多功能酶标仪检测到的F值和R值，计算得出相对荧光素酶活性相对值，然后将各药物处理组的值对阴性对照孔的值进行归一化处理，拿得到的新的比值进行统计。结果见图6。实验结果表明，在10μmol/L的浓度下化合物7a能明显激活FXR。

鹅去氧胆酸衍生物或其可药用的盐、其制备方法及用途专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。