专利摘要

本发明公开了一种纤维素样品及其应用，其中纤维素样品由如下步骤制得：a.将微晶纤维素和微晶纤维素与不同量的木质素的混合物分别溶解于离子液体中，得多个离子液体溶液；b.将上述多个离子液体溶液分别转移到反相溶剂中进行再生重构；c.将经过再生重构后的离子液体溶液分别进行过滤，并冷冻干燥后得到作为纤维素样品的多个再生纤维素。本发明的纤维素样品能够调整对酶水解的单个影响因素，从而提高了关于影响酶水解实验的结论的准确性。

说明书

技术领域

本发明涉及木质纤维素处理技术领域，具体地说是一种纤维素样品及其应用。

背景技术

随着石油资源的减少及全球环境危机的日益严重，以可再生资源为原料开发新能源成为世界各国的必然之选(Kunkes等，2008)。以玉米、甘蔗及大豆等食品为原料，经发酵或精制生产第一代生物燃料这一途径因其明显的局限性，如抬高食品价格及增加森林采伐，而逐渐被舍弃（Fairley，2011）。随之以农林废弃物、城市垃圾、草本科植物、阔叶木及针叶木等非粮可再生木质纤维素为原料制备第二代生物燃料的途径成为各国研发和商业化的热点（Somma等，2010；Fairley，2011）。例如欧盟提出到2020年，其境内10%以上的交通燃料将由生物燃料替代。美国政府也提出类似目标，即到2022年美国生物燃料的产量要达到360亿加仑（Buyx等，2011）。木质纤维素原料主要成分为纤维素（35%～50%）、半纤维素（20%～40%）和木质素（15%～25%）。在木质纤维素原料中，这三种主要成分构成植物体的支持骨架，其中纤维素组成微细纤维，构成纤维细胞壁的网状骨架，而半纤维素和木质素则以共价键相连填充在纤维和微细纤维之间，形成一种类似钢筋水泥交错的“混凝土结构”。木质纤维素原料的木质化程度、各组分的不均一性和复杂性、细胞壁本身含有或在转化过程中生成的发酵抑制物等因素被认为是木质纤维素原料对化学试剂和酶表现出抗降解性能的内在原因（Iiyama等，1994；Cosgrove等，2005；Wyman等，2005；Himmel等，2007）。为高效经济的以木质纤维素为原料开发生物燃料，其抗降解性能必须得以克服。为达到这一目标，除了在植物工程和酶工程两方面进行研究外（Sticklen等，2006；Abramson等，2010），更多的策略是对生物质进行预处理，以提高其可降解性能。已报道预处理的方式可以概括为：生物法、物理法、化学法及物理化学法。针对各种预处理方法的差别及各自优缺点的综述评论已经大量报道（Himmel等，2007；Hendriks等，2009；Alvira等，2010）。

纤维素的结晶度和木质素的含量被认为是所有影响木质纤维素原料酶水解因素中最重要的两个因素，它们对酶解过程的动力学和最终得率起着关键作用（Nishiyama等，2002；Zhu等，2008）。天然纤维素是一种半结晶聚合物，被称为纤维素Ⅰ，它是一种同质多晶混合物（即由三斜晶体Iα和单斜晶体Iβ的混合组成），其存在是纤维素水解的主要障碍所在（Samayam等，2011）。此外，研究还表明，除木质素含量外（Lee等，2009；Studer等，2011），木质素的分布、紫丁香基（S）和愈疮木基（G）的比例（Ximenes等，2010；Studer等，2011）、及木质素的官能团等对纤维素酶水解也有影响（Nakagame等，2011；Kumar等，2011）。木质素对纤维素酶水解的抑制作用主要有两种机制：（1）形成物理障碍，阻止纤维素与酶的接触；（2）吸附纤维素酶，降低纤维素酶的活性（Pan等，2005）。为揭示这两个影响因素与纤维素酶水解之间的关系，了解它们单独对酶水解速率和效果的影响显得尤为重要（Zhu等，2008）。

几乎所有已报道相关文献都证实降低底物纤维素的结晶度和木质素的含量将显著提高酶水解的效果（Sticklen等，2006；Abramson等，2010；Chundawat等，2011）。然而以往研究大多都是针对不同预处理后的原料进行分析，从而得到相关结论。而实际上这些方法都存在一定的局限性，即改变一个影响因素的同时，其他影响因素也随之发生改变，很难得到单个影响因素对酶水解的影响效果（Zhu等，2008）。为克服之一缺陷，研究者习惯选用微晶纤维素（Avicel）作为纤维素模型物，在酶水解体系中添加不同含量的各种木质素作为实验的样品，以考察木质素对纤维素酶水解的影响。但即使这样，仍存在一定的局限性。因为纤维素在细胞壁中与半纤维素和木质素是一个相互交联的复杂结构，并不是彼此分开的。上述方法中的缺陷影响了结论的准确性。

鉴于上述现有的考察木质素和纤维素对酶水解影响的方法中存在的问题，本发明人基于多年的实践经验及丰富的专业知识积极加以研究和创新，最终发明一种新颖的用于酶水解的纤维素样品及其应用，以解决现有技术中的缺陷。

发明内容

为了解决现有技术中存在的上述问题，本发明提供了一种纤维素样品，本发明的纤维素样品能够调整对酶水解的单个影响因素，从而提高了关于影响酶水解实验的结论的准确性。

为了解决上述技术问题，本发明采用了如下技术方案：

纤维素样品，其由如下步骤制得：

a.将微晶纤维素和微晶纤维素与不同量的木质素的混合物分别溶解于离子液体中，得多个离子液体溶液；

b.将上述多个离子液体溶液分别转移到反相溶剂中进行再生重构；

c.将经过再生重构后的离子液体溶液分别进行过滤，并冷冻干燥后得到作为纤维样品的多个再生纤维素。

进一步，所述离子液体为为1-乙基-3-甲基咪唑醋酸盐([C₂mim]OAc)离子液体。

进一步，所述微晶纤维素和木质素的质量和与离子液体的质量比为1∶11～25。优选为1∶11.5-19，进一步优选为1∶19。

进一步，所述微晶纤维素和木质素在离子液体中溶解的温度为80-130℃。优选为110-130℃。

进一步，所述微晶纤维素和木质素在离子液体中溶解时采用油浴加热，并通氮气保护。

进一步，所述经过纤维素再生重构后的离子液体溶液通过硝酸纤维素滤膜进行过滤。

进一步，所述反相溶剂为去离子水、丙酮加水混合物或酮加乙醇混合物。

本发明的另一目的为提供一种上述纤维素样品的应用，以便实现准确分析木质素和纤维素对酶水解的影响。其技术方案如下：

上述任一所述的纤维素样品在分析木质素和纤维素对酶水解的影响中的应用。特别是在分析木质素和纤维对酶水解速率及转化率的影响中的应用。

进一步，所述分析木质素和纤维素对酶水解的影响包括对纤维素样品进行酶水解。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

1.本发明方法利用离子液体全溶体系将纤维素和木质素进行重构，从而研究了纤维素结晶度和木质素含量对纤维素酶水解的影响。消除了现有技术中改变一个影响因素，其他影响因素也随之改变的缺陷，准确反映了纤维素结晶度和木质素含量对纤维素酶水解的影响。

2.本发明方法与传统向酶水解体系中添加不同含量木质素的考察方法相比，重构样品中木质素对酶水解的影响表现出不同的抑制机制。

3.本发明方法采用的重构样品中的木质素将对纤维素酶形成物理障碍阻止其与纤维素的吸附，而表面的木质素粒子将通过吸附纤维素酶以降低样品的酶解率。

4.通过本发明方法研究表明在离子液体预处理木质纤维素原料时，处理后样品中木质素的含量对酶水解的影响不是很明显，而纤维素晶型由纤维素Ⅰ转变为纤维素Ⅱ对酶水解的影响却很大。

附图说明

图1为本发明的样品进行酶水解的纤维素转化率的柱状图；

图2为木质素含量与36小时酶解率的相关性的线性图；

图3为本发明实施例的各样品的X射线衍射图；

图4A-图4F为本发明相关样品的电子显微镜的扫描图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细描述，但不作为对本发明的限定。

本实施例中，离子液体，[C₂mim]OAc），购自兰州化学物理研究所，纯度≥98.5%。微晶纤维素，聚合度为210～240，购自国药集团化学试剂有限公司。木质素采用磨木木质素（MWL），从球磨三倍体毛白杨样品中提取和纯化得到。所用三倍体毛白杨为6年生，采自山东省，其Klason木质素含量依据TAPPI标准测定为19.9%。纤维素酶（Celluclast 1.5L）和β-葡萄糖苷酶从Sigma Aldrich购买得到。其他所用试剂都为分析纯或试剂纯，直接购买使用，未进行进一步的纯化。

纤维素样品，其由如下步骤制得：

a.将微晶纤维素和微晶纤维素与不同量的木质素的混合物分别溶解于离子液体中，得多个离子液体溶液；

b.将上述多个离子液体溶液分别转移到反相溶剂中进行再生重构；

c.将经过再生重构后的离子液体溶液分别进行过滤，并冷冻干燥后得到作为纤维样品的多个再生纤维素。

使用本发明的纤维素样品应用于分析木质素和纤维素对酶水解的影响，特别是用于分析木质素和纤维对酶水解速率及转化率的影响。重点是采用本发明的纤维素样品进行酶水解，然后进行相关分析。酶水解及相关分析均可采用现有技术。下面以较佳实施例进行说明。其中纤维素样品的再生重构如下：为保证纤维素和木质素能够完全溶解，称取四份600mg微晶纤维素，然后分别和0mg、100mg、200mg和300mg的磨木木质素（MWL）混合后，分别置于50mL的三口烧瓶中，接着分别向三口烧瓶中添加20g[C₂mim]OAc。随之将三口烧瓶置于IKA加热器（IKA基本型套装,德国）在90℃下进行油浴加热3小时，搅拌速率为600转/分钟，通氮气保护。待纤维素和木质素完全溶解以后，将热的离子液体溶液转移到400mL约70℃的去离子水中进行再生重构，并持续快速搅拌1小时。重构后的样品通过硝酸纤维素滤膜过滤得到（孔径为0.45μm, 并用去离子水反复冲洗以去除残留的离子液体，最后冷冻干燥得到四种再生重构纤维素。

以微晶纤维素原料（样品1）、微晶纤维素单独再生重构的纤维素（样品2）、微晶纤维素与100mg磨木木质素再生重构的纤维素（样品3）、微晶纤维素与200mg磨木木质素再生重构的纤维素（样品4）、微晶纤维素与300mg磨木木质素再生重构的纤维素（样品5）以及微晶纤维素单独再生重构的纤维素（样品2）添加不同量的木质素作为样品按照现有的方法进行相关的实验考查木质素和纤维素对酶水解影响。其中以样品2中分别外加14.3%、25.0%和33.3%的MWL样品作为样品6、样品7和样品8。其中外加的MWL样品为样品2的质量百分数。

相关实验包括酶水解。酶解在50mL的锥形烧瓶中进行，具体酶解条件为：称取0.1g样品至于烧瓶中，添加10mL pH值为4.8的50mM的醋酸钠缓冲溶液，接着加入40μL四环类抗生素和20μL环己酰亚胺，最后加入35FPU/g的纤维素酶和37.5IU/g的β-葡萄糖苷酶，将烧瓶置于空气摇床中开始酶解，摇床设置为50℃、150转/分钟，酶解36小时。酶解结束后，取100μL酶解液在10000转/分钟的离心机上离心10分钟，上清液用来检测酶解液中葡萄糖的含量。检测采用高效阴离子交换离子色谱进行测定（ICS 3000，戴安，美国），色谱柱换为PA 100分析柱。所有酶解及检测都重复操作，以减少误差。

图1为上述样品进行36小时酶水解的纤维素转化率的柱状图。如图1所示，样品2比样品1的酶解率大幅增加，由原来的51.6%增加到98.6%。原因主要有两方面，即样品比表面积的增加（Dadi等，2007；Silva等，2011）和纤维素晶型由纤维素Ⅰ转变为纤维素Ⅱ(Samayam等，2011）。两种原因在XRD和SEM分析中也得到证明。对于样品3、样品4和样品5，其36小时酶解率分别为97.8%、91.7%和85.5%。而三个样品均含有较高含量的木质素组分，分别为12.8%、22.8%和32.6%。这些结果表明，重构后样品中即使含有较高含量的木质素，其36小时酶解率都在85%以上。，由再生微晶纤维素添加不同含量木质素混合得到样品6、样品7和样品8的36小时酶解率却从85.0%显著下降到67.4%。应指出，样品6-8中木质素的含量只是略高于样品3-5中木质素的含量。两种不同考察方式中纤维素的酶解率相差很大，具体原因是木质素表现出不同的抑制机制。

图2为木质素含量与36小时酶解率的相关性的线性图。其中虚线由样品6-8得到，实线由样品3-5得到。从图中可以看出，木质素的含量与纤维素酶解率之间存在着明显的负线性相关性，即随着样品中木质素的含量增加，纤维素的酶解率也相应降低。然而，两种不同考察方式得到的相关线不仅相关系数不同，而且斜率也存在明显的差别。虚线的相关系数达到了0.9998，而实线的相关系数只有0.8812。此外，虚线的斜率要明显比实线的高。这一结果表明两种不同考察方式中木质素对纤维素酶解率的影响表现出不同的抑制机制。对于样品6-8，纤维素的酶解率几乎只受木质素含量的影响。这种抑制作用主要表现为木质素通过吸附纤维素酶，从而降低纤维素酶的活性。Pan等（2005）研究发现，除木质素自身对纤维素酶的物理障碍外，纤维素酶与木质素之间的吸附作用是导致纤维素酶解率下降的一个决定性的影响因素。然而，针对重构得到的样品3-5，除木质素含量影响酶水解外，应该还存在其他的影响因素。

纤维素结晶度分析：图3为本发明实施例的各样品的X射线衍射图。如图3所示，样品1-5的结晶度指数分别为60.3%、45.0%、42.9%、42.5%和40.7%。对纤维素Ⅰ（1-10）、（110）和（200）晶面的特征衍射峰和纤维素Ⅱ（1-10）、（110）和（020）晶面的特征衍射峰的归属及标记见图3(Samayam等，2011）。从图3中可以发现，经过离子液体处理后的样品2-5中微晶纤维素的晶型由纤维素Ⅰ转变为纤维素Ⅱ。重构样品中随着无定形木质素含量的增加，对应的结晶度指数略微降低，但对应样品的酶解率也随之降低。对于重构后的样品，纤维素结晶度的轻微变化并不会对最终的酶水解产生很大的影响。Park等（2010）的研究也表明不能将纤维素结晶度指数的轻微变化与酶水解效率相关联。

图4A-图4F分别为本发明实施例中样品1、样品2、木质素（MWL）、样品3、样品4和样品5表面放大10000倍的电子显微镜的扫描图（SEM图片）。从图中可以观察到，未处理微晶纤维素样品的表面呈现出纤维状且十分致密。经离子液体处理后，表面的纤维状形貌消失并伴有大量孔隙生成。这一表面变化在Li等（2010）用相同离子液体处理柳枝稷时也有观察到。研究表明，这一表面形貌变化将显著增加重构样品的比表面积（Dadi等，2007；Silva等，2011）。对于重构样品，比表面积的增加和结晶度的降低是导致其酶水解效率增加的主要原因。此外通过SEM图可以观察到MWL呈现为多尺度的纳米颗粒。

对于样品3-5，其表面形态随添加MWL的量发生了明显的变化。随着样品中MWL的增加，在再生微晶纤维素样品2表面形成的孔隙在重构样品中不仅孔径变小，而且数目也明显减少。这一结果表明在离子液体处理过程中，MWL纳米粒子能与微晶纤维素进行了很好的重构，从而减少了表明的孔隙。对于重构样品，MWL将形成物理障碍阻止纤维素酶与纤维素的接触。此外，重构样品随着MWL的增加其比表面积也将降低，进而降低其酶水解效率。与再生微晶纤维素样品2相比，重构样品表面的另一明显变化则是表面有球状粒子生成。类似的球状粒子在稀酸处理和氨纤维爆破法（AFEX）处理生物质样品的表面都有发现，并被证实主要来自于预处理过程中新沉积的木质素和其他降解产物（Selig等，2007；Chundawat等，2011；Sannigrahi等，2011）。很明显本研究中的处理条件与稀酸处理和AFEX相比都要温和，而且操作温度仅90°C，低于木质素的玻璃化转变温度（100–160°C）（Samayam等，2011）。此外，Singh等（2009）在用水再生离子液体处理的柳枝稷时发现回收的再生多糖组分对木质素有一定的排斥作用。基于以上分析，本研究认为重构样品表面的球状粒子主要来源于再生的MWL。而且随着MWL的增加，这些球状粒子的直径也有所增加。表面生成的MWL粒子将吸附纤维素酶，从而降低酶解效率

以上实施例仅为本发明的示例性实施例，不用于限制本发明，本发明的保护范围由权利要求书限定。本领域技术人员可以在本发明的实质和保护范围内，对本发明做出各种修改或等同替换，这种修改或等同替换也应视为落在本发明的保护范围内。

纤维素样品及其应用专利购买费用说明

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1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

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