专利摘要

本发明涉及一种乌贼墨肽聚糖的制备方法和应用，其特征在于步骤为：将乌贼墨匀浆，丙酮脱脂，用Tris-Hcl缓冲液提取，离心后超滤，然后乙醇沉淀和sevag试剂除蛋白，旋转蒸发，冷冻干燥；接着分别采用DEAE-52离子交换层析柱和Sephadex G-75凝胶柱色谱进行分离纯化，收集洗脱液，冷冻干燥得到乌贼墨肽聚糖。本发明提取条件简便、操作易控制，制备成本较低，同时所制得的肽聚糖对人前列腺癌细胞DU-145、PC-3具有很强的细胞抑制增殖作用，并且随药物浓度及作用时间的增加，细胞抑制率也明显增加，与为抗前列腺癌提供了一条可行性研究途径，因此具有医学药用价值，易于推广应用。

说明书

技术领域

本发明涉及一种乌贼墨肽聚糖的制备方法，尤其是一种采用水提法提取乌贼墨肽聚糖的制备方法，本发明还公开了该乌贼墨肽聚糖在人前列腺癌上的应用。

背景技术

乌贼(Sepia)属于软体动物门头足纲乌贼目乌贼科。乌贼的营养丰富，除可食用外，还具有很好的药用价值。尤其是乌贼的墨汁，含有多糖类活性物质黑色蛋白，有明显的抗肿瘤活性。现有研究表明，乌贼墨具有抗肿瘤、提高免疫、抗菌、止血和延缓衰老等作用。乌贼墨作为一种废弃物，国内外的科学家们对其抗肿瘤活性进行研究，发现具有多种抗肿瘤机制，如提高免疫，诱生细胞因子，抑制癌细胞增长的作用。国内的文献可以参考《中医中药》2002年第19卷第10期，张永军等著的“复方乌贼墨胶囊对小鼠细胞免疫功能的促进作用”，又可以参考《福建中医学院学报》2004年第14卷第1期，黄枚所著的“乌贼墨抗癌活性的实验研究”，再可以参考《临床药物学》2005年第11卷第9期，王欣等所著的“乌贼墨的药理作用研究进展”。这些充分说明了乌贼墨中含有显著的抗肿瘤活性物质，且在抗肿瘤药物和功能产品开发中具有明显的潜在价值，也为充分利用海洋生物资源提供了有意义的途径。

发明内容

本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种操作方便的乌贼墨肽聚糖的制备方法，所制备的乌贼墨肽聚糖活性高、抗肿瘤效果显著。

本发明所要解决的第二个技术问题是提供一种乌贼墨肽聚糖在人前列腺癌上的应用。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种乌贼墨肽聚糖的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

1)取新鲜乌贼墨匀浆，用丙酮脱脂；

2)加入2～5倍体积的0.08～0.12M浓度的Tris-Hcl缓冲液在3-5℃下浸泡8～24h进行提取，离心后超滤，或者多次上述重复提取、离心，然后合并每次上清液、再超滤；乙醇沉淀和sevag试剂除蛋白，旋转蒸发，冷冻干燥；

3)DEAE-52离子交换层析柱分离，将步骤2)中的冷冻干燥物分别用Tri s-Hcl缓冲液，NaCL溶液0.1mol/L～1mol/L进行梯度洗脱，紫外280nm检测吸光度，同时采用苯酚-硫酸法检测糖峰，收集峰值洗脱液，在490nm处检测糖峰，收集最佳峰的洗脱液，透析除盐，冷冻干燥；

4)采用Sephadex G-75凝胶柱色谱分离纯化，于280nm处检测，收集洗脱液，冷冻干燥；

5)将步骤4)所得样品进行纯度检测，通过高效液相和SDS-PAGE凝胶电泳。

作为优选，所述步骤1中的丙酮脱脂为在匀浆液中加入2～4倍体积的丙酮于-15～-25℃中进行脱脂。

作为优选，所述步骤2)中的sevag试剂的配比为氯仿与正丁醇的体积比例3∶1。

进一步优选，所述步骤3)中的梯度洗脱的洗脱速度1ml～1.5ml/min，每管4～6ml。

最后，所述步骤4)所述的Sephadex G-75凝胶柱色谱分离的步骤为：将步骤②所得样品溶于蒸馏水，过G-75凝胶柱，洗脱速度0.8ml～1.5ml/min，与280nm处检测，收集洗脱液，冷冻干燥。

一种乌贼墨肽聚糖在人前列腺癌上的应用。如在抗前列腺癌DU-145细胞抑制增殖上的应用，或者，在抗前列腺癌PC-3细胞抑制增殖上的应用。

与现有技术相比，本发明的优点在于：提取条件简便、操作易控制，且制备成本较低，同时所制得的肽聚糖对人前列腺癌细胞DU-145、PC-3具有很强的细胞抑制增殖作用，并且随药物浓度及作用时间的增加，细胞抑制率也明显增加，与为抗前列腺癌提供了一条可行性研究途径，因此具有医学药用价值，易于推广应用。

附图说明

图1为DEAE-52洗脱峰值图；

图2为G-75洗脱峰值图；

图3为柱子洗脱后样品的高效液相检测乌贼墨肽聚糖纯度检测图；

图4为SDS-PAGE电泳条带图；

图5紫外全波长扫描图；

图6为红外光谱扫描图；

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

1材料

1.1动物：乌贼购自舟山菜场，剥下墨囊-20℃冷藏备用。

1.2细胞株：人前列腺癌细胞DU-145和PC-3均购自中科院上海细胞生物学研究所细胞库。

1.3主要试剂：HamF12培养基，Gibco公司；胎牛血清(FBS)，杭州四季青生物制品有限公司；萄聚糖凝胶Sephadex G-75和DEAE-52阴离子交换柱均购自于上海源叶生物科技有限公司；MTT均购自美国SIGMA公司；二甲基亚砜购自美国AMRESCO公司；乙腈购自宁波海曙恒隆实验器材有限公司；其余试剂均为分析纯。

1.4主要仪器：

DS-1组织捣碎机，上海标本模型厂；

BSA124S型电子天平，德国Sartorius AG公司；

SSW-420-2S恒温水浴锅，上海民仪电子有限公司；

BSW-100-ZCD自动部分收集器，上海琪特分析仪器有限公司；

BT1-100恒流泵，上海琪特分析仪器有限公司；

PHS-250PH计，上海理达仪器厂；

CF16RX∏日立低温离心机，日本日立公司；

752FC紫外分光光度计，上海光谱仪器有限公司；

LGJ-18冷冻干燥机，北京松源华兴科技发展有限公司；

高效液相色谱仪(P1201依利特)，大连依利特分析仪器有限公司；

MSC300超滤杯(超滤膜：3KDa)，上海摩速科学器材有限公司；

超净台Forma3111，上海智城分析仪器制造有限公司；

细胞培养箱ZHJM-C12090，杭州宝城生物科技有限公司；

酶标仪(美国BIO-RAD)，杭州宝城生物科技有限公司；

微量震荡器，上海精密仪器有限公司。

2方法

2.1肽聚糖制备和质构研究

2.1.1样品提取

从乌贼中取出墨囊，破坏墨囊，用组织捣碎机捣碎，收集乌贼墨，然后向乌贼墨中加入2倍体积的丙酮置于-20℃中脱脂12h，过滤，收集残留物，冷冻干燥备用。向乌贼墨加中入3倍体积的Tris-Hcl缓冲液(PH6.8)，在4℃下浸泡24h，然后在10000rpm下离心25min，去上清液，再将沉淀物中加入3倍体积的Tris-Hcl缓冲液(PH6.8)，在4℃下浸泡24h，然后在10000rpm下离心25min，去上清液，合并2次上清。用3000的超滤膜超滤，除去部分杂质，加入5倍体积的无水乙醇沉淀，在4℃下浸泡12h，去掉上清液，收集沉淀，将肽聚糖提取物溶于Tris-Hcl缓冲液中，加入sevag试剂(氯仿与正丁醇的比例为3∶1)，4℃过夜分层，倒出上清液，重复操作2次，去除游离的蛋白等杂质，旋转蒸发，冷冻干燥备用。

2.1.2样品分离纯化

将上述冷冻干燥物过DEAE-52离子交换层析柱(1.6*40cm)，分别用Tris-Hcl缓冲液，NaCL溶液0.1mol/L、0.3mol/L和0.5mol/L4个梯度进行梯度洗脱，洗脱速度1ml/min，每管4ml，紫外280nm检测吸光度，同时采用苯酚-硫酸法检测糖峰，收集峰值洗脱液，在490nm处检测糖峰，收集最佳峰的洗脱液，透析除盐，冷冻干燥。

将上述冷冻干燥后的样品溶于蒸馏水，过Sephadex G-75(3.6*50cm)，洗脱速度0.8ml/min，6min/管，与280nm处检测，收集洗脱液，冷冻干燥。

2.1.3高效液相检测肽聚糖纯度

色谱条件：1000-10-C₁₈(10×250mm)色谱样；流动相：乙睛-水(1∶4)；体积流量：1.0ml/min；上样量：20μL；检测波长：280nm。

2.1.4聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析

采用15％的SDS-PAGE电泳胶，考察纯化后肽聚糖的电泳行为，用考马斯亮蓝法进行染色。

2.1.5紫外全波长扫描和红外光谱测定

将样品在190-400nm之间扫描，检测峰值的波长。采用KBr压片，在400-4000cm^-1之间扫描，测定红外光谱

2.2抗前列腺癌活性研究

2.2.1细胞培养

人前列腺癌DU-145和PC3细胞接种于含10％(体积分数)FBS、双抗溶液(青霉素G100IU/mL、链霉素100IU/mL)的HamF12培养基中，置于37℃、5％CO₂、95％饱和湿度条件下的孵箱中常规培养，细胞贴壁生长，每2～3天换液1次，当细胞生长汇合时，按1∶3传代，每周传代1～2次。用0.25％胰蛋白酶/0.02％EDTA混合消化液消化，收集对数生长期细胞进行实验。

2.2.2细胞增殖抑制率的测定：采用MTT法进行检测。配制PBS溶液(PH值为7.2)和一定浓度的酶解多肽溶液。取对数生长期的前列腺癌细胞制成悬液，接种至96孔板，每孔200μL，于5％CO₂，37℃贴壁4h，然后分别加入酶解多肽溶液，每个浓度设3个平行孔，同时设不加药对照组，置5％CO₂，37℃培养箱中孵育，培养结束加入180μLMTT和20μL PBS继续培养4h，吸弃96孔板的液体，加入150μL的DMSO，充分混合。置酶联免疫检测仪在490nm测吸光度，计算细胞增殖抑制指数(IR)，按下列公式计算。

IR＝[(对照组A值-药物组A值)/对照组A值]×100％

3结果

3.1分离纯化

如图1所示，肽聚糖粗提物经过DEAE-52纤维素离子交换柱，经Tris-HCl缓冲液和NaCl溶液洗脱得到的蛋白峰和糖峰，其中第3个峰的蛋白峰和糖峰重叠性最好，且峰值最高，为0.3MNaCl溶液洗脱得到，收集该组分冷冻干燥。

如图2所示，将干燥物经Sephadex G-75凝胶柱后，得到的洗脱峰，为一个明显单一大峰。

3.2高效液相纯度测定结果

如图3和4所示，高效液相纯度检测的结果显示，通过超滤、DEAE-52和G-75分离纯化得乌贼墨肽聚糖单一组分，且条带在分子量约130kD处显示。

3.3紫外和红外扫描谱图

如图5所示，样品在199nm和280nm处各有一吸收峰，说明其中含有糖和蛋白成分。如图6所示，红外光谱扫描显示，在3398.31cm^-1处，有-OH伸缩振动，在2933.80cm^-1处，是C-H伸缩振动，在1395.79cm^-1也有峰，这些均为糖类物质的特征峰；1654.27cm^-1处有强吸收峰为酰胺键C＝O伸缩振动，1534.6cm^-14为N-H键的变脚振动；1034.67cm^-1，1062.63cm^-1，1126.75cm^-1，在1000-1200cm^-1范围内，这组峰为C-O-C伸缩振动和C-O-H伸缩振动；另外，可以初步确定糖苷键的类型，若在840cm^-1附近有吸收峰为α构型，若在880cm^-1附近有吸收峰为β构型。由光谱扫描可知，本样品为糖和蛋白的复合物。

3.5MTT检测乌贼墨肽聚糖对DU-145和PC3细胞增殖活性的影响：将肽聚糖设置5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml和25mg/ml五个浓度组，分别测定作用24h和48h后，对DU-145和PC-3细胞增殖的影响。结果表明，乌贼墨肽聚糖对DU-145和PC-3都具有增殖抑制活性，且呈现时效和量效关系。(表1)

表1乌贼墨肽聚糖对人前列腺癌DU-145和PC-3细胞增殖的影响( n＝3)

一种乌贼墨肽聚糖的制备方法和应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。