专利摘要

在不同研究中已证实WW-结合蛋白2(WBP2)为酪氨酸激酶底物，激活ERα/PR转录并在乳腺癌中起作用。然而，WBP2酪氨酸磷酸化在调节ER功能和乳腺癌生物学中的作用是未知的。这里，我们确定WBP2为雌激素信号传导经由EGFR串话的酪氨酸磷酸化靶标。使用显性失活的、组成型活化的突变体、RNAi和药理学研究，我们证实WBP2在Tyr192和Tyr231处的磷酸化可以通过c-Src和c-Yes激酶来调节。我们进一步证实消除WBP2磷酸化修复>60%的ERα报道活性，据推定这是通过阻断WBP2的核进入及其与ERα的相互作用。与载体对照相比，MCF7中WBP2及其磷酸化模拟突变体的过表达导致小鼠中较大的肿瘤，诱导细胞-细胞粘附的丧失，以雌激素依赖性和不依赖性方式增加细胞增殖、贴壁不依赖性生长、迁移和侵袭，这些事件基本上可以通过磷酸化缺陷突变体的过表达来消除。Wnt/β-连环蛋白抑制物FH535比他莫昔芬和氟维司群更显著地阻断磷酸化WBP2介导的癌细胞生长，部分是通过诱导ERα的表达。

权利要求

1.一种检测患者中的癌症的方法，所述方法包括以下步骤：

e)测量在分离自所述患者的第一样品中在Y192处具有磷酸化的酪氨酸的SEQ ID No.1的多肽的量；以及

f)将所述样品中在Y192处具有磷酸化的酪氨酸的SEQ ID No.1的多肽的量与分离自正常的非癌性细胞的第二样品中在Y192处具有磷酸化的酪氨酸的SEQ ID No.1的多肽的量进行比较，

其中相对于所述第二样品中在Y192处具有磷酸化的酪氨酸的SEQ ID No.1的多肽的量，所述第一样品中在Y192处具有磷酸化的酪氨酸的SEQ ID No.1的多肽的量的增加指示在所述第一样品中存在癌症。

2.权利要求1的方法，其中所述第一和第二样品中在Y192处具有磷酸化的酪氨酸的SEQ ID No.1的多肽的量还检测在SEQ ID No.1的多肽在Y231处的酪氨酸的磷酸化，其中相对于所述第二样品中在Y192和Y231处具有磷酸化的酪氨酸的SEQ ID No.1的多肽的量，所述第一样品中在Y192和Y231处具有磷酸化的酪氨酸的SEQ ID No.1的多肽的量的增加指示在所述第一样品中存在癌症。

3.权利要求1或2的方法，其中所述癌症依赖于EGFR、c-Src、c-Yes、ER、Wnt、WBP2或E2F。

4.权利要求3的方法，其中所述癌症为乳腺癌和肺癌。

5.权利要求1-4中任一项的方法，其中用分离的磷酸化位点特异性抗体测量具有磷酸化的酪氨酸的SEQ ID No.1的多肽的量，所述抗体仅当所述多肽在酪氨酸Y192或者酪氨酸Y192和酪氨酸Y231处磷酸化时特异性结合SEQ ID.NO.1的WW-结构域结合蛋白，其中当SEQ ID No.1的多肽在所述酪氨酸处未磷酸化时所述抗体不结合SEQ ID No.1的多肽。

6.权利要求1-4中任一项的方法，所述方法还包括以下步骤：

e)使SEQ ID No.1的多肽与多核苷酸探针或引物接触，所述多核苷酸探针或引物包含多核苷酸序列，所述多核苷酸序列仅在SEQ ID No.1的多肽在酪氨酸Y192或者酪氨酸Y192和酪氨酸Y231处磷酸化时，在合适的杂交条件下能够选择性地杂交至SEQ ID No.1的多肽；以及

f)检测所述探针或引物与在所述位点处磷酸化的SEQ ID No.1的多肽之间形成的任何双链体。

7.权利要求1-4中任一项的方法，其中用分离的磷酸化位点特异性适体测量具有磷酸化的酪氨酸的SEQ ID No.1的多肽的量，所述适体仅当多肽在酪氨酸Y192或Y231或者酪氨酸Y192和酪氨酸Y231处磷酸化时特异性结合SEQ ID.NO.1的WW-结构域结合蛋白，其中当SEQ ID No.1的多肽在所述酪氨酸处未磷酸化时所述适体不结合SEQ ID No.1的多肽。

8.一种干扰SEQ ID NO.1的多肽中酪氨酸Y192和/或Y231的磷酸化的物质。

9.权利要求8的物质，其包含分离的磷酸化位点特异性抗体，所述抗体仅当SEQ ID No.1的多肽于酪氨酸Y192、Y231或者酪氨酸Y192和酪氨酸Y231处磷酸化时特异性结合SEQ ID.NO.1的WW-结构域结合蛋白，其中当SEQ ID No.1的多肽在所述酪氨酸处未磷酸化时所述抗体不结合SEQ ID No.1的多肽。

10.权利要求9的物质，其中所述抗体是包含免疫球蛋白重链的免疫球蛋白。

11.权利要求9的物质，其中所述抗体是包含免疫球蛋白轻链的免疫球蛋白。

12.权利要求10或11的物质，其中所述免疫球蛋白为IgG1κ免疫球蛋白。

13.权利要求12的物质，其中所述免疫球蛋白在免疫球蛋白的重链内包含人IgG1恒定区，并且在免疫球蛋白的轻链内包含人恒定区。

14.权利要求11的物质，其中所述免疫球蛋白在所述重链内和所述轻链内包含完整的或部分的人框架区。

15.权利要求11的物质，其中所述免疫球蛋白在所述重链内和所述轻链内包含鼠框架区。

16.权利要求8的物质，其包含能够结合SEQ ID.NO.1的一部分的肽，所述SEQ ID.NO.1的一部分包括磷酸化的酪氨酸Y192或Y231或Y192和Y231以及磷酸化的酪氨酸Y192或Y231或Y192和Y231任一侧的氨基酸。

17.权利要求16的物质，其中所述肽包含SEQ ID.NO.3；或SEQ ID.NO.4；或SEQ ID.NO.5；或SEQ ID.NO.6以及核定位信号。

18.一种产生权利要求8-17中任一项的物质的细胞系。

19.权利要求8的物质，其包含分离的磷酸化位点特异性适体，所述适体仅当SEQ ID.NO.1的多肽在酪氨酸Y192或者酪氨酸Y192和酪氨酸Y231处磷酸化时特异性结合SEQ ID.NO.1的WW-结构域结合蛋白，其中当SEQ ID No.1的多肽在所述酪氨酸处未磷酸化时所述适体不结合SEQ ID No.1的多肽。

20.权利要求8的物质，其包含小干扰RNA。

21.权利要求20的物质，其中所述小干扰RNA包含SEQ ID NO.2。

22.权利要求8-21中任一项的物质，其用于治疗癌症。

23.权利要求22的物质，其中所述癌症依赖于EGFR、c-Src、c-Yes、ER、Wnt、WBP2或E2F。

24.权利要求22或23的物质，其中所述癌症为乳腺癌和肺癌。

25.权利要求8或24的物质，其还包含抗wnt途径、抗EGFR、抗src、抗Yes、抗E2F、抗WBP2和抗ER化合物。

26.一种包含权利要求8-24中任一项的物质和抗雌激素化合物的组合。

27.权利要求25的物质或权利要求26的组合物，其中所述抗Wnt途径化合物为式1的FH535

28.权利要求25的物质或权利要求26的组合物，其中所述抗雌激素受体化合物为式2的氟维司群

29.一种治疗患有癌症的患者的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)向所述患者施用干扰SEQ ID NO.1的多肽中酪氨酸Y192和/或Y231的磷酸化的物质。

30.权利要求29的方法，其中所述物质包含权利要求8-24中任一项的物质。

31.一种治疗患有癌症的患者的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)向所述患者施用组合物，所述组合物包含干扰SEQ ID NO.1的多肽中酪氨酸Y192和/或Y231的磷酸化的物质以及抗雌激素受体化合物。

32.权利要求31的方法，其中所述抗雌激素受体化合物为式1的FH535

33.权利要求31的方法，其中所述抗雌激素受体化合物为式2的氟维司群

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求于2010年8月30日提交的新加坡专利申请第201006302-2号的权益，其全部内容援引加入本文。

技术领域

本发明一般涉及确定癌症的倾向或者诊断和/或治疗癌症的方法和试剂盒。

背景技术

本发明的背景的以下讨论是为了促进本发明的理解。但是，应当理解该讨论不是承认或允许所提及的任何材料在本申请的优先权日期是公开的、已知的或任何管辖范围中常见的一般知识的部分。

通过核激素受体增强基因转录包括其通过蛋白-蛋白相互作用与共激活蛋白和基础转录复合物相互作用(1,2)。共激活蛋白可以作为转录接头发挥作用，或者通过组氨酸乙酰转移酶(HAT)或核小体重塑复合物修饰染色质。此外，共激活蛋白调节mRNA转运、翻译以及合成蛋白的翻译后修饰。一些已知的核激素受体共激活蛋白包括共激活蛋白的p160家族成员、SRC-1、SRC-2[TIF-2/GRIP-l/NCoA-2]、SRC-3[pCIP/ACTR/AIB-l/RAC-3/TRAM-1]、NRIF-3、E6-AP和WBP2。由于它们的多效作用，转录共激活蛋白作为在癌症发展中越来越多涉及的一组蛋白出现并不令人惊讶(3-5)。

转录共激活蛋白常进行翻译后修饰，例如磷酸化。SRC/pl60家族蛋白的特定成员的磷酸化可以增加它们的核定位(6)，抑制它们与非核受体激活蛋白的相互作用(7)或者刺激它们内在的共激活蛋白活性(8)。AIB1和PGC-1的磷酸化调节它们的半衰期和活性(9,10)。此外，通过Pak1磷酸化NRIF3会通过增加的ERa-NRIF3相互作用促进ERa反式激活(5)。

WW-结构域结合蛋白(WBP2)为转录共激活蛋白，据证实其通过激素依赖性ERα/PR-WBP2相互作用选择性和特异性地增强ERa和PR反式激活并将WBP2募集至激素应答元件(11)。WBP2包含内在的激活结构域。其3个聚脯氨酸(PPXY)基序之一-PY3对于其在ERα/PR反式激活中的共激活功能是必需的。其共激活蛋白活性可以通过YAP(Yes激酶相关蛋白)进一步增强，YAP还调节几种转录因子，例如p73(12)、Runx2(13)、TEAD/TEF(14)和ErbB4(15)。

我们以前的研究已鉴定WBP2为新的酪氨酸激酶底物，其在乳腺癌发展的MCF10AT模型中表现出差异性磷酸化(16)。随后证实外源表达的WBP2是EGFR的真实靶标。我们假设EGFR介导的WBP2的酪氨酸磷酸化在调节ERa功能和乳腺癌生物学中起作用。因此我们试图描绘EGFR介导的WBP2的酪氨酸磷酸化的信号传导途径并研究WBP2磷酸化对其共激活蛋白活性的影响。还研究WBP2及其酪氨酸磷酸化对ER阳性乳腺癌生物学的作用以及深层机制。

发明内容

因此，本发明的一方面包括一种检测患者的癌症的方法，所述方法包括以下步骤：

a)测量在分离自患者的第一样品中在Y192处具有磷酸化的酪氨酸的SEQ ID No.1的多肽的量；以及

b)将样品中在Y192处具有磷酸化的酪氨酸的SEQ ID No.1的多肽的量与分离自正常的非癌性细胞的第二样品中在Y192处具有磷酸化的酪氨酸的SEQ ID No.1的多肽的量进行比较，

其中相对于第二样品中在Y192处具有磷酸化的酪氨酸的SEQ ID No.1的多肽的量，第一样品中在Y192处具有磷酸化的酪氨酸的SEQ ID No.1的多肽的量的增加指示在第一样品中存在癌症。

优选地，第一和第二样品中在Y192处具有磷酸化的酪氨酸的SEQ ED No.1的多肽的量还检测在SEQ ID No.1的多肽的Y231处酪氨酸的磷酸化，其中相对于第二样品中在Y192和Y231处具有磷酸化的酪氨酸的SEQ ID No.1的多肽的量，第一样品中在Y192和Y231处具有磷酸化的酪氨酸的SEQ ID No.1的多肽的量的增加指示在第一样品中存在癌症。

优选地，癌症是由EGFR、c-Src、c-Yes、ER、Wnt、WBP2或E2F表达或活性引起，或者起始于或依赖于EGFR、c-Src、c-Yes、ER、Wnt、WBP2或E2F表达或活性。

优选地，用分离的磷酸化位点特异性抗体测量具有磷酸化的酪氨酸的SEQ ID No.1的多肽的量，所述抗体仅当SEQ ID No.1的多肽在酪氨酸Y192、或酪氨酸Y231、或酪氨酸Y192和酪氨酸Y231处磷酸化时特异性结合SEQ ID.NO.1的WW-结构域结合蛋白，其中当SEQ ID No.1的多肽在所述酪氨酸处未磷酸化时所述抗体不结合SEQ ID No.1的多肽。

优选地，所述方法还包括以下步骤：

a)使SEQ ID No.1的多肽与多核苷酸探针或引物接触，所述多核苷酸探针或引物包含多核苷酸序列，所述多核苷酸序列仅在SEQ ID No.1的多肽于酪氨酸Y192、或酪氨酸Y231、或酪氨酸Y192处磷酸化时在合适的杂交条件下能够选择性地杂交至SEQ ID No.1的多肽；以及

b)检测所述探针或引物与在所述酪氨酸处磷酸化的SEQ ID No.1的多肽之间形成的任何双链体。

6.权利要求1-3中任一项的方法，其中用分离的磷酸化位点特异性适体测量具有磷酸化的酪氨酸的SEQ ID No.1的多肽的量，所述适体仅当SEQ ID No.1的多肽在酪氨酸Y192或Y231或者酪氨酸Y192和酪氨酸Y231处磷酸化时特异性结合SEQ ID.NO.1的WW-结构域结合蛋白，其中当SEQ ID No.1的多肽在所述酪氨酸处未磷酸化时所述适体不结合SEQ ID No.1的多肽。

本发明的另一方面包括干扰SEQ ID NO.1的多肽中酪氨酸Y192和/或Y231的磷酸化的物质。

优选地，所述物质包含仅当SEQ ID No.1的多肽在酪氨酸Y192、Y231或酪氨酸Y192和酪氨酸Y231处磷酸化时特异性结合SEQ ID.NO.1的WW-结构域结合蛋白的分离的磷酸化位点特异性抗体，其中所述抗体在所述酪氨酸未磷酸化时不结合SEQ ID No.1的多肽。

优选地，所述抗体是包含免疫球蛋白重链的免疫球蛋白。

优选地，所述抗体是包含免疫球蛋白轻链的免疫球蛋白。

优选地，所述免疫球蛋白是IgG1κ免疫球蛋白。

优选地，所述免疫球蛋白在免疫球蛋白的重链内包含人IgG1恒定区，并且在免疫球蛋白的轻链内包含人恒定区。

在一实施方案中，所述免疫球蛋白在重链内和轻链内包含完整的或部分的人框架区。

在一实施方案中，所述免疫球蛋白在重链内和轻链内包含鼠框架区。

优选地，所述抗体能够在细胞系中产生。

优选地，所述物质包含仅当SEQ ID No.1的多肽在酪氨酸Y192或者酪氨酸Y192和酪氨酸Y231处磷酸化时特异性结合SEQ ID.NO.1的WW-结构域结合蛋白的分离的磷酸化位点特异性适体，其中所述适体在所述酪氨酸未磷酸化时不结合SEQ ID No.1的多肽。

在一实施方案中，所述物质包含小干扰RNA如SEQ ID NO.2。

本发明的另一方面包括本发明的物质，其用于治疗癌症。

优选地，本发明的物质用于治疗乳腺癌和肺癌。

优选地，本发明的物质还包含式1的FH535化合物。

本发明的另一方面包括包含本发明的物质和式1的FH535化合物的组合物。

本发明的另一方面包括一种治疗患有癌症的患者的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)向患者施用干扰SEQ ID NO.1的多肽中酪氨酸Y192和/或Y231的磷酸化的物质。

附图说明

本发明的优选实施方案会参考以下附图来描述：

图1：雌激素和孕酮诱导的WBP2在Tyrl92和Tyr231处经由EGFR串话(cross-talk)的酪氨酸磷酸化

A：将血清饥饿的细胞用50ng/ml EGF(E)刺激5min，或者将去除激素的细胞用l0nM雌激素(E2)或100nM孕酮(P4)刺激24hr，用/不用10μΜ易瑞沙(Ir)预处理lhr。全细胞裂解物用于用所示抗体IP/IB分析。B：将HeLa用EGFR与V5标记的WT-WBP2或单个Y→F突变体共转染。C：将HeLa用EGFR与V5标记的野生型、WBP2的各个单突变体(Y192F、Y231F、Y253F)或双突变体(Y192-231F)共转染。对于实验B和C，转染后24hr，将细胞血清饥饿过夜并用50ng/ml EGF刺激5min。全细胞裂解物用于用所示抗体IP/IB分析。D：将血清饥饿的MCF7用50ng/ml EGF(E)刺激5min，或者将去除激素的细胞用l0nM雌激素(E2)或100nM孕酮(P4)刺激24hr，有/无10μΜ易瑞沙(Ir)预处理lhr。全细胞裂解物用于用所示抗体IP/IB分析。E：将HeLa用EGFR与V5标记的WT-WBP2或单个Y→F突变体共转染。F：将HeLa用EGFR与V5标记的WT-WBP2、WBP2的各个单突变体(Y192F、Y231F、Y253F)或双突变体(Y192-231F)共转染。对于实验B和C，转染后24hr，将细胞血清饥饿过夜并用50ng/ml EGF刺激5min。全细胞裂解物用于用所示抗体IP/IB分析。G：将MCF7用V5标记的WT-WBP2或Y192-231F-WBP2突变体转染。转染后24hr，将血清饥饿的MCF7用50ng/ml EGF(E)刺激5min，或者将去除激素的细胞用l0nM雌激素(E2)或l00nM孕酮(P4)刺激24hr。全细胞裂解物用于用所示抗体IP/IB分析。“O”表示“未处理/媒介物处理”。

图2：通过c-Src调节WBP2酪氨酸磷酸化

A：将HeLa用EGFR与WBP2的V5标记的WT或单个Y→F突变体共转染。转染后24hr，将细胞血清饥饿并用50ng/ml EGF刺激5min，用/不用10μΜ易瑞沙或1μΜAZD0530预处理lhr。全细胞裂解物用于用所示抗体IP/IB分析。B：在Src-DN过表达的存在或不存在下，将HeLa用EGFR与WBP2的V5标记的WT或单个Y→F突变体共转染。C：将HeLa用(a)WBP2；(b)WBP2和EGFR；(c)WBP2和野生型(WT)Src；(d)WBP2和组成型活化的(CA)Src；(e)WBP2、EGFR和WT-Src；(f)WBP2、EGFR和CA-Src；(g)Y192-231F、EGFR和WT-Src共转染。对于实验B和C，转染后24hr，将细胞血清饥饿过夜并用50ng/ml EGF刺激5min。全细胞裂解物用于用所示抗体IP/IB分析。D：将HeLa用EGFR与WBP2的V5标记的WT或单个Y→F突变体共转染。转染后24hr，将细胞血清饥饿并用50ng/ml EGF刺激5min，用/不用10μΜ易瑞沙或1μΜAZD0530预处理lhr。全细胞裂解物用于用所示抗体IP/IB分析。E：在Src-DN-K295M过表达的存在或不存在下，将HeLa用EGFR与WBP2的V5标记的WT或单个Y→F突变体共转染。F：将HeLa用(a)WBP2；(b)WBP2和EGFR；(c)WBP2和野生型(WT)Src；(d)WBP2和组成型活化的(CA)Src-Y529F；(e)WBP2、EGFR和WT-Src；(f)WBP2、EGFR和CA-Src；(g)Y192-231F、EGFR和WT-Src共转染。对于实验B和C，转染后24hr，将细胞血清饥饿过夜并用50ng/ml EGF刺激5min。全细胞裂解物用于用所示抗体IP/IB分析。G：将MCF7用V5标记的WBP2与阴性对照siRNA、c-Yes siRNA或c-Src siRNA共转染。对于这两个实验，转染后24hr，将细胞血清饥饿过夜并用50ng/ml EGF刺激5min。全细胞裂解物用于用所示抗体IP/IB分析。

图3：通过c-Yes调节WBP2酪氨酸磷酸化

A：将HeLa用(a)WBP2；(b)WBP2/Y192-231F和EGFR；(c)WBP2/Yl92-231F和野生型(WT)Yes；(d)WBP2Y192-231F、EGFR和WT-Yes；(e)WBP2/Y192-231F和组成型活化的(CA)Yes-Y357F；(f)WBP2/Y192-231F、EGFR和CA-Yes共转染。B：将HeLa用V5标记的WBP2与阴性对照siRNA、c-Src siRNA或c-Yes siRNA共转染。对于这两个实验，转染后24hr，将细胞血清饥饿过夜并用50ng/ml EGF刺激5min。全细胞裂解物用于用所示抗体IP/IB分析。A：将HeLa用(a)WBP2；(b)WBP2Y192-231F和EGFR；(c)WBP2/Y192-231F和野生型(WT)Yes；(d)WBP2/Y192-231F、EGFR和WT-Yes；(e)WBP2/Y192-231F和组成型活化的(CA)Yes-Y537F；(f)WBP2/Y192-231F、EGFR和CA-Yes共转染。B：将HeLa用V5标记的WBP2与阴性对照siRNA、c-Yes siRNA或c-Src siRNA共转染。对于这两个实验，转染后24hr，将细胞血清饥饿过夜并用50ng/ml EGF刺激5min。全细胞裂解物用于用所示抗体IP/IB分析。

图4：WBP2的酪氨酸磷酸化通过调节其核进入以及与ERα的相互作用来增强其在ERα活性中的共激活功能

A：将去除激素的MCF7或T47D用载体、WBP2-WT或WBP2-Y192-231F突变体以及ERE/PRE-萤光素酶报道构建体共转染。将细胞不作处理，或者(a)用50ng/ml EGF刺激5min，(b)用l0nM E2/100nM P4处理24hr，(c)用E2/P4和EGF刺激，存在或不存在用10μΜ易瑞沙(Ir)预处理1hr。然后测定各种条件中的ERa/PR反式激活的萤光素酶活性。**P<0.01，***P<0.001，学生t-检验(2-尾)。B：将T47D去除激素并用10nM E2刺激所示时间(0-24hr)，存在或不存在用10μΜ易瑞沙(Ir)预处理1hr。C：将WT-WBP2或Y192-231F突变体转染的T47D去除激素，然后用l0nM E2刺激24hr。对于实验B和C，然后收获细胞用于亚细胞分级分离为核和细胞质级分，所述级分用于用所示抗体IB/IP分析。组蛋白2A和GADPH分别用作核和细胞质标记物。D：将去除激素的MCF7用WT-WBP2或Y192-231F突变体转染。转染后24小时，将细胞用l0nM E2刺激24hr。全细胞裂解物用于用所示抗体IP/IB(对照IgG或WBP2抗体)分析。E：将去除激素的MCF7或T47D用载体、WBP2-WT或WBP2-Y192-231F突变体以及ERE/PRE-萤光素酶报道构建体共转染。将细胞不作处理，或者用l0nM E2/100nM P4刺激24hr，存在或不存在用10μΜ易瑞沙(Ir)预处理lhr。然后测定各种条件中ERD(上图)/PR(下图)反式激活的萤光素酶活性，相对于媒介物处理的载体对照分析。**P<0.01，***P<0.001，学生t-检验(2-尾)。F：将T47D去除激素并用l0nM E2处理所示时间(0-24hr)。G：将WT-WBP2或Y192-231F突变体转染的T47D去除激素，然后用l0nM E2刺激24hr。对于实验B和C，然后收获细胞用于亚细胞分级分离为核和细胞质级分，所述级分用于用所示抗体IB/IP分析。组蛋白2A和GADPH分别用作核和细胞质标记物。H：将去除激素的MCF7用WT-WBP2或Y192-231F突变体转染。转染后24小时，将细胞用l0nM E2刺激24hr。全细胞裂解物用于用所示抗体IP/IB(对照IgG或WBP2抗体)分析。I：将去除激素的MCF7用载体、WBP2-WT或WBP2-Y192-231F突变体以及ERE-萤光素酶报道构建体共转染。将细胞不作处理，或者用50ng/ml EGF刺激5min。然后测定各种条件中ERa反式激活的萤光素酶活性，相对于媒介物处理的载体对照分析。J：E2-应答的靶基因-细胞周期蛋白Dl蛋白表达通过WBP2的酪氨酸磷酸化来调节。将去除激素的载体、WBP2-WT或WBP2-Y192-231F突变体-表达MCF7用10nM的E2刺激。全细胞裂解物用于用所示抗体IB分析。K：T47D中在EGF刺激时核中酪氨酸磷酸化的WBP2。将T47D血清饥饿过夜并用50ng/ml的EGF刺激0-4hr。然后收获细胞用于亚细胞分级分离为核和细胞质级分，所述级分用于用所示抗体IB/IP分析。组蛋白2A和GADPH分别用作核和细胞质标记物。L：MDA-MB231中在EGF刺激时核中酪氨酸磷酸化的WBP2。将MDA-MB231血清饥饿过夜并用50ng/ml的EGF刺激所示时间(0-24hr)。然后收获细胞用于亚细胞分级分离为核和细胞质级分，所述级分用于用所示抗体IB/IP分析。组蛋白2A和GADPH分别用作核和细胞质标记物。M：EGF刺激的WBP2的核进入受其缺陷的酪氨酸磷酸化影响。将WT-WBP2或Y192-231F突变体转染的T47D(a)血清饥饿，然后用50ng/ml的EGF刺激5min。然后将细胞亚细胞分级分离为核和细胞质级分，所述级分用于用所示抗体IB/IP分析。组蛋白2A和GADPH分别用作核和细胞质标记物。

图5：WBP2磷酸化在E2介导的乳腺癌生物学中的作用

将MCF7用载体、WBP2-WT、WBP2-Y192-231E或WBP2-Y192-231F转染，并且在l0nM E2的存在或不存在下于所示时间点进行细胞增殖(A)、贴壁不依赖性生长(A)、伤口愈合(B)趋化性(B)和侵袭(B)测定。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，学生t-检验(2-尾)。C：在2D培养和在EMT标记—ZO-2和E-钙粘着蛋白上进行的免疫荧光中形态学检测载体、WBP2-WT、WBP2-Y192-231E和WBP2-Y192-231F突变体表达MCF7。D：示出在MCF7的稳定药物选择池中外源表达WBP2的WT、Y192-231E突变体和Y192-231F突变体的免疫印迹。将MCF7用pCEP4、WBP2-WT、WBP2-Y192-231E突变体和WBP2-Y192-231F突变体转染，用潮霉素选择3周，并且将抗性克隆收集和扩大。使这4种MCF7的WBP2稳定转染子在l0nM E2的存在或不存在下于所示时间点进行细胞增殖(E)、贴壁不依赖性生长(F)、伤口愈合(G)趋化性(H)和侵袭(I)测定。所有数据相对于在第0天或0hr的媒介物处理的载体对照进行比较。J：还在2D培养(上图)以及在EM标记J-钙粘着蛋白(中图)和ZO-2(下图)上进行的免疫荧光中形态学检测它们。J：用4种MCF7的WBP2稳定转染子在裸鼠中进行异种移植研究，并且在第22天评价和测量肿瘤形成。左图和右图分别示出用不同稳定转染子注射的每只小鼠的肿瘤体积分布和平均肿瘤体积；I：示出在MCF10A的稳定药物选择池中外源表达WBP2的WT和Y192-231D突变体的免疫印迹(左图)。在2D培养(中图)中形态学检测它们，并且使它们进行贴壁不依赖性软琼脂生长(右图)。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，学生t-检验(2-尾)。

图6：磷酸化WBP2介导的乳腺癌生物学的潜在机制

A：将来自载体、WBP2-WT、WBP2-Y192-231E突变体和WBP2-Y192-231F突变体表达MCF7或者具有WBP2敲低的Y192-231E突变体表达MCF7的全细胞裂解物用于用所示抗体IB分析。B：将载体、WBP2-WT、WBP2-Y192-231E突变体或WBP2-Y192-231F突变体表达MCF7用TOPFlash(上图)或ERE-萤光素酶(下图)报道构建体共转染。对于共转染ERE-萤光素酶的细胞，将它们不作处理或者用50ng/ml Wnt3a配体刺激16hr。然后测定各种条件中的TCF/ERa萤光素酶活性。**P<0.01，***P<0.001，学生t-检验(2-尾)。C：将载体或WBP2-Y192-231E突变体表达MCF7用所示浓度的他莫昔芬(Tam)和/或FH535处理。测量细胞数目。D：在处理后第2-4天收获来自用2μΜTam和/或15μΜFH5353处理的WBP2-Y192-231E突变体表达MCF7的全细胞裂解物并用于用所示抗体IB分析。

图7

WBP2-Y192和Y231的序列在蓝色□中突出。红色方框指示PY基序1、2和3。这些突出显示和方框不在原图中。使用这个代替

图8

WBP2序列衍生的肽的原型(prototype)的构建。最初，肽包含所有PY基序和酪氨酸位点。如果这些肽具有抗WBP2和抗乳腺癌功能，则将它们细化(即，缩短)以确定仍然保留期望活性的最短的可能的肽。NLS-使肽转入核的核定位信号。

图9

WBP2和磷酸化对肿瘤生长的影响的异种移植研究，将表达载体对照、WBP2、Y192-231E磷酸化模拟(phosphomimic)和Y192-231F磷酸化缺陷突变体的5×10⁶个MCF7细胞注射入Balb/c裸鼠的胁腹，并且在3周后于第22天和第32天测量肿瘤体积。上图示出在第22天和第32天用不同稳定转染子注射的每只小鼠的肿瘤体积分布。下图(左和右)示出用不同稳定转染子注射的小鼠产生的平均肿瘤体积。星号指示基于学生t-检验(2-尾)分析，相对于载体对照的统计显著差异。(*指p<0.05，而**指p<0.01)

图10

MCF10A中WBP2和Y192-231D磷酸化模拟突变体的过表达以及它们的功能研究，左上：示出在MCF10A的稳定药物选择池中外源表达WBP2的WT和Y192-231D突变体的免疫印迹。右上：在2D培养中形态学检测细胞。使细胞进行细胞增殖测定(左下)、贴壁不依赖性软琼脂生长测定(中下)和细胞侵袭测定(右下)。*p<0.05，**p<0.01，和***p<0.001，学生t-检验(2-尾)。

图11

与MCF10A中WBP2过表达和酪氨酸磷酸化相关的蛋白表达和/或活性变化，将来自载体、WBP2-WT和WBP2-Y192-231D-表达MCF10A的全细胞裂解物用于用所示抗体免疫印迹分析。

图12

HM-1未分化的对分化的小鼠胚胎干细胞中WBP2的表达

图13

在体内WBP2酪氨酸磷酸化的消除破坏WBP2-TAZ相互作用，将293细胞用Flag-TAZ与载体、WBP2-WT、磷酸化模拟Y192-231E或磷酸化缺陷Y192-231F突变体共转染，并且在50ng/ml EGF的存在或不存在下刺激。利用V5抗体将WBP2免疫沉淀，然后将免疫沉淀物用共免疫沉淀的Flag-TAZ探测。

图14

WBP2过表达和酪氨酸磷酸化激活E2F活性，将载体、WBP2-WT、WBP2-Y192-231E和WBP2-Y192-231F-表达MCF7用E2F报道构建体转染。转染后48hr，测定萤光素酶活性并针对组成型TK启动子海肾萤光素酶活性归一化。结果表示为载体的倍数。

图15

WBP2过表达或酪氨酸磷酸化激活细胞周期发展。将表达WBP2-WT、WBP2-Y192-231E和WBP2-Y192-231F的MCF7细胞用BrdU脉冲30分钟。48小时后收获细胞。用抗BrdU荧光抗体然后流式细胞术检测掺入的BrdU(左)。条形图(右)示出BrdU阳性细胞的百分比。

图16

过表达WBP2及其phoshomimic突变体的MCF7细胞中E2F蛋白上调。将来自载体、WBP2-WT、WBP2-Y192-231E和WBP2-Y192-231F-表达MCF7的全细胞裂解物用于用所示抗体免疫印迹分析。

图l7

在表达WBP2-Y192-231E的MCF7细胞上敲低E2F1和E2F3的效果。A.将表达WBP2-Y192-231E的MCF7细胞用所示siRNA转染，并且利用蛋白印迹证实敲低效率。B.将细胞用所示siRNA和E2F报道质粒共转染并在48小时后收获用于萤光素酶测定。将萤光素酶读数针对组成型TK启动子海肾萤光素酶读数归一化。C.将细胞用所示siRNA转染并进行BrdU掺入测定。将BrdU阳性细胞相对于对照siRNA处理的细胞的百分比作图为条形图。D.将细胞用所示siRNA转染。在第3天进行MTS测定。将相对于对照siRNA处理的细胞的细胞增殖百分比作图为条形图。

图18

将来自载体、WBP2-WT、WBP2-Y192-231E突变体和WBP2-Y192-231F突变体表达MCF7(A)或者具有WBP2敲低的Y192-231E突变体表达MCF7(B)的全细胞裂解物用于用所示抗体IB分析。它们的表达水平在3个独立实验中定量，并且平均值相对于肌动蛋白来表示。代表性印迹(图中从左至右的顺序：载体、WBP2、Y192-231E、Y192F)呈现为条形图的嵌图。**P<0.01，***P<0.001，相对于载体的学生t-检验(2-尾)。将载体、WBP2-WT、WBP2-Y192-231E突变体或WBP2-Y192-231F突变体表达MCF7用TOPFlash(C)或ERE-萤光素酶(D)报道构建体共转染。对于共转染ERE萤光素酶的细胞，将它们不作处理或者用50ng/ml Wnt3a配体刺激16hr。然后测定各种条件中的TCF(C)/ERD(D)萤光素酶活性，并且相对于未处理的载体对照进行分析。**P<0.01，***P<0.001，学生t-检验(2-尾)。E：将载体或WBP2-Y192-231E突变体表达MCF7用所示浓度的2DM他莫昔芬(Tam)和/或15DM FH535处理4天。每天测量细胞数目并相对于第0天的媒介物处理的载体表达细胞进行比较。F：将载体或WBP2-Y192-231E突变体表达MCF7用所示浓度(0-50DM)的FH535处理2天。测量细胞数目并相对于媒介物处理的细胞进行比较。用SPSS13.0统计学分析它们的IC50。G：在处理后第2-4天收获来自用2μΜTam和/或15μΜFH5353处理的WBP2-Y192-231E突变体表达MCF7的全细胞裂解物并用于用所示抗体IB分析。H：将载体或WBP2-Y192-231E突变体表达MCF7用所示浓度的100nM氟维司群和/或15DM FH535处理4天。在第2天和第4天测量细胞数目，并且相对于每天测量的媒介物处理的对照进行比较(上图)。收获这些处理的细胞用于用所示抗体IB分析(下图)。

图19

将来自载体、WBP2-WT、WBP2-Y192-231E突变体和WBP2-Y192-231F突变体表达MCF7(A)或者具有WBP2敲低的Y192-231E突变体表达MCF7(B)的全细胞裂解物用于用所示抗体IB分析。它们的表达水平在3个独立实验中定量，并且平均值相对于肌动蛋白来表示。代表性印迹(图中从左至右的顺序：载体、WBP2、Y192-231E、Y192F)呈现为条形图的嵌图。**P<0.01，***P<0.001，相对于载体的学生t-检验(2-尾)。

具体实施方式

本技术涉及发现WBP-2上的2个酪氨酸磷酸化位点，已证实所述位点：

1.调节其ER、TCF/b-连环蛋白和E2F共激活功能

2.调节WBP2的核易位

3.影响乳腺癌生物学(在EMT、细胞增殖和侵袭方面)

用适体或抗体如单克隆抗体或多克隆抗体或特异性探针或引物检测在WBP2(SEQ ID NO.1)的位点特异性位置Y192或Y129和Y231处的磷酸化可以用来诊断癌症或癌症的合适的疗法的预后。此外，干扰SEQ ID NO.1.的多肽中酪氨酸Y192和/或Y231的磷酸化的物质可以用作癌症的合适治疗。在一实施方案中，所述癌症为乳腺癌。在另一实施方案中，所述癌症为肺癌。所述技术适合依赖于EGFR、c-Src、c-Yes、ER、Wnt或E2F的其他癌症如肝癌；头部和颈部癌症；结肠直肠癌；骨癌以及本领域技术人员已知的其他癌症。

SEQIDNO.1:MALNKNHSEGGGVrVNNTESILMSYDHVELTFNDMKNVPEAFKGTKKGTVYLTPYRVIFLSKGKDAMQSFMMPFYLMKDCEIKQPVFGANYIKGTVKAEAGGGWEGSASYKLTFTAGGAIEFGQRMLQVASQASRGEVPSGAYGYSYMPSGAYVYPPPVANGMYPCPPGWYPPPPPEFWGPPMMDGAMGY*VQPPPPPYPGPMEPPVSGPDVPSTPAAEAKAAEAAASAY*YNPGNPHNVYMPTSQPPPPPYYPPEDKKTQ

用物质干扰Y192处的WBP2酪氨酸磷酸化或者干扰Y192和Y231处的WBP2酪氨酸磷酸化可以减缓或阻止癌症发展。实施方案包括所述物质可以减缓或阻止乳腺癌或肺癌发展。优选的干扰物质可以包括：单克隆抗体、肽、小分子、设计为抑制WBP2的表达的siRNA如siWBP-2；干扰WBP2的Y192磷酸化或者WBP2上的Y192和Y231磷酸化的适体或其他试剂，用于乳腺癌治疗。

WBP2作为癌症的药物靶标和生物标记物

我们已鉴定WBP2为EGF/EGFR和E2/ER信号传导的下游靶标。我们还已鉴定c-Yes和c-Src酪氨酸激酶为推定的WBP2的上游激酶并且因此可以调节WBP2活性和功能。

我们已鉴定WBP2在Y192和Y231处磷酸化，并且显示WBP2表达和磷酸化赋予生长因子独立性，导致ER+乳腺癌的生长、增殖、迁移和侵袭增加。

利用siRNA和shRNA沉默WBP2可以在体外消除三阴性乳腺癌细胞的生物学功能，包括增殖、生长、迁移和侵袭。

我们发现Y192和Y231处的酪氨酸磷酸化调节WBP2功能、定位以及与靶蛋白如ER和可能的其他癌基因/肿瘤抑制物的相互作用。

我们示出WBP2及其酪氨酸磷酸化激活的ER、TCF/b-连环蛋白和E2F转录活性。我们提供证据，WBP2在转录活性激活中的作用是由于但不必限于WBP2介导的多个癌基因的表达上调和有时激活，所述多个癌基因包括c-myc、wnt3a、b-连环蛋白、c-yes、YAP、ER、BCL2和其他转移相关的蛋白，包括金属蛋白酶。WBP2还抑制肿瘤抑制物以及其他生长调节物如p21和p16的表达。

我们发现与正常细胞和组织相比，WBP2在乳腺癌细胞系和组织中过表达。从约376个临床样品，我们发现3/4或更多的非癌组织(正常、增生和良性)具有不可检测水平的核WBP2，而大部分癌组织(导管原位癌、侵袭性癌症和转移性癌症)具有中等至高核水平的WBP2。

我们已从体外乳腺癌细胞系的研究示出，核WBP2是Y192/231处酪氨酸磷酸化的，而胞浆WBP2大部分是非磷酸化的。

在不同研究中已证实WW-结合蛋白2(WBP2)为酪氨酸激酶底物，激活ERaPR转录并在乳腺癌中起作用。然而，WBP2酪氨酸磷酸化在调节ER功能和乳腺癌生物学中的作用是未知的。这里，我们确定WBP2为雌激素信号传导经由EGFR串话的酪氨酸磷酸化靶标。使用显性失活的、组成型活化的突变体、RNAi和药理学研究，我们证实WBP2在Tyr192和Tyr231处的磷酸化可以通过c-Src和c-Yes激酶来调节。我们进一步证实消除WBP2磷酸化修复>60%的ERa报道活性，据推定这是通过阻断WBP2的核进入及其与ERa的相互作用。与载体对照相比，MCF7中WBP2及其磷酸化模拟突变体的过表达导致小鼠中较大的肿瘤，诱导细胞-细胞粘附的丧失，以雌激素依赖性和不依赖性方式增加细胞增殖、贴壁不依赖性生长、迁移和侵袭，这些事件基本上可以通过磷酸化缺陷突变体的过表达来消除。表达WBP2磷酸化模拟突变体的细胞的激素不依赖性与升高的ERa和Wnt报道活性有关。Wnt/3-连环蛋白抑制物FH535比他莫昔芬和氟维司群更显著地阻断磷酸化WBP2介导的癌细胞生长，部分是通过诱导ERa的表达。Wnt途径可能是WBP2介导的乳腺癌生物学中的重要组分。

因此，本发明的一方面包括一种检测患者的癌症的方法，所述方法包括以下步骤：

c)测量在分离自患者的第一样品中在Y192处具有磷酸化的酪氨酸的SEQ ID No.1的多肽的量；以及

d)将样品中在Y192处具有磷酸化的酪氨酸的SEQ ID No.1的多肽的量与分离自正常的非癌性细胞的第二样品中在Y192处具有磷酸化的酪氨酸的SEQ ID No.1的多肽的量进行比较，

其中相对于第二样品中在Y192处具有磷酸化的酪氨酸的SEQ ID No.1的多肽的量，第一样品中在Y192处具有磷酸化的酪氨酸的SEQ ID No.1的多肽的量的增加指示在第一样品中存在癌症。

优选地，第一和第二样品中在Y192处具有磷酸化的酪氨酸的SEQ ID No.1的多肽的量还检测在SEQ ID No.1的多肽的Y231处酪氨酸的磷酸化，其中相对于第二样品中在Y192和Y231处具有磷酸化的酪氨酸的SEQ ID No.1的多肽的量，第一样品中在Y192和Y231处具有磷酸化的酪氨酸的SEQ ID No.1的多肽的量的增加指示在第一样品中存在癌症。

优选地，所述癌症为乳腺癌和肺癌。

优选地，用仅当SEQ ID No.1的多肽在酪氨酸Y192或酪氨酸Y192和酪氨酸Y231处磷酸化时特异性结合SEQ ID.NO.1的WW-结构域结合蛋白的分离的磷酸化位点特异性抗体测量具有磷酸化的酪氨酸的SEQ ID No.1的多肽的量，其中当SEQ ID No.1的多肽在所述酪氨酸处未磷酸化时所述抗体不结合SEQ ID No.1的多肽。

优选地，所述方法还包括以下步骤：

c)使SEQ ID No.1的多肽与多核苷酸探针或引物接触，所述多核苷酸探针或引物包含多核苷酸序列，所述多核苷酸序列仅当SEQ ID No.1的多肽在酪氨酸Y192或酪氨酸Y192和酪氨酸Y231处磷酸化时在合适的杂交条件下能够选择性地杂交至SEQ ID No.1的多肽；以及d)检测所述探针或引物与在所述酪氨酸处磷酸化的SEQ ID No.1的多肽之间形成的任何双链体。

6.权利要求1-3中任一项的方法，其中用仅当SEQ ID No.1的多肽在酪氨酸Y192或Y231或者酪氨酸Y192和酪氨酸Y231处磷酸化时特异性结合SEQ ID.NO.1的WW-结构域结合蛋白的分离的磷酸化位点特异性适体测量具有磷酸化的酪氨酸的SEQ ID No.1的多肽的量，其中当SEQ ID No.1的多肽在所述酪氨酸处未磷酸化时所述适体不结合SEQ ID No.1的多肽。

本发明的另一方面包括干扰SEQ ID NO.1的多肽中酪氨酸Y192和/或Y231的磷酸化的物质。

优选地，所述物质包含仅在SEQ ID No.1的多肽于酪氨酸Y192、Y231或酪氨酸Y192和酪氨酸Y231处磷酸化时特异性结合SEQ ID.NO.1的WW-结构域结合蛋白的分离的磷酸化位点特异性抗体，其中所述抗体在所述酪氨酸未磷酸化时不结合SEQ ID No.1的多肽。

优选地，所述抗体是包含免疫球蛋白重链的免疫球蛋白。

优选地，所述抗体是包含免疫球蛋白轻链的免疫球蛋白。

优选地，所述免疫球蛋白是IgG1κ免疫球蛋白。

优选地，所述免疫球蛋白在免疫球蛋白的重链内包含人IgG1恒定区，并且在免疫球蛋白的轻链内包含人恒定区。

在一实施方案中，所述免疫球蛋白在重链内和轻链内包含完整的或部分的人框架区。

在一实施方案中，所述免疫球蛋白在重链内和轻链内包含鼠框架区。

在一实施方案中，所述物质可以是细化(refined)的肽，其基于磷酸化的酪氨酸Y192或、Y231或Y192和Y231或PY1、PY2和/或PY3两侧的序列。细化所述肽的方法描述于图8。由此WBP2序列衍生的肽的原型的构建包括磷酸化的酪氨酸Y192或、Y231或Y192和Y231以及磷酸化的酪氨酸Y192或、Y231或Y192和Y231任一侧的氨基酸。最初，肽包含所有PY基序和酪氨酸位点。如果这些肽具有抗WBP2和抗乳腺癌功能，则将它们细化(即，缩短)以确定仍然保留期望活性的最短的可能的肽。所述肽还包括核定位信号(NLS)以允许它们能够使该肽转入核。本领域技术人员已知的任何合适的NLS是合适的，在实例中使用的NLS具体是(PKKKRKV)。

有义：5'-CCCAAGAAGAAGCGAAAGGTC-3'

反义：5'-GACCTTTCGCTTCTTCTTGGG-3'

所述肽的实例包括：

SEQ ID NO.3[NLS]-PPGYPPPYPPPY

SEQ ID NO.4PPGYPPPYPPPY-[NLS]

SEQ ID NO.5[NLS]-YVQPPPPPYPGPMEPPVSGPDVPSTPAAEAKAAEAAASAY

SEQ ID NO.6YVQPPPPPYPGPMEPPVSGPDVPSTPAAEAKAAEAAASAY-[NLS]

优选地，所述抗体能够在细胞系中产生。

优选地，所述物质包含仅在SEQ ID No.1的多肽于酪氨酸Y192或者酪氨酸Y192和酪氨酸Y231处磷酸化时特异性结合SEQ ID.NO.1的WW-结构域结合蛋白的分离的磷酸化位点特异性适体，其中所述适体在所述酪氨酸未磷酸化时不结合SEQ ID No.1的多肽。

在一实施方案中，所述物质包含小干扰RNA如SEQ ID NO.2(5'-AGCAUCCGCUGUCCGAACUCAAUGG-3')。

本发明的另一方面包括本发明的物质，其用于治疗癌症。

优选地，本发明的物质用于治疗乳腺癌和肺癌。

优选地，本发明的物质还包含式1的FH535化合物

本发明的另一方面包括包含本发明的物质和式1的FH535化合物的组合物

本发明的另一方面包括一种治疗患有癌症的患者的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)向患者施用干扰SEQ ID NO.1的多肽中酪氨酸Y192和/或Y231的磷酸化的物质。

我们建议测量核WBP2表达作为更准确的癌症诊断和预后的方法。WBP2为转录调节物，并且核WBP2的异常表达可能是乳腺癌的致病机制。

我们公开WBP2的2个磷酸化位点-Y231和Y192，此外显示这2个酪氨酸位点的磷酸化调节乳腺癌生物学。

WBP2的核表达水平可以用作癌症的诊断或预后生物标记物，特别是乳腺癌。WBP2的检测试剂盒可以用于乳腺癌的早期检测/筛查，乳房造影术后组织病理学不确定病例或可疑病例的确认，所述试剂盒基于核酸、抗体、适体或其他试剂。总WBP2或WBP2的核表达还可以用来预测对药物的应答。

磷酸化位点特异性抗体、适体或其他试剂可以用来检测磷酸化的WBP2作为乳腺癌或来自其他来源的癌症中的诊断或预后特征。我们的数据支持这个，数据显示WBP2是EGFR、Src和Yes的磷酸化靶标。因为已报道这些酪氨酸激酶在许多人癌症中在表达或活性方面异常，这意味着具有任何这些激酶活性升高的任何癌症可能具有增加的WBP2磷酸化。

通过任何方法(包括但不限于RNAi和小分子)调节WBP2表达可以用来单独或与其他靶标联合阻断癌症生长、增殖、迁移、侵袭或转移。siRNA的实例为SEQ ID NO.2:5'-AACGTGCCAGAAGCCTTCAAACCTGTCTC-3'。

有效组合物的实例为干扰Y192和Y231处WBP2酪氨酸磷酸化的物质以及式1的FH535的化合物

Aβ-连环蛋白/Tcf抑制物，FH535，分子式：Ci₃HioCl₂N₂0₄S，分子量：361.2g/mol。

干扰WBP2在Y192和Y231处的酪氨酸磷酸化或者WBP2核定位可以用来直接或者通过调节其他癌基因和肿瘤抑制物的表达或功能来阻断乳腺癌生长、增殖、迁移、侵袭和/或转移。除了小分子，我们建议包含PY基序和/或Y192和Y231两侧以及包括Y192和Y231的序列的蛋白序列可以用来阻断WBP2磷酸化，因此单独或与其他治疗策略联合用于乳腺癌治疗。我们还建议除PY基序、Y192和Y231以外的衍生自WBP2的序列可以单独或者互相或与其他治疗策略联合用于乳腺癌治疗。

我们的数据提供直接的科学证据：i)通过至少2个乳腺癌细胞系中的过表达和敲低研究提供WBP2的作用，以及ii)2个酪氨酸位点对乳腺癌生物学的作用。对于后者，我们显示2个酪氨酸位点的突变减少乳腺癌细胞中乳腺癌生物学的各方面。

因为酪氨酸磷酸化可以阻断癌症生物学中的WBP2功能，所以这2个位点是靶向癌症疗法的有效位点。

WBP2表达可以令人信服地用作生物标记物。然而，因为表达不必与活性相关，所以需要疾病表型的更重要的决定因素。

因此，毫无疑问检测WBP2的磷酸化状态可能是比仅其表达更相关(因此更好)的诊断特征。我们的数据显示WBP2是ER、EGFR、Src、Yes的磷酸化靶标。这些全部是已报道在许多人类癌症中在表达或活性方面异常的酪氨酸激酶。这意味着具有任何这些激酶活性升高的任何癌症可能具有增加的WBP2磷酸化。因此，磷酸化位点特异性抗体的应用延伸至乳腺癌以外。事实上，我们的数据显示核WBP2(即，WBP2的功能形式)是酪氨酸磷酸化的，而大量WBP2(优选非功能形式)位于胞质部分中。这意味着磷酸化特异性WBP2抗体会检测WBP2的核/活性形式，与非磷酸化特异性WBP2抗体识别的非活性形式相比，所述WBP2的核/活性形式与癌症更相关。

还已检测到WBP2的表达水平在正常肺细胞中比在一组肺癌细胞系中低。在一些肺癌细胞系中，据发现WBP2在酪氨酸残基处组成型磷酸化。

虽然已证实转录共激活蛋白WBP2激活ER/PR功能，但是其调节模式、对乳腺癌生物学的影响和深层机制是未知的。我们确定WBP2为雌激素信号传导中经由EGFR串话的酪氨酸磷酸化靶标，c-Yes介导的WBP2在Tyr192和Tyr231处的磷酸化依赖于EGFR激活，而c-Src可以直接作用或是EGFR的上游。消除WBP2磷酸化通过阻断核进入以及WBP2与ERa的相互作用来损害其对ERa反式激活的共激活蛋白活性。MCF7中WBP2的野生型和磷酸化模拟突变体的过表达诱导细胞-细胞粘附蛋白的丧失，以雌激素依赖性和不依赖性方式增加细胞增殖、贴壁不依赖性生长、迁移和侵袭，这些事件基本上可以通过磷酸化缺陷突变体的过表达来消除。磷酸化模拟WBP2有效激活Wnt途径并增加Wnt介导的ERa功能的激活，这可能是通过上调ERa、3-连环蛋白和Wnt3a的表达。随后证实Wnt信号传导在WBP2介导的乳腺癌细胞增殖中至关重要。我们的发现使得分子上深入了解涉及WBP2、ERa和Wnt的复杂相互作用和信号传导网络。WBP2加入乳腺癌越来越多涉及的核激素受体共激活蛋白的序列。

优选实施方案

WBP2-一种新的乳腺癌中的磷酸化癌蛋白

通过我们以前对人乳腺癌发展的MCF10AT异种移植衍生的等基因细胞系模型的磷酸化蛋白质组(phosphoproteomics)筛选，首次在乳腺癌中牵涉WBP2(WW-结构域结合蛋白2)，其中发现WBP2在乳腺癌发展期间差异性磷酸化。我们还证实其是EGFR信号传导的真正酪氨酸磷酸化靶标。在后续研究中，我们发现WBP2表达在正常乳腺上皮细胞中低或不可检测，但是在乳腺癌发展模型以及各种亚型的多种乳腺癌细胞中过表达。因此，我们的目的是通过WBP2的蛋白过表达和酪氨酸磷酸化来研究WBP2在人乳腺癌的生长和发展中的癌基因作用。我们首先作图WBP2上的EGF依赖性酪氨酸磷酸化位点，并且鉴定酪氨酸激酶的Src家族的成员为推定的WBP2的上游激酶。然后，我发现雌激素(E2)刺激可以相似地通过EGFR和ER途径之间的串话诱导WBP2的酪氨酸磷酸化。亚细胞分级分离研究显示在E2或EGF刺激时WBP2的磷酸化依赖性核进入。与报道的WBP2作为核激素受体(ERa PR)的共激活蛋白的作用一致，消除WBP2上的酪氨酸磷酸化通过减少的E2/EGF刺激的WBP2的核进入以及体内的E2依赖性WBP2-ER相互作用显著损害E2诱导的ER反式激活。ER阳性MCF7乳腺癌细胞中WBP2的野生型和磷酸化模拟突变体的稳定过表达以E2不依赖性和/或E2依赖性方式增加其细胞增殖、在软琼脂中的粘附不依赖性生长、细胞迁移和细胞侵袭。这些细胞过程可以通过WBP2的磷酸化缺陷突变体至少部分抑制。将提出WBP2介导的癌基因转化的潜在机制。

我们还发现在ER阴性乳腺癌细胞，MDA-MB-231中稳定敲低WBP2也显著抑制乳腺癌细胞过程如生长、增殖、迁移和侵袭。

总的来说，我们的发现揭示了WBP2作为新的ER+和ER-乳腺癌的磷酸化癌蛋白的潜力，可以相信WBP2和/或其酪氨酸磷酸化形式可以用作潜在的人乳腺癌以及其他癌症类型如肺癌的预后标记物或治疗靶标。

材料和方法

抗体

通过NeoMPS,Inc，我们基于另一研究(11)中报道的17个氨基酸(N'-NDMKNVPEAFKGTKKGT-C)肽序列内部产生了抗WBP2多克隆抗体，将其亲和纯化，并且通过在WBP2特异性和对照肽的存在下用免疫前血清比较免疫印迹，互相免疫沉淀外源表达的标记的WBP2蛋白并用抗标签和抗WBP2抗体免疫印迹来严格证实(数据未显示)。抗WBP2小鼠单克隆抗体购自Abnova Corp.,Taipei,Taiwan；抗PY20-HRP、抗EGFR、抗β-/3-连环蛋白和抗Yes小鼠单克隆抗体获得自BD-Biosciences,San Diego,CA,USA；抗肌动蛋白-HRP、抗ERa、抗磷酸化ERa-Sl18、抗Src、抗细胞周期蛋白Bl、抗c-Myc、抗p21、抗pl6、抗p27、抗MMP2和抗ZO-2兔多克隆抗体，抗ERa和抗细胞周期蛋白Dl小鼠单克隆抗体，抗GADPH和抗波形蛋白山羊多克隆抗体获得自Santa Cruz Biotechnology Inc.,Santa Cruz,CA,USA；抗磷酸化Src-Y416、抗EGFR、抗YAPl、抗组蛋白2A、抗E-钙粘着蛋白、抗Wnt3a、抗GSK3、抗磷酸化GSK/3-S9、抗Bcl2、抗Akt和抗pERKl/2-Thr202/T r204兔多克隆抗体，抗pAkt-S473和抗ERKl/2小鼠单克隆抗体获得自Cell Signaling Technology Inc.,Danvers,MA,USA；抗V5小鼠单克隆抗体和抗V5-HRP获得自Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA,USA；抗Yes兔多克隆抗体获得自Millipore corp.,Billerica,MA,USA；抗磷酸化FAKl-Y397兔多克隆抗体获得自Abeam,Cambridge,UK；抗小鼠、抗兔和抗山羊辣根过氧化物酶(HRP)缀合物购自Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA。

质粒和报道基因

野生型WBP2的cDNA来自Origene(Rockville,MD)，并且将其亚克隆入pcDNA^TM6.2-Directional- 载体和pCEP4(Invitrogen)。所有Y→F突变均利用QuikChange II XL位点定向诱变试剂盒(Stratagene)来产生。

这些是馈赠-来自Sarah Courtneidge,EMBL的Src-野生型(WT)、组成型活化(CA)和显性失活(DN)-pSGT；来自Marius Sudol,Danville,PA,USA的Yes-WT和CA(Y357F)；来自Dean P.Edwards,Houston,TX,USA的2XERETATA-萤火虫Luc和2XPRE-TATA-萤火虫Luc；来自Yoshiaki Ito,Singapore的TOPFlash报道质粒。pRL-TK购自Promega。

野生型WBP2的cDNA来自Origene,Rockville,MD,USA，并且将其亚克隆入pcDNA^TM6.2-Directional- 载体和pCEP4(Invitrogen)。所有突变均利用QuikChange II XL位点定向诱变试剂盒(Stratagene,Agilent Technologies Inc.,Santa Clara,CA,USA)来产生。这些是馈赠-来自Sarah Courtneidge,EMBL,USA的Src-野生型(WT)、组成型活化(CA-Y529F)和显性失活(DNK295M)-pSGT；来自Marius Sudol,Danville,PA,USA的Yes-WT和CA(Y537F)；来自Dean P.Edwards,Houston,TX,USA的2XERE-TATA-萤火虫Luc和2XPRE-TATA-萤火虫Luc；来自Yoshiaki Ito,Singapore的TOPFlash报道质粒。pRL-TK购自Promega,corp.,Madison,WI,USA。

细胞培养和转染

MCF7、MDA-MB231、T47D、HeLa和A431来自美国典型培养物保藏中心。将MCF7、HeLa和MDA-MB231维持在包含10%FBS(Hyclone)和100U青霉素/链霉素(Invitrogen)的RPMI1640(Sigma)中。将T47D维持在包含10%FBS、10μg/ml胰岛素(Sigma)和100U青霉素/链霉素Pen/Strep的RPMI1640中。将A431维持在包含10%FBS和100U青霉素/链霉素的DMEM(Sigma)中。细胞系通过供应者进行的短串联重复(STR)概括分析来鉴定。MCF7和T47D ER阳性乳腺癌细胞系的ERa状态通过蛋白印迹来鉴定已确定ERa表达，并且测试所有细胞均不含支原体。所有实验均在第1代至第10代之间进行。根据制造商的说明书利用lipofectamine2000(Invitrogen)将60mm皿中的细胞用4μg质粒/l00nM siRNA转染。

配体和药物处理

对于所有涉及雌激素/孕酮(Sigma)的实验，在刺激之前将MCF7和T47D在包含5%活性炭-葡聚糖处理的FBS(Hyclone)的不含酚红的RPMI1640(Sigma)中培养至少2天。EGF来自Millipore，Wnt3a配体来自R&D systems，他莫昔芬和FH535来自Sigma，而易瑞沙和AZD0530来自AstraZeneca。为了处理，每天补充新鲜的激素/药物，持续超过1天。

细胞裂解、SDS-PAGE和免疫印迹

细胞培养、配体/药物处理和裂解

MCF7、MDA-MB231、T47D、HeLa和MCF10A来自美国典型培养物保藏中心。将MCF7、HeLa和MDA-MB231维持在包含10%FBS(Hyclone)和100U青霉素/链霉素(Invitrogen)的RPMI1640(Sigma)中。将T47D维持在包含10%FBS、10μg/ml胰岛素(Sigma)和100U青霉素/链霉素的RPMI1640中。将MCF10A维持在包含5%马血清以及以前所述的添加剂(17)的DMEM/F12(Sigma)中。对于所有涉及雌激素/孕酮(Sigma)的实验，在刺激之前将MCF7和T47D在包含5%活性炭-葡聚糖处理的FBS(Thermo Scientific Hyclone,South Logan,UT,USA)的不含酚红的RPMI1640(Sigma)中培养至少2天。EGF来自Millipore，Wnt3a配体来自R&D systems Inc.,Minneapolis,MN,USA，他莫昔芬、氟维司群和FH535来自Sigma，而易瑞沙和AZD0530来自AstraZeneca Singapore Pte Ltd,Singapore。为了处理，每天补充新鲜的激素/药物，持续超过1天。按照以前的报道(18)进行细胞裂解。

免疫沉淀/免疫共沉淀

如以前所述(19)进行免疫沉淀和免疫印迹。对于免疫共沉淀，将细胞在冰冷的缓冲液(50mM Tris，pH7.5；150mM NaCl；lmM EDTA；10%甘油；0.5%Nonidet P40；0.5%Triton X-100；50mM NaF；IX蛋白酶抑制剂；lmM Na₃V0₄)中裂解并在冰上温育15min以完全裂解。免疫沉淀之前，将500-1000μg裂解物通过与50μ1的50%抗小鼠/兔-IgG琼脂糖浆(Sigma)在4°C下温育lhr来预澄清。同时，将等量的抗小鼠/兔-IgG琼脂糖用5%BSA封闭过夜，4°C。然后将预澄清的裂解物与l-2μg抗体在4°C下温育过夜。然后通过与预封闭的抗小鼠/兔-IgG琼脂糖在4°C下温育2hr来捕获免疫复合物。在蛋白印迹之前，将免疫沉淀物用缓冲液(50mM Tris，pH7.5；150mM NaCl；lmM EDTA；10%甘油；0.5%NP40；0.5%Triton X-100；lmM Na₃V0₄)大量洗涤4X5min每次。

瞬时和稳定转染

对于瞬时转染，转染之前将细胞以70-80%汇合接种于60-mm皿中于不含抗生素的培养基中1天，并且按照制造商的说明书用4μg质粒DNA或50-100nM siRNA和12μl lipofectamine2000(Invitrogen)转染。转然后24-48hr收获细胞。对于反向转染，当仍悬浮时转染细胞(即在胰蛋白酶消化之后和平板接种之前)。对于稳定转染，将MCF7或MCF10A用pCEP4载体、WBP2-WT、WBP2-Y192-231E、WBP2-Y192-231D和WBP2-Y192-231F/pCEP4转染。转染后48hr，将细胞暴露于潮霉素(Invitrogen)[对于MCF7，250Gg/ml而对于MCF10A1，50ng/ml]3周并筛选WBP2蛋白表达。收集所选克隆并用相同选择压力维持。定期检查WBP2表达。

稳定细胞系建立

对于WBP2获得功能的过表达研究，用pCEP4载体、WBP2-WT、WBP2-Y192-231E和WBP2-Y192-23lF/pCEP4转染MCF7。转染后24hr，将细胞暴露于250ug/ml潮霉素(Invitrogen)3周，并且筛选WBP2蛋白表达。收集所选克隆并用相同选择压力维持。定期检查WBP2表达。

亚细胞分级分离

根据Dr.Richard Pattern,Tufts-New England Medical Centre(http://www.abcam.coin/index.html?pageconfig=resource&rid=l1473),Boston,MA,USA的方案进行亚细胞分级分离。简单地说，将板上的细胞用冰冷的PBS漂洗一次并刮入冰冷的低渗裂解缓冲液(20mM Hepes，pH7.4；10mM KCl；2mM MgC12；1mM EDTA；ImM EGTA；1mM DTT；IX蛋白酶抑制剂混合物；50mM NaF；1mM原钒酸钠)，在冰水温育1hr。使裂解物通过25G针15次。以3000rpm离心5min离心出核沉淀，重悬之前用低渗裂解缓冲液洗涤2次，并且在核裂解缓冲液(具有10%甘油和1%SDS的NID裂解缓冲液)中裂解。然后将核裂解物短暂地超声处理。将上清以8000rpm离心5min。所得的上清为胞质和膜级分。将该上清以40000rpm进一步离心1hr。将所得的上清收集为胞质级分。

萤光素酶报道测定

双萤光素酶TM报道测定系统(Promega)用于按照制造商的说明书顺序测量萤火虫和海肾萤光素酶活性。萤光素酶活性的定量利用发光计(Sirius)来进行。

双萤光素酶TM报道测定系统(Promega)用于按照制造商的说明书顺序测量萤火虫和海肾萤光素酶活性。萤光素酶活性的定量利用发光计(Sirius,Berthold-DS Inc,Germany)来进行。简单地说，将24-孔板中转染的细胞用冰冷的PBS漂洗一次并在RT下于1X被动裂解缓冲液(PLB)中裂解15min。将粗裂解物首先与萤光素酶测定底物(LAR II)温育以测量萤火虫萤光素酶，然后与Stop和Glo底物温育以测量海肾萤光素酶活性。

基于细胞的测定

利用CellTiter 一种水溶液非放射性(MTS)测定试剂(Promega)进行细胞增殖测定。利用CytoSelect96-孔细胞转化比色测定试剂盒(Cell Biolabs)测定贴壁不依赖性生长。

利用CytoSelect96-孔细胞迁移测定试剂盒，8μm(Cell Biolabs)进行趋化性和细胞侵袭测定。使用试剂盒的所有研究均按照制造商的说明书进行。对于伤口愈合测定，用p200枪头在汇合细胞单层中刻入伤口。将细胞洗涤一次以去除细胞碎片并平滑划痕的边缘，然后更换新鲜生长培养基。将细胞在37oC下温育，并且监测它们迁移入划痕区域长达24hr。利用相差显微镜，在划伤后0、8、16和24hr拍摄相同视野中的划痕的图像。利用Photoshop5.5定量地测量划痕的相对宽度。

siRNA序列

Yesl siRNA(5'-UUCUCCUACAAGAAUAUUAGCAGCC-3'),

v-Src siRNA(5'-GCCUCUCAGUGUCUGACUUCGACAA-3'),

萤光素酶-GL2siRNA(5'-CGUACGCGGAAUACUUCGA-3'),

WBP2siRNA(5'-AGCAUCCGCUGUCCGAACUCAAUGG-3')以及

WBP2UTR-siRNA(5'-CAGGAACUAGCAUUGUGGGACAUUA-3')来自Invitrogen。

免疫荧光

使细胞在6-孔板中的盖玻片上生长。各种处理之后，将细胞用4%多聚甲醛在室温下固定并用PBS中的0.5%Triton-X-100透化。用5%BSA封闭1小时后，将细胞与一抗温育过夜[抗ER□小鼠单克隆抗体，1:100，抗E-钙粘着蛋白兔多克隆抗体，1:100，抗ZO-2兔多克隆抗体，1:100]。然后与1:1000稀释的缀合至Al

酪氨酸-磷酸化的WBP2，一种新的癌症靶和生物标记物专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。