专利摘要

本发明涉及一种酶活性提高的青蒿紫穗槐二烯合酶突变体及其应用。所述的紫穗槐二烯合酶突变体在保持催化产物不变的情况下，酶活性大大高于野生型。与传统方法相比，采用本发明的青蒿紫穗槐二烯合酶突变体酶促生产青蒿素的效率高且成本低。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域；更具体地，本发明涉及一种酶活性提高的青蒿紫穗槐二烯合酶突变体及其应用。 

背景技术

青蒿素是中国科学家首次从青蒿(Artemisia annua)中分离鉴定的一种含过氧桥的倍半萜内酯，是目前最有效的治疗脑型疟疾和抗氯喹恶性疟疾的药物。以青蒿素为基础的综合疗法已受到世界卫生组织和西方国家的确认和推荐。青蒿中青蒿素含量低(0.01-1％干重)，且受品种和地域性种植影响大，资源紧缺。 

在青蒿素生物合成中，倍半萜成分紫穗槐二烯(Amorphadiene，Amorpha-4，11-diene)由青蒿中的紫穗槐二烯合酶(amorpha-4，11-diene synthase；ADS)催化FPP环化形成，它是青蒿酸和青蒿素生物合成的共同前体。增加紫穗槐二烯的产量可以促进青蒿酸和青蒿素的合成和积累。人工全合成青蒿素工艺复杂、成本高。因此，目前世界上青蒿素原料主要依靠从野生和栽培青蒿中直接提取。 

青蒿素生物合成途径研究近年来取得许多进展，已经克隆了紫穗槐二烯合酶(ADS)、青蒿酸合成酶(CYP71AV1)和青蒿醛还原酶Dbr2。科学家们利用代谢工程技术尝试通过微生物发酵合成青蒿素前体青蒿酸，然后通过有机半合成生产青蒿素，以降低青蒿素的生产成本。2006年，Jay Keasling对酵母菌进行了遗传工程改造，使之产生出高水平的青蒿酸。目前认为，利用微生物生产青蒿酸是一个切实可行的方法，可以降低青蒿素的生产成本。另外，也可以通过转基因植物过量表达青蒿素生物合成的相关基因，以期提高代谢产物的含量。 

发酵工程菌种的遗传改造需要将青蒿酸生物合成途径中的基因ADS和CYP701AV1整合到工程酵母或者工程细菌染色体中。并且，ADS的酶活性直接关系到青蒿酸的生物合成的产量。 

因此，如何有效地提高ADS的酶活性是本领域需要深入研究的。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种酶活性提高的青蒿紫穗槐二烯合酶突变体及其应用。 

在本发明的第一方面，提供一种突变型紫穗槐二烯合酶，其对应于SEQ IDNO：2(野生型)氨基酸序列的第399位由苏氨酸突变为丝氨酸。 

在另一优选例中，该蛋白是： 

(a)具有SEQ ID NO：3(突变型)所示的氨基酸序列的蛋白；或 

(b)由(a)所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个(如1-20个；较佳地1-10个；更佳地1-5个；更佳地1-3个)氨基酸且保留(a)蛋白活性的由(a)衍生的蛋白；且该蛋白的氨基酸序列中对应于SEQ ID NO：3第399位位置的氨基酸为丝氨酸。 

在本发明的另一方面，提供一种分离的多核苷酸，该多核苷酸选自下组： 

(i)编码所述的突变型紫穗槐二烯合酶蛋白的多核苷酸；或 

(ii)与(i)中的多核苷酸互补的多核苷酸。 

在另一优选例中，该多核苷酸编码具有SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的多肽。 

在本发明的另一方面，提供一种载体，它含有所述的多核苷酸。 

在本发明的另一方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，它含有所述的载体，或基因组中整合有所述的多核苷酸。 

在另一优选例中，所述的宿主细胞是酵母、细菌或植物细胞。更优选地，所述的宿主细胞是大肠杆菌。 

在本发明的另一方面，提供一种生产突变型紫穗槐二烯合酶的方法，包括步骤： 

(1)培养所述的宿主细胞，获得培养物；和 

(2)从培养物中分离突变型紫穗槐二烯合酶。 

在本发明的另一方面，提供所述的突变型紫穗槐二烯合酶的用途，用于生产紫穗槐二烯和/或青蒿酸。 

在本发明的另一方面，提供一种生产紫穗槐二烯的方法，所述的方法包括：利用所述的突变型紫穗槐二烯合酶催化法尼基焦磷酸(farnesyl pyrophosphate，FPP)环化，从而获得紫穗槐二烯。 

在另一优选例中，所述的突变型紫穗槐二烯合酶催化FPP环化在胞内或胞外进行。 

在另一优选例中，所述的突变型紫穗槐二烯合酶催化法尼基焦磷酸环化在胞内进行，包括步骤：将所述的突变型紫穗槐二烯合酶的编码基因转化入宿主细胞，培养该细胞，从而生产紫穗槐二烯。 

在另一优选例中，所述的突变型紫穗槐二烯合酶催化法尼基焦磷酸环化在胞内进行，包括步骤：将所述的突变型紫穗槐二烯合酶的编码基因以及法尼基焦磷酸产生酶(MVA/MEP途径中的酶；选自但不限于：乙酰辅酶A硫解酶、HMG-CoA合成酶、HMG-CoA还原酶、甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶、IPP异构酶、5-磷酸-D-1-脱氧木酮糖合成酶5-磷酸-D-1-脱氧木酮糖还原异构酶、异戊烯二磷酸异构酶、5-磷酸-D-1-脱氧木酮糖合成酶、5-磷酸-D-1-脱氧木酮糖还原异构酶、4-磷酸-2C-甲基赤藓醇4-胞苷磷酸合酶、2C-甲基赤藓醇4-胞苷磷酸激酶、2C-甲基赤藓醇-2，4-焦磷酸合酶、1-羟基-2-甲基-2-丁烯-4-焦磷酸合酶、1-羟基-2-甲基-2-丁烯-4-焦磷酸还原酶、FPP合成酶、1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸合酶、HMG-CoA还原酶、香叶基转移酶等)的编码基因转化宿主细胞，培养该细胞，从而生产紫穗槐二烯。 

在本发明的另一方面，提供一种生产青蒿酸的方法，所述的方法包括：将所述的突变型紫穗槐二烯合酶的编码基因，法尼基焦磷酸产生酶(MVA/MEP途径中的酶)编码基因，青蒿酸合成酶编码基因，细胞色素P450还原酶编码基因转化入宿主细胞；培养该细胞，从而生产青蒿酸。 

在另一优选例中，还包括：将获得的青蒿酸通过有机半合成生产青蒿素。 

在另一优选例中，在25-45℃下培养所述的细胞。 

在另一优选例中，在35-43℃下培养所述的细胞；更佳地，在38-42℃下培养所述的细胞。 

在另一优选例中，在PH下6.0-10.5下培养所述的细胞。 

在另一优选例中，在PH下8.5-10下培养所述的宿主细胞；更佳地，在PH下9-10下培养所述的宿主细胞；最佳地为PH9.8。 

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。 

附图说明

图1、ADS及突变克隆的序列对比结果。从结果中可以看出，399位氨基酸残基T突变成了中性氨基酸残基S、A、N，和带电荷的氨基酸残基R、D。 

图2、ADS及其突变体的GC-MS图。A-F分别代表野生型和不同突变体GC-MS图；G和H分别代表E图和F图的放大图。I显示了α-Gurjunene(1)和Zingiberene(2)的结构图。其中AMO代表紫穗槐二烯。 

图3、温度(上图)、pH(下图)对野生型和突变体ADS(T399S)活力的影响。 

具体实施方式

本发明人经过长期的研究，意外地获得了一种突变型紫穗槐二烯合酶，所述的突变型紫穗槐二烯合酶在保持催化产物不变的情况下，酶活性大大高于野生型。基于此完成了本发明。 

本发明的多肽(突变型紫穗槐二烯合酶)可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。 

本发明还包括突变型紫穗槐二烯合酶的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的突变型紫穗槐二烯合酶相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。 

在本发明中，术语“突变型紫穗槐二烯合酶”或“突变型紫穗槐二烯合酶蛋白”指具有突变型紫穗槐二烯合酶活性的SEQ ID NO：3序列的多肽。该术语还包括具有与突变型紫穗槐二烯合酶相同功能的、SEQ ID NO：3序列的变异形 式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-20个，最佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个、1-3个、或1-2个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括突变型紫穗槐二烯合酶的活性片段和活性衍生物。但是，这些变异形式中，对应于SEQ ID NO：2氨基酸序列第399位的氨基酸为丝氨酸。 

多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与所述的突变型紫穗槐二烯合酶DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗突变型紫穗槐二烯合酶的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含突变型紫穗槐二烯合酶或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了突变型紫穗槐二烯合酶蛋白的可溶性片段。通常，该片段具有突变型紫穗槐二烯合酶序列的至少约20个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。 

发明还提供突变型紫穗槐二烯合酶或多肽的类似物。这些类似物与所述的突变型紫穗槐二烯合酶的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。但是，这些多肽类似物中，对应于SEQ ID NO：2氨基酸序列第399位的氨基酸为丝氨酸。 

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。 

在本发明中，“突变型紫穗槐二烯合酶的保守性变异多肽”指与SEQ ID NO：3的氨基酸序列相比，有至多20个，较佳地至多10个，较佳地至多8个，更佳地 至多5个，最佳地至多3个(如1个、2个或3个)氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。 

表1 

本发明还提供了编码本发明突变型紫穗槐二烯合酶或其保守性变异多肽的多核苷酸序列。 

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO：3所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO：3的蛋白质，但与SEQ ID NO：3所示的编码区序列有差别的核酸序列。 

编码SEQ ID NO：3的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。 

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以 是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。 

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。 

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％(如85％，90％，95％，99％)相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQID NO：3所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。 

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码突变型紫穗槐二烯合酶的多聚核苷酸。 

本发明的编码突变型紫穗槐二烯合酶的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。 

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。 

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。 

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。 

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或突变型紫穗槐二烯合酶编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。 

通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列来表达或生产重组的突变型紫穗槐二烯合酶。一般来说有以下步骤： 

(1).用本发明的编码突变型紫穗槐二烯合酶(或变异体)的多核苷酸，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞； 

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞； 

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。 

本发明中，突变型紫穗槐二烯合酶多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。 

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含突变型紫穗槐二烯合酶编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。 

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的卡那霉素或氨苄青霉素抗性。 

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。 

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，酵母，植物细胞 等。 

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。 

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。 

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。 

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。 

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。 

本发明的突变型紫穗槐二烯合酶(或其片段、变异形式或衍生物)的多核苷酸在转化入宿主细胞后，可直接用于生产紫穗槐二烯，增加紫穗槐二烯的产量可以促进青蒿酸的合成。 

在获得量本发明所述的突变型紫穗槐二烯合酶的信息后，本领域人员清楚如何用于后续制备紫穗槐二烯或青蒿酸。所述的突变型紫穗槐二烯合酶催化FPP环化，从而获得紫穗槐二烯。各种胞内或胞外的制备方法均包含在本发明中，或可被运用于本发明中。 

所述的突变型紫穗槐二烯合酶催化FPP环化可在胞内或胞外进行。作为本 发明的一种优选方式，提供了一种胞内生物合成紫穗槐二烯的方法：将所述的突变型紫穗槐二烯合酶的编码基因转化入宿主细胞，培养该细胞，从而生产青蒿酸。 

作为本发明的优选方式，提供了一种在胞内直接生产青蒿酸的方法，所述的方法包括：将所述的突变型紫穗槐二烯合酶的编码基因以及FPP产生酶(即：MVA/MEP途径中的酶；选自但不限于：乙酰辅酶A硫解酶、HMG-CoA合成酶、甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶、IPP异构酶、5-磷酸-D-1-脱氧木酮糖合成酶5-磷酸-D-1-脱氧木酮糖还原异构酶、异戊烯二磷酸异构酶、5-磷酸-D-1-脱氧木酮糖合成酶、5-磷酸-D-1-脱氧木酮糖还原异构酶、4-磷酸-2C-甲基赤藓醇4-胞苷磷酸合酶、2C-甲基赤藓醇4-胞苷磷酸激酶、2C-甲基赤藓醇-2，4-焦磷酸合酶、1-羟基-2-甲基-2-丁烯-4-焦磷酸合酶、1-羟基-2-甲基-2-丁烯-4-焦磷酸还原酶、FPP合成酶、1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸合酶、HMG-CoA还原酶、香叶基转移酶等)的编码基因转化宿主细胞，培养该细胞，从而生产紫穗槐二烯。FPP产生酶及其编码基因是本领域已知的，本领域技术人员清楚如何获得这些酶以及如何将之转化细胞。以上MVA/MEP途径中的酶也是本领域技术人员熟知的。 

作为本发明的优选方式，提供了一种在胞内直接生产青蒿酸的方法，所述的方法包括：将所述的突变型紫穗槐二烯合酶的编码基因，FPP产生酶(MVA/MEP途径中的酶的编码基因，以及青蒿酸合成酶CYP71AV1(编码基因参见GenBank：DQ268763)和CPR(编码基因参见GenBank：DQ318192)转化入宿主细胞；培养该细胞，从而生产青蒿酸。青蒿酸合成酶及其编码基因是本领域已知的，本领域技术人员清楚如何获得这些酶以及如何将之转化细胞。所获得的青蒿酸通过有机半合成即可生产青蒿素。与传统方法相比，这种生产青蒿素的方法效率高且成本低。 

本发明人还研究了所述的突变型紫穗槐二烯合酶的适宜温度。因此，作为本发明的优选方式，在25-45℃下培养所述的细胞。更佳地，在35-43℃下培养所述的细胞；更佳地，在38-42℃下培养所述的细胞。或者，在25-45℃下储存所述的突变型紫穗槐二烯合酶。更佳地，在35-43℃下储存所述的突变型紫穗槐二烯合酶；更佳地，在38-42℃下储存所述的突变型紫穗槐二烯合酶。从而较好的保留所述的突变型紫穗槐二烯合酶的酶活性。 

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook and Russell(2001).Molecular Cloning：A Laboratory Manual(3rd ed.)；Cold Spring Harbor Laboratory Press中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。 

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。 

实施例1、青蒿总RNA的提取、PCR扩增目的基因ADS及定点突变 

a、青蒿总RNA的提取 

取青蒿材料(约100mg)于液氮中充分研磨。转移至1.5ml离心管中，加入1mL Trizol(Invitrogen，Cat.15596-018)，混匀，室温放置5min。12,000rpm离心10min，弃取沉淀。上清中加入200μL三氯甲烷，混匀，12,000rpm离心10min。取上清，加入500μL异丙醇沉淀RNA。12,000rpm离心10min，沉淀用70％乙醇洗涤，真空干燥，溶于20-50μL H₂O(RNase free)。将RNA用10mM Tris-HCl(pH7.5)做适当稀释，测定波长在200-300nm之间的UV吸收值。RNA浓度＝40μg/mL×A₂₆₀×稀释倍数。A₂₆₀/A₂₈₀应当在1.9至2.1之间。PolyA mRNA第一链反转录采用RNA PCR体系(TaKaRa，Cat.DRR019A)。反应体系如下： 

42℃反应30min。沸水煮5min后，置于冰上。反转录产物(或稀释10倍后)可直接用于PCR扩增目的基因。 

b、PCR扩增目的基因ADS 

用高保真酶KOD-plus DNA聚合酶(ToYoBo)扩增ADS全长基因序列(1641bp)，引物序列： 

ADS-S：5’-TTTCCATGGCTATGTCTCTTACAGAAGAAAAACCTA-3’(SEQ ID NO：14)； 

ADS-AS：5’-TTTGGATCCTCATATACTCATAGGATAAACGAGT-3’(SEOID NO：15)。 

PCR反应条件为：94℃变性5min；94℃变性30s，56℃复性30s，68℃延伸120s，扩增30至35个循环；68℃保温10min。4℃保温。 

c、定点突变 

使用重叠延伸PCR技术，构建成功多个单点突变体、双突变体、三突变体及多突变体。对这些突变体的DNA序列进行了测定。 

引物序列如下： 

ADS第399位的T→S(ADS-T399S)，突变相应位点密码子的引物： 

ADS-T399S-S：5’-GTTGTAATCATTAGTGGCGGTGCTA-3’(SEQ ID NO：4)， 

ADS-T399S-AS：5’-TAGCACCGCCACTAATGATTACAAC-3’(SEQ IDNO：5)； 

ADS第399位的T→A(ADS-T399A)，突变相应位点密码子的引物： 

ADS-T399A-S：5’-GTTGTAATCATTGCTGGCGGTGCTA-3’(SEQ ID NO：6)， 

ADS-T399A-AS：5’-TAGCACCGCCAGCAATGATTACAAC-3’； 

ADS第399位的T→N(ADS-T399N)，突变相应位点密码子的引物(SEQ IDNO：7)： 

ADS-T399N-S：5’-GTTGTAATCATTAATGGCGGTGCTA-3’(SEQ ID NO：8)， 

ADS-T399N-AS：5’-TAGCACCGCCATTAATGATTACAAC-3’(SEQ IDNO：9)； 

ADS第399位的T→D(ADS-T399D)，突变相应位点密码子的引物： 

ADS-T399D-S：5’-GTTGTAATCATTGATGGCGGTGCTA-3’(SEQ ID NO： 10)， 

ADS-T399D-AS：5’-TAGCACCGCCATCAATGATTACAAC-3’(SEQ IDNO：11)； 

ADS第399位的T→R(ADS-T399R)，突变相应位点密码子的引物： 

ADS-T399R-S：5’-GTTGTAATCATTCGTGGCGGTGCTA-3’(SEQ ID NO：12)， 

ADS-T399R-AS：5’-TAGCACCGCCACGAATGATTACAAC-3’(SEQ IDNO：13)。 

蛋白突变测序结果见图1。 

实施例2、载体构建和大肠杆菌转化 

a、载体构建 

KOD-plus DNA聚合酶扩增ADS编码区片段(ADS)及突变体片段(ADS-T399S，ADS-T399A，ADS-T399N，ADS-T399D，ADS-T399R)，经NcoI/BamHI酶切连入pET-32a载体(Amp^r，Novagen，America)，获得重组载体。 

b、感受态细胞制备 

-70℃储存的大肠杆菌DH5α或BL-21，在固体LB平板上划线，37℃培养过夜；挑取单菌落于5mL液体LB培养基中，250rpm培养过夜。第二天，按1/50的比例放大接种到500mL液体LB培养基中，18-22℃培养，至OD₆₀₀≈0.5(约5-6h)，冰上冷却10min。4℃2,500g离心10min，菌体用160mL转化缓冲液重悬，离心弃上清，菌体最后用40mL转化缓冲液重悬，加入3mL DMSO，混匀。分装，每管50μL，液氮速冻，-70℃保存。 

转化缓冲液：55mM MnCl₂，15mM CaCl₂，250mM KCl，10mM PIPES(pH6.7)，新鲜配制，冰上预冷。 

LB培养基(1L)：10g NaCl，5g酵母抽提物，10g蛋白胨，pH 7.0。固体LB培养基加入15g/L琼脂粉。 

c、转化 

加DNA样品(以上获得的重组载体，0.1-0.5μg)于50μL融化的BL21(DE3)E.coli细胞中，混匀，冰上放置25min；42℃热处理90s，冰上放置3 min；加100μL液体LB培养基，37℃复苏培养30min；涂于选择平板，培养12-16h。然后挑单菌落进行PCR鉴定。 

DNA琼脂糖凝胶电泳、片段的酶切、纯化和连接参考Sambrook和Russell(Sambrook and Russell(2001).Molecular Cloning：A Laboratory Manual(3rd ed.)；Cold Spring Harbor Laboratory Press)。 

实施例3、RT-PCR 

1μg总RNA，Oligo(dt)₂₀为引物，10μL反应体系，按照反转录试剂盒(TOYOBO，Osaka，Japan)要求进行反转录。42℃反应30min。沸水煮5min后，置于冰上。反转录产物(或稀释10倍后)可直接用于PCR检测。 

根据已知的ADS序列，合成了PCR引物，分析ADS表达时，以青蒿Actin1(GenBank：EU531837)作为内对照，校正RT-PCR反应的模板量。PCR条件为：反应的复性温度和延伸时间由引物和扩增片段长度决定。一般反应条件为：94℃变性5min；94℃变性30s，55-60℃复性30s，72℃延伸30s，扩增25至35个循环；72℃保温10min。4℃保温。 

实施例4、原核表达和酶活测定 

a：原核表达 

BL21细胞在含50μg/mL Ampicillin的LB平板上37℃生长过夜，PCR鉴定挑取阳性单菌落在液体培养基中培养过液，取500μL培养物扩大培养到50mL，直到OD₆₀₀≈0.6加入IPTG到终浓度为0.5mmol/L，继续在20℃诱导培养过夜(20h)。取6mL菌液12000rpm离心5分钟，沉淀悬浮于预冷的3mL Buffer(25mM Mopso，pH 7.0，5mM DTT，和10％[v/v]甘油，5mM MgCl₂)中，超声波破碎(3S开，7S关，处理3min，25％power)细胞，离心，取上清进行SDS-PAGE电泳鉴定或做体外酶活检测。或者依照Ni-NTA Spin Kit手册(Qiagen，Valencia，CA)，纯化带有His-Tag的重组蛋白(ADS酶或其各突变体)，并电泳鉴定。 

b：酶活测定 

上述获得的ADS酶或其各突变体蛋白在1.5mL EP管中进行酶活测定，500μL上述蛋白中加入FPP(Farnesyl pyrophosphate，Sigma-Aldrich，F6892)至终浓度40μmol/L，在反应体系上方覆盖400μL正己烷，37℃反应1小时，取4μL进 行GC-MS分析(安捷伦6890/5973GC-MSD气相色谱-质谱检测器)。 

c：仪器和色谱条件 

安捷伦6890/5973GC-MSD气相色谱-质谱检测器，采用HP5-MS石英毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm，安捷伦)。高纯氦气作为载气，载气流速为1ml/min，温度设置为220℃。进行分析时，升温程序为80℃起始，10℃/min升到250℃，然后20℃/min升到280℃，保持2.5min。质谱采用EI源，扫描范围为30-500m/z，离子源和四级杆温度分别为250℃和150℃，扫描频率为5次/s。化合物的结构和名称通过NIST(National Institute of Standards and Technology)和Wiley libraries两个数据库共同决定。 

ADS及其突变体的GC-MS图见图2。在BL-21大肠杆菌中表达空载体(BL-21)后分离的蛋白(细菌总蛋白或者如果是纯化蛋白，会有一些表达的标签如his-tag、s-tag)，并没有特异的产物产生；表达野生型ADS，体外酶活检测发现：9.5分钟左右的地方产生了一个比较特异的紫穗槐二烯的峰；表达399位带电荷氨基酸残基(T399D、T399R)突变体，会造成酶失活，9.5分钟左右的地方特异的紫穗槐二烯的峰消失；表达399位中性氨基酸残基突变体(除S外，如T399N、T399A)，会造成酶产物特异性变化，9.5分钟左右的地方特异的紫穗槐二烯的峰变成双峰，除紫穗槐二烯外还产生了2种新产物α-Gurjunene和Zingiberene。表达399位中性氨基酸残基S突变克隆，产物没有变化。 

实施例5、动力学分析及最适温度和最适pH测定 

水浴锅加热，温度选择25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃六个梯度。pH选择了7.50、8.10、8.60、9.20、9.80、10.10、10.50和10.70等八个梯度，其中pH7.50、8.10和8.60用Tris-盐酸缓冲液(0.05M)，pH9.20、9.80、10.10、10.50和10.70用甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(0.05M)。缓冲液中附加5mM DTT和5mMMgCl₂。最适pH测定时用3μg的纯化蛋白，在30℃反应5min。 

在上述各条件下，加入前述获得的野生型和突变体ADS至1.5mL EP管中进行酶活测定，500μL缓冲液中加入FPP至终浓度40μmol/L，在反应体系上方覆盖400μL正己烷，37℃反应1小时，取4μL进行GC-MS分析。 

结果如图3。表明：野生型和突变体ADS最适温度都在40℃左右，且40℃以 下突变体都比野生型酶活性提高很多，40℃之上突变体失活速度大于野生型(图3上图)。最适pH野生型在10.5左右，突变体在9.8左右，在pH10之前突变体都比野生型酶活性提高很多(图3下图)。 

动力学分析时用0.025M HEPES缓冲液包含3μg的纯化蛋白、5mM DTT及5mM MgCl₂，在25℃反应5-10min，使用底物FPP的浓度从3μm到100μm。K_m用Lineweaver-Burk曲线计算。结果如表2。 

表2、ADS及ADS突变克隆的酶活参数检测 

K_m值等于酶促反应速度达到最大反应速度一半时所对应的底物浓度，是酶的特征常数之一。不同的酶K_m值不同，同一种酶与不同底物反应K_m值也不同，K_m值可近似的反应酶与底物的亲和力大小：K_m值大，表明亲和力小；K_m值小，表明亲合力大。 

k_cat为催化常数，又叫做转换数(TN值)。它的单位为s^-1，k_cat值越大，表示酶的催化速率越高。 

k_cat/K_m的大小用于比较不同酶或同一种酶催化不同底物的催化效率。 

测定不同底物浓度时，对测得的反应速度与相应底物浓度进行回归分析，求得K_m值。计算公式为米氏方程(Michaelis-Menten equation)：v＝V_max*[S]/(Km+[S])(公式1)，v代表反应初速度，V_max代表最大反应速度，[S]代表底物浓度。此运算可同时得到Vmax。根据公式V_max＝k_cat*[E](公式2)计算k_cat；其中，V_max为最大反应速度，在计算K_m值时求得；[E]为酶浓度。 

结果表明：用氨基酸S等位置换了原来酶中的T之后，会使突变后的ADS对底物FPP具有更高的催化效率，催化效率提高71.7％。同时其转换数(K_cat)和最大反应速度(V_max)都提高了约83％。 

实施例6、利用转化本发明的突变蛋白的编码序列的微生物生产紫穗槐二烯或青蒿酸 

培养基：LB；高压蒸汽灭菌：121℃。 

质粒构建：pET-32a，装入ADS或其突变体的编码基因(如前述实施例2“a”)。 

将以上获得的重组质粒转化(如前述实施例2“b”和“c”)感受态的BL21(DE3)E.coli细胞，获得重组的细胞。 

发酵过程： 

1.种子培养 

从共转化的平板上挑取含重组质粒pET-32a(含ADS或其突变体酶的编码基因)BL21(DE3)E.coli菌落，接种到装有2ml LB(100mg/L Amp)培养基的15×150mm试管中，以200rpm，37℃培养过夜，然后将一级培养物按1％接种量转接到装有30ml LB(100mg/L Amp)的250ml的摇瓶中，培养约5h后，作为二级种子转接到发酵培养基中。 

2.发酵 

以1％的接种量，将二级种子接种到装有20ml LB的250ml摇瓶中(均含有100mg/L Amp)，280rpm，37℃培养至OD600＝0.4-0.8时，用0.1mM的IPTG诱导表达，同时加入4ml的正十二烷进行萃取发酵，280rpm，30℃培养。每24h取样，离心收集有机相，-20℃保存。整个发酵过程维持3-5天。 

3.样品处理 

离心收集的有机相包括紫穗槐二烯。按有机相∶乙酸乙酯＝1∶700的比例加入乙酸乙酯混溶，直接用GC-MS检测紫穗槐二烯。包含ADS突变体编码基因的重组细胞的紫穗槐二烯产量显著高于野生型。 

进一步地，为了提高紫穗槐二烯的发酵产量，将ADS的上游MVA/MEP途径中的酶(包括异戊烯二磷酸Δ-异构酶(编码基因参见GenBank：EU896069)、2C-甲基赤藓醇-2，4-焦磷酸合酶(编码基因参见GenBank：EU896619)、4-磷酸-2C-甲基赤藓醇4-胞苷磷酸合酶(编码基因参见GenBank：EU896613.1)、1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸合酶(编码基因参见GenBank：EU905209)、香叶基转移酶 (编码基因参见GenBank：EU905203))的编码基因装入上述重组载体的多克隆位点。这些酶的表达可有效地提高胞内FPP的产生量，从而提高ADS催化FPP环化形成紫穗槐二烯的量。 

进一步地，将青蒿酸合成酶CYP71AV1(编码基因参见GenBank：DQ268763)及细胞色素P450还原酶CPR(编码基因参见GenBank：DQ318192)一起装入上述重组载体的多克隆位点，如上转化细胞和培养转化子，从而高效地产生青蒿酸(存在于有机相中)。 

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。 

一种酶活性提高的青蒿紫穗槐二烯合酶突变体及其应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。