专利摘要

本发明提供一种基于多形汉逊酵母的白桦脂酸生物合成途径筛选方法，主要是运用低能离子注入介导白桦树基因组DNA转化酵母菌，为利用“逆向思维”高效解析白桦脂酸生物合成途径提供了材料，为解决白桦脂酸来源短缺、保护落叶类乔木植物白桦树资源及其可持续发展提供新途径。

权利要求

1.一种基于多形汉逊酵母的白桦脂酸生物合成途径筛选方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)运用低能离子注入介导白桦树基因组DNA转化多形汉逊酵母出发菌株；

2)将经过步骤1)处理后的出发菌株涂布于YPD固体培养基，挑取经YPD固体培养基培养所得的菌落于YPD液体培养基中进行发酵，发酵后离心提取发酵液，采用薄层层析对发酵液进行白桦脂酸定性分析；所述薄层层析采用的展开剂为石油醚-苯-乙酸乙脂-冰醋酸混合物，石油醚∶苯∶乙酸乙脂∶冰醋酸的体积比为10∶20∶6∶0.5；

3)挑取发酵液中存在白桦脂酸的对应菌落于YPD液体培养基中进行发酵，利用高效液相色谱对发酵所得发酵液进行白桦脂酸定量分析。

2.根据权利要求1所述一种基于多形汉逊酵母的白桦脂酸生物合成途径筛选方法，其特征在于：所述出发菌株为多形汉逊酵母(H.polymorpha)DL-1。

3.根据权利要求1所述一种基于多形汉逊酵母的白桦脂酸生物合成途径筛选方法，其特征在于：所述低能离子注入的条件为：注入离子为N+，注入剂量为1.5×1016～2.5×1016ions/cm2，注入能量为15～25KeV，脉冲时间为5～10s，间隔时间为5～10s，真空度为1.5～2.0×10-3Pa。

4.根据权利要求1所述一种基于多形汉逊酵母的白桦脂酸生物合成途径筛选方法，其特征在于：所述步骤2)及步骤3)中，发酵包括以下步骤：于37℃、转速为110r/min条件下培养60～96h。

5.根据权利要求4所述一种基于多形汉逊酵母的白桦脂酸生物合成途径筛选方法，其特征在于：所述发酵的过程中流加0.5％的葡萄糖水溶液，流速为12.5mL/h。

6.根据权利要求1所述一种基于多形汉逊酵母的白桦脂酸生物合成途径筛选方法，其特征在于：所述高效液相色谱的上样样品制备方法为：将发酵液浓缩后利用甲醇进行萃取，将萃取液用滤膜过滤。

说明书

技术领域

本发明属于超远缘遗传转化技术领域，具体涉及利用离子注入介导白桦树基因组DNA在酵母菌中的遗传转化。

背景技术

白桦脂酸(betulinic acid，BA)为五环三萜酸化合物，存在于白桦树(Betulapubescens)、桃金娘科赤楠(Syzygium formosanum)、滇刺枣(Ziziphus mauritiana)等植物中。近年来的研究表明，BA具有许多药理活性，如抗肿瘤、抗炎、抗菌、抗HIV、抗疟疾等，特别在抗肿瘤方面，如针对黑色素瘤，表现突出。因BA具有众多的药理活性，加之其较高的安全性，美国癌症研究所已将开发白桦脂酸列入快速研发规划项目，使得BA备受关注。

目前BA主要是从白桦树皮中提取，但BA在白桦树中含量很低，提取工艺复杂，纯化困难。因此，从植物中提取BA目前还没有潜在的工业化价值，其往往作为提取白桦脂醇的一种副产品。因此，迫切需要寻求及扩大白桦脂酸新药源途经以满足临床上对其日益增长的需求。

分离天然产物生物合成基因，并借助转基因酵母细胞工厂进行发酵，已经成为大量而经济地合成植物天然产物的有效途径。然而萜类化合物在植物体内不仅拥有复杂的合成途径，且同一途径中某一关键限速酶有若干个同工酶，加上部分关键代谢酶基因处于低表达水平，很难利用传统分子生物学方法快速解析较佳的天然产物生物合成途径。例如，章焰生课题组利用白桦脂酸合成的关键细胞色素氧化酶基因(BPLO基因)，在微生物酵母细胞中人工重建了白桦脂酸生物合成途径，构建的酵母工程菌利用常用培养基即能合成植物来源化合物白桦脂酸，但产量仅为0.16mg/L。

尽管Lü等通过Ar+和N+注入介导麻黄基因组DNA转化酵母，获得遗传稳定的酵母工程菌，麻黄碱和伪麻黄碱产量分别为18.85mg/L和4.11mg/L。同时，Jin等利用低能离子注入介导甘草基因组DNA转化酵母，获得了遗传稳定的酵母工程菌，其五环三萜苷类物质甘草酸的最高产量达114.49mg/L。但是，在利用低能离子注入介导的超远缘遗传转化改造酵母生物合成白桦脂酸的方面，国内外目前尚未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于多形汉逊酵母的白桦脂酸生物合成途径筛选方法。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

1)运用低能离子注入介导白桦树基因组DNA转化多形汉逊酵母出发菌株；

2)将经过步骤1)处理后的出发菌株涂布于YPD固体培养基进行培养，挑取经YPD固体培养基培养所得的菌落于YPD液体培养基中进行发酵，发酵后离心提取发酵液，采用薄层层析对发酵液进行白桦脂酸定性分析；

3)挑取发酵液中存在白桦脂酸的对应菌落于YPD液体培养基中进行发酵，利用高效液相色谱对发酵所得发酵液进行白桦脂酸定量分析。

所述出发菌株为多形汉逊酵母H.polymorpha DL-1(来源为ATCC No.26012)。

所述低能离子束注入的条件为：注入离子为N+，注入剂量为1.5×1016～2.5×1016ions/cm2，注入能量为15～25KeV，脉冲时间为5～10s，间隔时间为5～10s，真空度为1.5～2.0×10-3Pa。

所述发酵包括以下步骤：于37℃、转速为200r/min条件下培养60～96h。

所述发酵的过程中流加0.5％的葡萄糖水溶液，流速为12.5mL/h。

所述薄层层析采用的展开剂为石油醚-苯-乙酸乙脂-冰醋酸混合物，石油醚∶苯∶乙酸乙脂∶冰醋酸的体积比为10∶20∶6∶0.5。

所述高效液相色谱的上样样品制备方法为：将发酵液浓缩后利用甲醇进行萃取，将萃取液用滤膜过滤。

本发明的有益效果体现在：

本发明实现了低能离子注入技术介导白桦树基因组DNA在多形汉逊酵母出发菌株中随机遗传转化，获得的产白桦脂酸多形汉逊酵母重组菌株保留了出发菌株易于高密度发酵的优点，且发酵产物中的白桦脂酸易于提取分离，为高效解析白桦脂酸生物合成途径提供了新的有效的材料。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作详细说明。

本发明以H.polymorpha DL-1为出发菌株(来源为ATCC No.26012)，利用低能离子辐照注入介导白桦树基因组DNA随机遗传转化多形汉逊酵母，通过定性、定量筛选获得产白桦脂酸的重组酵母菌株，并进行遗传稳定性和相应的发酵试验，从而为高效解析白桦脂酸生物合成途径提供遗传材料。

(一)培养基

YPD液体培养基的组成为：葡萄糖20.0g/L、蛋白胨20.0g/L，及酵母膏10.0g/L，pH为6.5；

YPD固体培养基的组成为：葡萄糖20.0g/L、蛋白胨20.0g/L、酵母膏10.0g/L，及琼脂20g/L，pH为6.5。

(二)筛选所依据的方法

(1)薄层层析(TLC)定性检测：分别将5μL发酵浓缩液和白桦脂酸标准品在GF254硅胶薄层板上点样，在展开剂石油醚(60～90℃)-苯-乙酸乙脂-冰醋酸(10∶20∶6∶0.5)中展开，结束后在紫外灯下观察，记录斑点。

(2)HPLC定量检测：取800mL发酵液，在100℃下浓缩至5mL(即得发酵浓缩液)后，加入10mL甲醇萃取，过滤萃取液，滤液以0.45μm微孔滤膜过滤后用于HPLC法测定白桦脂酸的含量；HPLC色谱条件为：色谱柱：化学键合型十八烷基柱(SciC18色谱柱)；Pump：K-1001；Detecter：K-1501；流动相：乙腈-水(92∶8)；柱温：25℃。

(三)重组以及筛选流程

1)提取白桦树基因组DNA：取适量陕西产(西安市西安工业大学校内)白桦树新鲜嫩叶片5g，用液氮迅速研磨至粉末后，装入50mL的离心管中；接着迅速加入3mL预热的CTAB提取液(2％CTAB，1.4M NaCl，0.02M EDTA，0.1M Tris-HCl，0.2％巯基乙醇，pH＝8.0)至所述离心管中；之后放入65℃水浴锅中，保温60min后(期间轻摇5次)，加入4mL氯仿：异戊醇(24：1)，轻摇混匀至乳白色后，置于4℃、11000rpm离心15min；取上清液并加入0.6倍体积的异丙醇，摇匀；后置于4℃、11000rpm离心10min，弃上清，沉淀用70％乙醇漂洗2次，放置超净工作台中吹干，得白桦树基因组DNA。最后加入1mL Tris-EDTA(pH8.0)缓冲液溶解白桦树基因组DNA，并用Nanodrop 2000计测其浓度，最后放入4℃冰箱保存。

2)低能N+离子注入菌膜：将保藏的出发菌株(H.polymorpha DL-1)于37℃、YPD固体培养基上划线活化24h后，挑取新鲜菌落接种到YPD液体培养基中，于37℃、110r/min转速条件下培养16h得菌液A，取适量菌液A用无菌水稀释至浓度为1.0×107CFU/mL得菌体稀释液，取0.1mL菌体稀释液均匀涂布于直径90mm的无菌平皿中央，无菌风吹干制成菌膜，然后置于离子束注入机的真空靶室中进行低能N+注入，注入能量为20Kev，注入剂量为2.0×1016ions/cm2，脉冲时间为5s，间隔时间为10s，真空度为1.5×10-3Pa。

3)固体培养：经过步骤2)后，用2mL含有白桦树基因组DNA的Tris-EDTA缓冲液(pH8.0)浸泡经低能N+离子注入后的菌膜，于37℃温育2h后，用移液器进行洗脱，将菌全部洗脱下来得菌液B，取0.1mL菌液B均匀涂布于YPD固体培养基后于37℃培养72h。

4)重组菌株初筛：将YPD固体培养基上生长的菌落转接到试管中进行液体培养(37℃、110r/min培养96h，YPD液体培养基)，于10000r/min离心10min收集发酵液进行浓缩，然后再进行定性检测。

5)定量检测：将初筛重组菌株接种于含10mL YPD液体培养基的试管中，并于37℃、110r/min下培养12h得种子培养液，以体积为5％的接种量将种子培养液接种于含100mLYPD液体培养基的250mL三角瓶中，然后于110r/min、37℃下培养90h，于10000r/min离心10min，离心得到的菌体用无菌蒸馏水冲洗两次后于85℃烘干至恒重进行称重，离心得到的上清液用于产物定量检测。

TLC定性鉴定：初筛重组菌株浓缩发酵液在与白桦脂酸标准品相对应的位置上出现同样斑点，而阴性对照酵母菌株(出发菌株)的浓缩发酵液在该位置处未出现斑点，表明初筛的重组菌株发酵过程有新物质(白桦脂酸)合成。

HPLC法定量鉴定：分别将20μL的初筛重组菌株发酵浓缩液、阴性对照酵母菌株的浓缩发酵液及白桦脂酸标准品进行HPLC分析，结果显示，保留时间为17.10min处初筛重组菌株发酵浓缩液中出峰，与白桦脂酸标准品出峰的保留时间17.15基本一致，而阴性对照酵母菌株的浓缩发酵液在该处未出峰，表明初筛重组菌株具有生物合成白桦脂酸的能力，结合白桦脂酸标准曲线计算得出重组菌株的发酵液中的白桦脂酸含量。

(四)重组菌株的遗传稳定性

将重组菌株活化后接种于含200mL YPD液体培养基的三角瓶中进行培养(37℃、110r/min)，传代培养8代测定重组菌株的遗传稳定性。结果表明传代培养过程中重组菌株发酵液中白桦脂酸含量基本不变，传代培养8代后白桦脂酸含量为1.17mg/L，相比于第一代重组菌株的白桦脂酸含量(1.13mg/L)，降低了3.4％，说明重组菌株遗传稳定。

总之，本发明首次采用低能离子束注入介导白桦树基因组DNA在酵母菌中的随机转化技术，为利用“逆向思维”解析白桦脂酸生物合成关键酶提供了新材料，具有遗传操作简便、转化重组效率高、产物分离提取简单等优点。同时为解决白桦脂酸来源短缺、保护落叶类乔木植物白桦树资源及其可持续发展提供潜在途径。

基于多形汉逊酵母的白桦脂酸生物合成途径筛选方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。