专利摘要

本发明的目的在于提供具有稳定的二级结构的肽等。本发明提供一种具有通过交联结构而得到稳定的二级结构的肽，所述肽包含至少一组用以下式（I）表示的特殊氨基酸与侧链具有硫烷基的氨基酸，通过所述特殊氨基酸残基的侧链与所述硫烷基之间的硫醚键而形成有交联结构。式中，（A）表示单键或者主链的原子数为1～10的连接基，（B）表示含至少一个π键的基团，（C）表示氢原子或者可以被取代基取代的烷基，X表示能够通过基于硫烷基的取代反应而被取代的基团。

权利要求

1.一种肽，该肽具有通过交联结构而得到稳定的二级结构，

所述肽包含至少一组用以下式（I）表示的特殊氨基酸与侧链具有硫烷基的氨基酸，

所述肽通过所述特殊氨基酸残基的侧链与所述硫烷基之间的硫醚键而形成有交联结构，

[化学式1]

式中，（A）表示单键或者主链的原子数为1～10的连接基，（B）表示含至少一个π键的基团，（C）表示氢原子或者可以被取代基取代的烷基，X表示能够通过基于硫烷基的取代反应而被取代的基团。

2.如权利要求1所述的肽，所述式（I）中，

（A）从由单键；可以被取代基取代的、碳原子数为1～10的亚烃基、碳原子数为2～10的亚烯基或者碳原子数为2～10的亚炔基；主链的1～2个碳原子被氧原子、氮原子或者硫原子取代的、可以被取代基取代的、主链的原子数为10以下的亚烃基、亚烯基或者亚炔基构成的组中选择，

（B）从由-C≡C-、-C=C-、-Ar-、-Ar-Ar-、-Ar-C≡C-、-Ar-C=C-、-NHC(O)-、-C(O)-、-Ar-NHC(O)-、-Ar-C(O)-构成的组中选择，

（C）从由氢原子、甲基、乙基、丙基、丁基以及戊基构成的组中选择，

X从由Cl、Br、I、-OSO₂Me、甲苯磺酰基、硝基苯磺酰基、-OSO₂-Ar-R构成的组中选择，在所述的-OSO₂-Ar-R式中，R表示从由CH₃、NO₂、CF₃以及H构成的组中选择的基团。

3.如权利要求1或2所述的肽，所述式（I）的特殊氨基酸用以下式（II）～（IV）的任意个表示，

[化学式2]

式中，m表示从1～10中选择的整数，从由Cl、Br、I、-OSO₂Me、甲苯磺酰基、硝基苯磺酰基、-OSO₂-Ar-R构成的组中选择，在所述的-OSO₂-Ar-R式中，R表示从由CH₃、NO₂、CF₃以及H构成的组中选择的基团。

4.如权利要求1至3中任意一项所述的肽，所述的具有硫烷基的氨基酸从由半胱氨酸以及用以下式（V）和（VI）表示的半胱氨酸类似物构成的组中选择，

[化学式3]

5.如权利要求1至4中任意一项所述的肽，所述特殊氨基酸残基与所述的侧链具有硫烷基的氨基酸残基，在各组中，间隔2、3、6或10氨基酸残基而配置。

6.一种方法，制备具有通过交联结构而得到稳定的二级结构的肽，包括以下工序：

（i）通过翻译而合成分子内配置有至少一组侧链具有硫烷基的氨基酸以及用以下式（I）表示的特殊氨基酸的特殊肽；以及

（ii）在各所述组中，将所述硫烷基与式（I）的特殊氨基酸的侧链通过硫醚键合而形成交联结构，

[化学式4]

式中，（A）表示单键或者主链的原子数为1～10的连接基，（B）表示含至少一个π键的基团，（C）表示氢原子或者可以被取代基取代的烷基，X表示能够通过基于硫烷基的取代反应而被取代的基团。

7.如权利要求6所述的方法，所述的侧链具有硫烷基的氨基酸与式（I）的特殊氨基酸，在各组中，间隔2、3、6或10氨基酸残基而配置。

8.如权利要求6或7所述的方法，所述（i）的翻译合成工序包括：利用将式（I）的特殊氨基酸连接于tRNA而获得的氨基酰tRNA，翻译具有编码该特殊氨基酸的改变密码子的模板mRNA。

9.如权利要求8所述的方法，所述的侧链具有硫烷基的氨基酸是由改变密码子编码的特殊氨基酸，所述（i）的翻译合成工序包括：利用将式（I）的特殊氨基酸以及侧链具有硫烷基的该特殊氨基酸分别连接于tRNA而获得的氨基酰tRNA，翻译具有分别编码特殊氨基酸的改变密码子的模板mRNA。

10.如权利要求8或9所述的方法，所述氨基酰tRNA是通过利用具有酰化tRNA合成酶样活性的RNA酶，将特殊氨基酸连接于tRNA而获得的。

11.如权利要求6至10中任意一项所述的方法，用所述式（I）表示的特殊氨基酸，用以下式（II）～（IV）的任意个表示，

[化学式5]

12.如权利要求6至11中任意一项所述的方法，所述的具有硫烷基的氨基酸从由半胱氨酸以及用以下式（V）和（VI）表示的半胱氨酸类似物构成的组中选择，

[化学式6]

13.一种肽库，包含两种以上如权利要求1至5中任意一项所述的肽。

14.如权利要求13所述的肽库，各所述肽连接有编码该肽的mRNA。

15.一种方法，构建如权利要求13所述的肽库，包括以下工序：

（i）制备mRNA文库，该mRNA文库在编码随机氨基酸序列的RNA中包含至少一组决定侧链具有硫烷基的氨基酸的密码子以及决定由权利要求1所述的式（I）表示的特殊氨基酸的密码子，在各组中间隔2、3、6或10氨基酸单位而配置有决定侧链具有硫烷基的氨基酸的密码子以及决定式（I）的特殊氨基酸的密码子；

（ii）通过含有与所述特殊氨基酸连接的tRNA的无细胞翻译系统，翻译所述mRNA，获得在随机序列中配置有所述特殊氨基酸的肽的集合体；以及

（iii）在各肽中，使硫烷基与式（I）的特殊氨基酸的侧链键合而形成交联结构。

16.一种方法，构建如权利要求14所述的肽库，包括以下工序：

在如权利要求15所述的工序（i）中，进一步地，向mRNA的3'末端结合嘌呤霉素，获得嘌呤霉素结合mRNA文库；

在工序（ii）中，使所述嘌呤霉素结合mRNA文库在无细胞翻译系统中表达，获得在随机序列中配置有所述特殊氨基酸的肽-mRNA复合物；以及

进行工序（iii）。

17.如权利要求15或16所述的方法，决定式（I）的特殊氨基酸的改变密码子为AUG密码子，mRNA随机序列由NNC或NNU序列中的任意三联体的重复构成，所述NNC或NNU中的N表示A、U、G、C中的任意一个碱基。

18.一种用下式（I）表示的特殊氨基酸，

[化学式7]

式中，（A）表示单键或者主链的原子数为1～10的连接基，（B）表示含至少一个碳原子之间的双键的基团、含至少一个碳原子之间的三键的基团、或者含至少一个芳香环的基团，（C）表示氢原子或者可以具有碳原子数为1～3的取代基的烷基，X表示能够通过基于硫烷基的取代反应而被取代的基团。

19.一种方法，从如权利要求13或14所述的肽库选择与靶标蛋白结合的肽，包括以下工序：

（i）将肽库与靶标蛋白接触，进行温育；以及

（ii）选择与靶标蛋白结合的肽分子。

20.一种方法，从如权利要求13或14所述的肽库选择对靶标蛋白的分子间相互作用具有抑制活性的肽，包括：

（甲）一次筛选，包括如权利要求19所述的工序（i）以及（ii），选择与靶标蛋白结合的肽；以及

（乙）二次筛选，对于通过一次筛选而选择的肽的对靶标蛋白的分子间相互作用的抑制活性，进行评价，决定所述肽是对靶标蛋白的分子间相互作用具有抑制活性的肽。

21.一种方法，制造与靶标蛋白结合的肽，包括以下工序：

（i）将如权利要求14所述的肽库与靶标蛋白接触，进行温育；

（ii）选择与靶标蛋白结合的肽-mRNA复合物；

（iii）扩增所选择的肽-mRNA复合物的mRNA，获得肽-mRNA复合物；

（iv）将工序（i）～（iii）重复一次以上，浓缩亲和性高的肽-mRNA复合物；以及

（v）从通过工序（iv）浓缩的肽-mRNA复合物的mRNA，表达肽。

22.如权利要求19至20中任意一项所述的方法，靶标蛋白是抑制细胞凋亡的分子。

说明书

技术领域

本发明涉及一种固定了通过导入特殊氨基酸而诱导的二级结构的肽分子、其合成、构建由这种肽分子的集合体构成的文库的方法、构建的文库、以及从文库筛选活性肽的方法等。

背景技术

具有α螺旋二级结构的肽作为抑制生物机体内分子间的相互作用的分子种，主要由以下三点受到关注。第一、由于被认为生物机体内分子间相互作用中借助α螺旋的较多，因此可以期待将其结构作为研究起点的抑制剂的研发；第二、由于形成了螺旋结构的肽具有细胞膜通透性的可能性较高，因此可以开展将细胞内蛋白作为靶标的肽药物发现（drug discovery）；第三、虽然是肽，但是由于获得有对蛋白酶的稳定性，因此可以期待具有比一般的肽更长的血中半衰期。但是，仅仅基于构成α螺旋的氨基酸序列信息而配置肽，多数情况不能获得这些优越性。原因在于，短链肽与具有三级结构的蛋白质不同，当旋转成螺旋结构的环境暴露于溶剂中时，受到其较大影响，因而不能维持结构。迄今为止尝试过多次这样一种方法，作为其解决方法，即，为了辅助形成该螺旋结构的特异性氢键，使适宜位置的氨基酸侧键之间通过共价键交联，由此即使在水溶液中，也能够使螺旋结构维持或固定。然而，这种方法的多数对整合了人工氨基酸的肽链利用化学催化剂形成共价键，因此包括肽合成的整个工程都依赖于化学合成。因此，当对于固定了α螺旋二级结构的特殊肽要求生理活性时，至今为止多数通过以下方法发现药物候选肽，即基于已知蛋白质的α螺旋部位的序列进行设计或者构建多样性低的集中库，评价每一个肽的活性。

另一方面，当获得与特定靶标结合的肽能分子时，广泛使用从随机肽库进行筛选的方法。最为一般的方法是利用噬菌体的肽展示方法，但是近年来变为使用不介由大肠杆菌等生物种而展示的肽展示方法。即，如利用翻译的核糖体展示法或mRNA展示法等各种体外（in vitro）展示法，能够在1个试管内短时间内构建和筛选多样性高的库，从这点来看较为优异。in vitro展示法，是指将表现型（phenotype）和编码其序列的遗传型（genotype）通过非共价键或共价键连接，由此将表现型展示成遗传型，利用试管内重建的复制体系可以浓缩、扩增（筛选（selection））活性种的系统。本系统的最大的特点在于不以原核、真核生命体为媒介，因此能够从具有非常高的多样性的文库中分离高活性生理物质。作为其典型的比较例，将大肠杆菌作为复制介质的噬菌体展示中，可以进行多样性10的7次方的文库的筛选，而在in vitro展示中，可以实现多样性达10的12次方的文库的探索。in vitro展示包括核糖体展示、mRNA展示、RaPID展示（未公开国际专利申请PCT/JP2010/68549）等。下面，将mRNA展示作为例子进行说明。

mRNA展示法是通过使多肽与作为其模板的mRNA结合，由此将多肽的氨基酸序列与核酸序列对应起来的技术。为此，通过适宜的连接子将作为酰化tRNA末端类似物的嘌呤霉素结合到mRNA的3′末端，使其参与翻译反应，由此嘌呤霉素进入到核糖体的A位，与延伸中的肽形成共价键，其结果，翻译产物的肽分子通过嘌呤霉素与mRNA连接（专利文献1～3、非专利文献1、2）。

如此，在in vitro展示中，虽然可以筛选具有高达10的12次方的多样性的肽库，但是由于利用生物体的功能而构建肽库，因此以前只能构建出仅由蛋白氨基酸构成的肽库。为了克服这种构成要素低的问题，只要能够通过将天然功能中没有的新功能整合到氨基酸结构中而构建具有能使通常不稳定的α螺旋二级结构稳定的新型骨架的肽库，进行筛选，则可以期待，能够获得表现出如天然存在的单纯的肽链实现不了的高抑制性、选择性、稳定性等功能的肽。

近年来，随着称为“遗传密码的扩张”或“遗传密码的重编程”的技术的发展，通过包括噬菌体展示的各种展示法，制造和筛选具有特殊的氨基酸的肽库，实际上已变为可能。

在遗传密码的扩张中，利用天然的翻译系统中不被用于指定氨基酸的终止密码子或人工四碱基密码子，向这些密码子分配特殊氨基酸，由此实现了包含特殊氨基酸的蛋白质、肽的合成。然而，终止密码子或可利用的四碱基密码子的数量有限，导致同时可利用的特殊氨基酸的数量存在上限（实质上3种以下）。

有关导入为了稳定α螺旋为目的的交联结构的肽的研究，也正在积极开展。目前，主要报道有以下的方法：基于酰胺键的方法、基于二硫化键的方法以及基于通过关环转换反应的烯烃形成的方法（非专利文献3）。可以通过导入这些共价键而诱导形成螺旋结构，但是通常存在生物体内稳定性问题。即，对于酰胺结构或二硫化结构而言，因蛋白酶或还原条件而容易断裂，因此不利于作为抑制剂而利用。克服了这一点的即为基于烯烃形成的方法，已知导入了该交联结构的肽在生物体内具有活性（非专利文献4）。目前，正在进行利用了基于该烯烃形成的交联结构的生理活性肽的研发。

然而，从已知的氨基酸序列通过化学合成而构建随机库之后，需要仔细研究没有失去生理活性的交联结构位置，因此其研发需要投入很大的精力。而且，基于如上述设计的随机库探索中，并没有得到的肽序列可能是最佳序列的确证。可惜的是，由于上述的基于烯烃形成的交联反应，使用化学催化剂，因此很难适用in vitro展示法。即，由于必须要在翻译反应所必需的核糖体或蛋白质、ATP等因子共存的状态下，进行烯烃形成，因此存在其反应效率低下的隐患，并且构建高品质文库较为困难。因此，为了对更宽范围的靶标，发现使α螺旋结构固定的生理活性特殊肽，必须要进行能够适用in vitro展示法的交联方法的研发。该交联方法需要在翻译系统条件下迅速且高选择性地进行交联反应，并且其形成的交联结构必须是生物体内不容易被分解的结构。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本专利第3683282号公报（国际公开WO98/16636）

专利文献2：日本专利第3683902号公报（国际公开WO98/31700）

专利文献3：日本专利第3692542号公报

非专利文献

非专利文献1：Roberts等,Proc.Natl.Acd.Sci.USA,1997,94,12297-12302

非专利文献2：Nemoto等,FEBS Lett.,1997,414,405-408

非专利文献3：Taylor,W.,J.,Baum,J.等,J.Am.Chem.Soc.,Vol.116,p.6431-6432(1994),Schultz,P.G.等,J.Am.Chem.Soc.,Vol.113,p.9391-9392(1991),Phelan,J.C.等,J.Am.Chem.Soc.,Vol.119,p.455-460(1197),Grubbs,R.H.,Blackwell,H.E.,Angew.Chem.Int.Ed.Vol.37,p.3281-3284(1998)

非专利文献4：Verdine,G.L.,Korsmeyer,S.J.等,Science,Vol305,p.1466-1470(2004)

发明内容

技术问题

本发明的目的在于，提供通过在翻译合成条件下向肽链翻译导入设计成自发形成交联结构的特殊氨基酸而获得的、具有稳定的二级结构的肽等。

技术方案

利用由本发明的发明者们近几年研发出的基于遗传密码重编程的特殊肽合成技术，合成具有能够与侧链含硫烷基(sulfanyl group)（-SH基）的半胱氨酸或者其类似物反应的侧链的特殊肽，翻译合成固定了目的二级结构的特殊肽（图1）。

详细说明本发明之前，在下面首先对成为背景技术的“遗传密码的重编程”进行简单介绍。

在生物机体的翻译中，mRNA的三个碱基的排列（triplet（三联体））作为一个密码子决定一个氨基酸，合成对应其排列的肽。此时，通过以下的两个阶段将密码子与氨基酸对应起来。（i）氨基酰tRNA合成酶（aminoacyl-tRNA synthetase：ARS）将相应的氨基酸结合于tRNA末端。（ii）tRNA的反密码子与对应的mRNA的密码子配对，由此沿着mRNA的信息而tRNA上的氨基酸发生聚合，合成肽。

这种密码子与反密码子之间的对应关系，几乎通用，64种密码子分别分配有20种氨基酸的任意一个。在下面示出标准遗传密码表。

[表1]

然而，利用重建型翻译系统和人工氨基酰化RNA酶结合弹性酶（flexizyme），可以重编程该遗传密码。

重建型翻译系统（reconstituted translation system），是指分别分离纯化如核糖体、翻译因子、tRNA、氨基酸以及ATP或GTP等能源等与蛋白质或肽的翻译合成有关的因子，进行混合的翻译系统。例如，作为利用大肠杆菌的核糖体的系统，记载于下面文献中的技术是公知的：H.F.Kung,B.Redfield,B.V.Treadwell,B.Eskin,C.Spears以及H.Weissbach(1977)"DNA-directed in vitro synthesis of beta-galactosidase.Studies with purified factors"The Journal of Biological Chemistry Vol.252,No.19,68896894；M.C.Gonza,C.Cunningham 以及R.M.Green(1985)"Isolation and point of action of a factor from Escherichia coli required to reconstruct translation"Proceeding of National Academy of Sciences of the United States of AmericaVol.82,1648-1652；M.Y.Pavlov以及M.Ehrenberg(1996)"Rate of translation of natural mRNAs in an optimized in Vitro system"Archives of Biochemistry and Biophysics Vol.328,No.1,9-16；Y.Shimizu,A.Inoue,Y.Tomari,T.Suzuki,T.Yokogawa,K.Nishikawa 以及T.Ueda(2001)"Cell-free translation reconstituted with purified components"Nature Biotechnology Vol.19,No.8,751-755；H.Ohashi,Y.Shimizu,B.W.Ying以及T.Ueda(2007)“Efficient protein selection based on ribosome display system with purified components”Biochemical and Biophysical Research Communications Vol.352,No.1,270-276。

另一方面，结合弹性酶（flexizyme），是能够在任意的tRNA上连接（酰化）任意的氨基酸或羟基酸的人工RNA酶（具有酰化tRNA合成酶样活性的RNA酶）。例如，记载于以下的文献中的酶是公知的：H.Murakami,H.Saito 以及H.Suga,(2003),Chemistry&Biology,Vol.10,655-662；H.Murakami,D.Kourouklis以及H.Suga,(2003),Chemistry&Biology,Vol.10,1077-1084；H.Murakami,A.Ohta,H.Ashigai,H.Suga(2006)Nature Methods3,357-359"The flexizyme system:a highly flexible tRNA aminoacylation tool for the synthesis of nonnatural peptides"；N.Niwa,Y.Yamagishi,H.Murakami,H.Suga(2009)Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters19,3892-3894"A flexizyme that selectively charges amino acids activated by a water-friendly leaving group"；以及WO2007/066627“多功能酰化酶及其用途”。结合弹性酶还以原型结合弹性酶（Fx）以及从原型结合弹性酶改变的二硝基苄结合弹性酶（dinitrobenzyl Flexizyme：dFx）、增强型结合弹性酶（enhanced Flexizyme：eFx）、氨基结合弹性酶（aminoflexizyme）等名称被人们知晓。

或者，还可以使用基于化学方法的氨基酰化等其他方法，作为能够在任意的tRNA上连接任意的氨基酸的方法的一种变形方法。

在遗传密码的重编程中，利用根据目的自由取舍翻译系统的构成因子并仅重组需要的成分而组建出的翻译系统。例如，如果重建去除了特定的氨基酸的翻译系统，则对应该氨基酸的密码子成为空白密码子。接着，利用结合弹性酶（或者利用化学反应的氨基酰化（chemical aminoacylation），或者利用突变型蛋白酶的氨基酰化），将特殊氨基酸连接于具有与该空白密码子互补的反密码子的tRNA，加上该氨基酸进行翻译。据此，特殊氨基酸通过该密码子而被编码，从而通过翻译而产生代替去除的氨基酸而导入了特殊氨基酸的肽。

作为本发明的一种非限定性实施方式，通过遗传密码的重编程技术，例如合成侧链具有炔丙基氯（propargyl chloride）结构的特殊肽。此时，如果在肽中从具有上述侧链结构的残基的位置夹着适宜个数的残基而配置半胱氨酸残基，则翻译后因其硫烷基而在炔丙基位上自发进行取代反应，肽侧链之间通过硫醚（thioether）键形成交联结构。即，通过向氨基酸内整合一组能够形成键的结构，即作为亲电子试剂的炔丙基氯结构与作为亲核试剂的硫烷基，能够在其之间形成键而构建交联结构。该交联结构辅助成为螺旋形成的键的位置特异性氢键而诱导出螺旋结构，给予肽期望的二级结构。这种可形成键的分子结构组不限于炔丙基氯结构与半胱氨酸。在后面详细说明。

进一步地，本发明提供一种利用上述技术而构建肽库，从该肽库获得生物机体内分子间相互作用的抑制剂的技术。

本发明的要点如下。

〔1〕一种肽，该肽具有通过交联结构而得到稳定的二级结构，

所述肽包含至少一组由下述式（I）表示的特殊氨基酸与侧链具有硫烷基的氨基酸，

[化学式1]

〔式中，（A）表示单键或者主链的原子数为1～10的连接基，（B）表示含至少一个π键的基团，（C）表示氢原子或者可以被取代基取代的烷基，X表示能够通过基于硫烷基的取代反应而被取代的基团。〕

所述肽通过所述特殊氨基酸残基的侧链与所述硫烷基之间的硫醚键而形成有交联结构。

〔2〕如上述〔1〕所述的肽，所述式（I）中，

（A）从由单键；可以被取代基取代的、碳原子数为1～10的亚烃基、碳原子数为2～10的亚烯基或者碳原子数为2～10的亚炔基；主链的1～2个碳原子被氧原子、氮原子或者硫原子取代的、可以被取代基取代的、主链的原子数为10以下的亚烃基、亚烯基或者亚炔基构成的组中选择，

（B）从由-C≡C-、-C=C-、-Ar-、-Ar-Ar-、-Ar-C≡C-、-Ar-C=C-、-NHC(O)-、-C(O)-、-Ar-NHC(O)-、-Ar-C(O)-构成的组中选择，

（C）从由氢原子、甲基、乙基、丙基、丁基以及戊基构成的组中选择，X从由Cl、Br、I、-OSO₂Me、甲苯磺酰基（tosyl）、硝基苯磺酰基（nitrobenzenesulfonyl：Nosyl）、-OSO₂-Ar-R（R表示从由CH₃、NO₂、CF₃以及H构成的组中选择的基团。）构成的组中选择。

〔3〕如上述〔1〕或〔2〕所述的肽，所述式（I）的特殊氨基酸由以下式（II）～（IV）的任意个表示，

[化学式2]

〔式中，m表示从1～10中选择的整数，从由Cl、Br、I、-OSO₂Me、甲苯磺酰基、硝基苯磺酰基、-OSO₂-Ar-R（R表示从由CH₃、NO₂、CF₃以及H构成的组中选择的基团。）构成的组中选择。〕

〔4〕如上述〔1〕至〔3〕中任意一项所述的肽，所述的具有硫烷基的氨基酸从由半胱氨酸以及用以下式（V）和（VI）表示的半胱氨酸类似物构成的组中选择，

[化学式3]

〔5〕如上述〔1〕至〔4〕中任意一项所述的肽，所述特殊氨基酸残基与所述的侧链具有硫烷基的氨基酸残基，在各组中，间隔2、3、6或10氨基酸残基而配置。

〔6〕一种方法，制备具有通过交联结构而得到稳定的二级结构的肽，包括以下工序：

（i）通过翻译而合成分子内配置有至少一组侧链具有硫烷基的氨基酸以及由以下式（I）

[化学式4]

〔式中，（A）表示单键或者主链的原子数为1～10的连接基，（B）表示含至少一个π键的基团，（C）表示氢原子或者可以被取代基取代的烷基，X表示能够通过基于硫烷基的取代反应而被取代的基团。〕表示的特殊氨基酸的特殊肽；以及

（ii）在各所述组中，将所述硫烷基与式（I）的特殊氨基酸的侧链通过硫醚键合而形成交联结构。

〔7〕如上述〔6〕所述的方法，所述的侧链具有硫烷基的氨基酸与式（I）的特殊氨基酸，在各组中，间隔2、3、6或10氨基酸残基而被配置。

〔8〕如上述〔6〕或〔7〕所述的方法，所述（i）的翻译合成工序包括：利用将式（I）的特殊氨基酸连接于tRNA而获得的氨基酰tRNA，翻译具有编码该特殊氨基酸的改变密码子的模板mRNA。

〔9〕如上述〔8〕所述的方法，所述的侧链具有硫烷基的氨基酸是由改变密码子编码的特殊氨基酸，所述（i）的翻译合成工序包括：利用将式（I）的特殊氨基酸以及侧链具有硫烷基的该特殊氨基酸分别连接于tRNA而获得的氨基酰tRNA，翻译具有分别编码特殊氨基酸的改变密码子的模板mRNA。

〔10〕如上述〔8〕或〔9〕所述的方法，所述氨基酰tRNA是通过利用具有酰化tRNA合成酶样活性的RNA酶，将特殊氨基酸连接于tRNA而获得的。

〔11〕如上述〔6〕至〔10〕中任意一项所述的方法，用所述式（I）表示的特殊氨基酸，由以下式（II）～（IV）的任意个表示，

[化学式5]

〔12〕如上述〔6〕至〔11〕中任意一项所述的方法，所述的具有硫烷基的氨基酸从由半胱氨酸以及用以下式（V）和（VI）表示的半胱氨酸类似物构成的组中选择，

[化学式6]

〔13〕一种肽库，包含两种以上如上述〔1〕至〔5〕中任意一项所述的肽。

〔14〕如上述〔13〕所述的肽库，各所述肽连接有编码其的mRNA。

〔15〕一种方法，构建如上述〔13〕所述的肽库，包括以下工序：

（i）制备mRNA文库，该mRNA文库在编码随机氨基酸序列的RNA中包含至少一组决定侧链具有硫烷基的氨基酸的密码子以及决定由上述〔1〕所述的式（I）表示的特殊氨基酸的密码子，在各组中间隔2、3、6或10氨基酸单位而配置有决定侧链具有硫烷基的氨基酸的密码子以及决定式（I）的特殊氨基酸的密码子；

（ii）通过含有与所述特殊氨基酸连接的tRNA的无细胞翻译系统，翻译所述mRNA，获得在随机序列中配置有所述特殊氨基酸的肽的集合体；以及

（iii）在各肽中，使硫烷基与式（I）的特殊氨基酸的侧链键合而形成交联结构。

〔16〕一种方法，构建如上述〔14〕所述的肽库，包括以下工序：

在如上述〔15〕所述的工序（i）中，进一步地，向mRNA的3'末端结合嘌呤霉素，获得嘌呤霉素结合mRNA文库；

在工序（ii）中，使所述嘌呤霉素结合mRNA文库在无细胞翻译系统中表达，获得在随机序列中配置有所述特殊氨基酸的肽-mRNA复合物；以及

进行工序（iii）。

〔17〕如上述〔15〕或〔16〕所述的方法，决定式（I）的特殊氨基酸的改变密码子为AUG密码子，mRNA随机序列由NNC或NNU序列（N表示A、U、G、C中的任意一个碱基）中的任意三联体的重复构成。

〔18〕一种由下式（I）表示的特殊氨基酸，

[化学式7]

〔式中，（A）表示单键或者主链的原子数为1～10的连接基，（B）表示含至少一个碳原子之间的双键的基团、含至少一个碳原子之间的三键的基团、或者含至少一个芳香环的基团，（C）表示氢原子或者可以具有碳原子数为1～3的取代基的烷基，X表示能够通过基于硫烷基的取代反应而被取代的基团。〕

〔19〕一种方法，从如上述〔13〕或〔14〕所述的肽库选择与靶标蛋白结合的肽，包括以下工序：

（i）将肽库与靶标蛋白接触，进行温育；以及

（ii）选择与靶标蛋白结合的肽分子。

〔20〕一种方法，从如上述〔13〕或〔14〕所述的肽库选择对靶标蛋白的分子间相互作用具有抑制活性的肽，包括：

（甲）一次筛选，包括如上述〔19〕所述的工序（i）以及（ii），选择与靶标蛋白结合的肽；以及

（乙）二次筛选，对于通过一次筛选而选择的肽的对靶标蛋白的分子间相互作用的抑制活性，进行评价，决定所述肽是对靶标蛋白的分子间相互作用具有抑制活性的肽。

〔21〕一种方法，制造与靶标蛋白结合的肽，包括以下工序：

（i）将如上述〔14〕所述的肽库与靶标蛋白接触，进行温育；

（ii）选择与靶标蛋白结合的肽-mRNA复合物；

（iii）扩增所选择的肽-mRNA复合物的mRNA，获得肽-mRNA复合物；

（iv）将工序（i）～（iii）重复一次以上，浓缩亲和性高的肽-mRNA复合物；以及

（v）从通过工序（iv）浓缩的肽-mRNA复合物的mRNA，表达肽。

〔22〕如上述〔19〕至〔20〕中任意一项所述的方法，靶标蛋白是抑制细胞凋亡的分子。

有益效果

通过本发明能够获得在期望的位置上导入交联结构而具有稳定的二级结构（例如α螺旋结构）的肽。由于这种肽具有稳定的二级结构，因此在通常的肽不能具有的性能，例如对靶标的高亲和性、高选择性、细胞膜通透性、稳定性方面优越。

并且，制备这种肽中的氨基酸序列随机化的肽库，使用该肽库进行筛选，由此能够获得对靶标蛋白等具有高亲和性的肽、或者抑制靶标蛋白的功能的肽等具有生理活性的肽。

进一步地，在肽库中，通过肽与编码其的核酸连接而适用in vitro展示法，由此能够使所选择的肽的浓缩以及扩增变得容易。

附图说明

图1示出固定了α螺旋二级结构的特殊肽的一种例。

图2示出交联结构前体的配置例。

图3示出选择性交联结构的形成。

图4概括示出利用了根据mRNA展示的交联肽库的筛选。

图5示出mRNA文库的构建例。

图6概括示出基于改变遗传密码表的翻译。

具体实施方式

导入了交联结构的肽

本发明提供一种具有因具备交联结构而得到稳定的二级结构的新型肽。在本说明书中，“二级结构”，是指通过肽主链中的氢键而形成的、比较狭小范围内观察到的特殊结构，指螺旋或β结构。本发明适用于α螺旋、3₁₀螺旋结构等螺旋结构的稳定化，但是也可以使其他二级结构稳定。

并且，在说明书中，使肽的“二级结构稳定”，是指二级结构以肽能够与靶标分子结合的程度得到稳定，该结合具有一定程度的重现性。

如果通过向肽导入交联结构而使二级结构稳定，则认为（i）会提高蛋白酶抗性、（ii）会提高膜通透性、（iii）会提高与靶标蛋白的亲和性。如在背景技术中所述的那样，迄今为止，通过酰胺键或二硫键使氨基酸侧链之间交联，试图稳定肽的二级结构。并且，还报道有基于利用化学催化剂的烯烃形成的交联反应。

然而，与迄今为止的方法不同，在本发明的肽中形成的交联结构是不容易在机体内分解的结构，具体而言，不会像酰胺键那样因酶而分解，也不会像二硫键那样被还原。

本发明的肽，包含至少一组由下述式（I）表示的特殊氨基酸以及侧链具有硫烷基(sulfanyl group)的氨基酸，通过特殊氨基酸的侧链与硫烷基之间的硫醚键而形成有交联结构。

[化学式8]

式中，（A）表示作为间隔（spacer）发挥作用的部位。（A）为单键或主链的原子数为1-10的连接基，只要后述的（B）CH₂-X与硫烷基之间的交联反应适宜进行，无论什么基团均可，但是例如可以举出，单键；可以被取代基取代的、碳原子数为1-10的亚烃基（alkylene group）、碳原子数为2-10的亚烯基（alkenylene group）、或者碳原子数为2-10的亚炔基（alkynylene group）；主链的1-2个碳原子被氧原子、氮原子或者硫原子取代的、可以被取代基取代的、主链的原子数为10以下的亚烃基、亚烯基或者亚炔基；等，但是不限于此。

其中，通过翻译合成法合成本发明的肽时，还具有（A）的存在有利于翻译反应进行的优点。

对于（B）而言，只要诱导基于硫烷基的X的取代反应，无论什么基团均可，但是例如可以是包含至少一个π键的基团。作为含π键的基团，可以是以下基团：可以被取代基取代的亚烃基、亚烯基或者亚炔基；可以被取代基取代的含有至少一个芳香环的基团；含有至少一个酮基或酰胺基的基团。对于（B）的碳原子数而言，当亚烃基、亚烯基、亚炔基时，例如可以是1-10个、2-8个、2-5个等。当含有至少一个芳香环的基团、含有至少一个酮基或酰胺基的基团时，主链的原子数例如可以是1-10个、2-8个、2-5个等。对于π键的位置而言，只要是使基于硫烷基的X的取代反应适宜进行，没有特别限定，但是优选地，构成π键的至少一个原子与可进行基于硫烷基的取代反应的碳原子结合，最为优选地，从X夹着CH₂基团而直接存在有π键。

作为（B）的例子，可以举出-C≡C-、-C=C-、-Ar-、-Ar-Ar-、-Ar-C≡C-、-Ar-C=C-、-NHC(O)-、-C(O)-、-Ar-NHC(O)-、-Ar-C(O)-，但不限于此。

以下，示出通过硫烷基与由式（I）表示的特殊氨基酸的侧链之间的硫醚键而形成的交联结构的例子。

[表2]

对于X而言，只要是通过基于硫烷基的取代反应而可脱离的原子或者基团，则没有特别限定，例如可以是Cl、Br、I、-OSO₂Me、-OSO₂-Ar-R（式中，R表示从由CH₃、NO₂、CF₃以及H构成的组中选择的基团）。

（C）表示氢原子或者可以被取代基取代的烷基。例如，可以是可以被取代基取代的甲基、乙基、丙基、丁基、戊基，也可以是支链。

在本说明书中，亚烯基是指主链中具有1-3个双键的亚烃基，亚炔基是指主链中具有1-3个三键的亚烃基。对于双键或者三键的位置而言，只要肽达到所期望的效果，没有特别限定。

在本说明书中，对于取代基，虽然没有特别限定，但是可以举出，卤原子、可以被取代的碳原子数为1-6的烷基、可以被取代的碳原子数为1-6的烷氧基、氰基、硝基、羟基、羧基、酰基、氨基、芳基、杂芳基、苯氧基、非芳族杂环基等。

对于本发明的肽，由于式（I）的特殊氨基酸的侧链部分与硫烷基之间形成键而形成交联结构，因此构成该肽的要素的氨基酸-残基作为一个单位，这些一组官能基团需要配置成存在于不同的构成要素的单位上，当形成交联结构时使二级结构得到稳定。为了便于说明，将这种构成要素的单位称为氨基酸单位。

成为亲电子试剂的氨基酸单位（相当于特殊氨基酸）和具有硫烷基的氨基酸单位优选地配置在用（i，i+3）、（i，i+4）、（i，i+7）或者（i，i+11）表示的位置。请参照图2。在此，i为0以上的任意整数，是从包含交联前体的肽的N末端的残基计数的氨基酸单位的位置。例如，i=3时，（i，i+4）表示，在从N末端（第0个）开始计算的3氨基酸单位的位置和7氨基酸单位的位置上配置成为亲电子试剂的氨基酸单位和具有硫烷基的氨基酸单位，形成交联结构。

当i+3或i+4时，如果是α螺旋则在1圈上发生交联，当i+7或i+11时，分别在2圈、3圈上发生交联。换言之，例如，优选地2、3、6或10氨基酸单位存在于形成交联结构的氨基酸单位之间。

位于形成交联结构的氨基酸单位之间以及前后的氨基酸单位，除了N末端的起始氨基酸，优选为分子内具有氨基（-NR₂）和羧基（-COOH）这两个官能团的化合物（氨基羧酸（aminocarboxylic acid））的任意的氨基酸，典型地是α-氨基羧酸，更优选地是蛋白氨基酸。对于成为亲电子试剂的氨基酸单位和具有硫烷基的氨基酸单位的配置而言，无论哪个配置在N末端侧还是C末端侧均可。

特殊氨基酸，是指与天然的翻译中所使用的20种蛋白氨基酸比，结构不同的所有的氨基酸，无论是人工合成的，还是自然界存在的均可。即，均可包括：蛋白氨基酸的侧链结构的一部分通过化学反应被改变或修饰的非蛋白氨基酸或人工氨基酸、D型氨基酸、N-甲基氨基酸（N-Methyl Amino Acid）、N-酰基氨基酸（N-acyl amino acid）、β-氨基酸、具有氨基酸骨架上的氨基或羧基被取代的结构的衍生物等。特殊肽，是指含一个以上特殊氨基酸的、两个以上氨基酸主要以肽键（也包括存在环状结构或酯键）结合的肽。

在本发明中，作为具有硫烷基的氨基酸的代表例，是半胱氨酸或者其类似物（半胱氨酸类似物（cysteine analog）），作为能够与其反应的成为亲电子试剂的氨基酸的代表例，是式（I）的特殊氨基酸。如后面所述，对于具有硫烷基的氨基酸而言，其为半胱氨酸时，可以使用标准密码子，但是为非蛋白氨基酸时，通过改变密码子而被编码。另一方面，式（I）的特殊氨基酸一般通过改变密码子而被编码。

并且，在本发明中，成为肽链N末端的起始氨基酸也不限于甲硫氨酸，可以是甲硫氨酸以外的任意的蛋白氨基酸或者任意的特殊氨基酸。例如，后述的实施例中，构建从通常的20种氨基酸去除甲硫氨酸的翻译系统，取而代之使用起始tRNA上连接Nα-乙酰化氨基酸的tRNA而开始翻译。这种N末端修饰可以说对于确保肽的稳定性是有效的。或者，构成交联前体的两个氨基酸的一个也可以是起始氨基酸（即，i为0时）。

关于配置构成交联前体的氨基酸的更为典型的方式，是将这些氨基酸均通过延伸反应而导入，配置到肽链内部的方式，即，i为1以上的整数的情况。并且，对于适用于本发明的肽的大小没有特别限制，但是本发明尤其适用于一般难以维持螺旋结构的25氨基酸残基以下的肽。

作为式（I）的化合物的具体例，例如，可以举出式（VII）的化合物：

[化学式9]

式中，m表示1至10的整数。作为式（VII）的化合物的具体例，可以举出m为1的化合物，该化合物例如可以利用Schollkopf的手性助剂（chiral auxiliary）而以高对映体过量制造。

并且，还可以举出式（VIII）的化合物：

[化学式10]

式中，m的定义与上述的相同。

并且，还可以举出式（IX）的化合物：

[化学式11]

式中，m的定义与上述的相同。作为式（IX）的化合物的具体例，可以举出m为1的下述式（X）的化合物。

[化学式12]

进一步地，作为式（I）中（C）为烷基链的化合物的具体例，可以举出对应式（VII）的式（XI），对应式（X）的式（XII）的化合物：

[化学式13]

另一方面，作为半胱氨酸类似物的具体例，例如可以举出式（V）或者式（VI）的化合物。

[化学式14]

式（V）、（VI）中，m的定义与上述的相同。

并且，还可以举出同型半胱氨酸或巯基正缬氨酸（mercaptonorvaline）等具有硫烷基的特殊氨基酸。

导入了交联结构的肽的制造方法

接着，对本发明的肽的制造方法进行说明。

本发明的肽可以利用基于化学合成的方法或者使用翻译合成系统的方法等各种公知的方法或基于这些方法的方法而制造。例如，使用化学合成方法时，可以通过液相合成、使用了Fmoc或Boc等保护基团的固相合成、组合了液相合成与固相法的混合法等各种方法，合成含式（I）的特殊氨基酸与具有硫烷基的氨基酸的肽。如果合成了肽，则如后面所述，无需使用酶等，式（I）的特殊氨基酸的侧链与硫烷基之间自发形成硫醚键，可以得到交联肽。

作为本发明的肽的制造方法的一种例，以下说明利用无细胞翻译合成系统而制造的方法。该方法利用由翻译合成的肽内所包含的特殊氨基酸参与的高选择性分子内反应，在肽侧链间形成共价键，构建交联结构，包括以下工序。

（i）通过翻译而合成至少在一个分子内配置有侧链具有硫烷基的氨基酸以及式（I）所表示的特殊氨基酸的组的、特殊肽；以及

（ii）所述各组中，将所述硫烷基和式（I）的特殊氨基酸的侧链通过硫醚键合形成交联结构。

将工序（i）称为翻译合成工序，将工序（ii）称为交联结构形成工序。

工序（i）的翻译合成工序中，通过翻译合成而获得以下两种氨基酸仅隔开适宜的氨基酸残基数而配置的肽：

（甲）侧链具有硫烷基的氨基酸，以及

（乙）式（I）所表示的特殊氨基酸。

以下，在工序（i）中所合成的特殊肽中，将含有由硫烷基以及能与其反应的特殊氨基酸的官能团构成的一组官能团的化学结构，称为交联前体。即，仅隔开适宜的氨基酸残基数而配置的、这些（甲）以及（乙）氨基酸的组，构成交联前体。

例如，请参照图2的模式图。在图2中，这些氨基酸的组，用配置在肽链内部的一组深黑色圆表示。并且，一个肽链所能包含的交联前体，不仅可以有一组，还可以配置多个交联前体。如果翻译合成了含多个交联前体的肽链，则在工序（ii）的交联结构形成工序中，可以形成多个交联结构。

式（I）的特殊氨基酸具有能够与亲核试剂官能基团的硫烷基（-SH）发生键形成反应的结构，作为能够形成用于交联的共价键的侧链结构。作为该反应的结果，工序（ii）的交联结构形成工序中，包含交联前体的肽变为形成有交联结构的肽。在本发明中，从交联前体形成交联结构，是在翻译合成条件下自动发生，因此不需要化学催化剂。

在无细胞翻译系统下进行工序（i）时，利用遗传密码重编程技术，通过在已知密码子中人为地分配特殊氨基酸而导入到肽链中。具体而言，制备具有编码特殊氨基酸的密码子的mRNA，通过将该mRNA在改变遗传密码表下进行翻译，可以获得在由被改变的密码子（改变密码子）指定的位置上被导入了特殊氨基酸的肽。

在本申请中，密码子是指改变密码子以及在天然的翻译中使用的标准密码子这两种密码子。改变密码子，是指通过遗传密码重编程消除了蛋白氨基酸的对应关系，与特殊氨基酸对应起来的密码子。特殊氨基酸只能通过改变密码子编码。

通过在如上所述合成的肽化合物中导入交联结构，合成螺旋肽化合物。用于形成交联结构的反应条件，可以根据官能团的组的种类而设定，但是一般在用于合成该肽化合物的无细胞翻译系统条件下，高选择性地进行反应。因此，不需要特别调整反应条件，能够自发形成键而获得交联肽化合物。

例如，请参照图3。通过甲酰甲硫氨酸(formyl methionine)开始翻译，通过延伸密码子被导入的各种氨基酸的组合合成以（i，i+4）的位置关系配置的肽链，其结果，仅由式（I）的特殊氨基酸X以及半胱氨酸C的组，通过硫醚键，形成交联结构。

同样地，在后述的实施例中，记载有通过翻译合成配置有包含配置在氨基酸侧链的炔丙基氯的特殊氨基酸和半胱氨酸的肽序列而获得的、包含交联前体的肽。示例性的方式中，翻译后，会自发进行向炔丙基氯位的基于硫烷基的取代反应，形成硫醚键而完成交联结构。

无细胞（in vitro）翻译系统

翻译系统是用于翻译合成肽的场所，是包括通常的方法以及试剂盒（物）这两者的概念。在本发明中所使用的无细胞翻译系统，优选利用进一步细分公知的重建型翻译系统，构建不纯物尽可能少的系统。比较现有的系统，对作为本发明可利用的试剂盒（物）的翻译系统的具体构成成分进行说明。

作为翻译系统的构成成分的具体例，包括核糖体、IF组、EF组、RF组、RRF、为了合成目的肽而所需的最低限度的天然氨基酸、tRNA、特异性ARS蛋白酶的配套组、用于翻译反应的能源等。

作为核糖体，可适宜利用从大肠杆菌分离纯化的核糖体。

蛋白质类使用翻译起始因子（例如，IF1、IF2、IF3）、翻译延伸因子（例如，EF-Tu、EF-Ts、EF-G）、翻译终止因子（例如，RF1、RF2、RF3、RRF）、用于能源再生的酶（例如，肌酸激酶（creatine kinase）、肌激酶（myokinase）、焦磷酸酶（pyrophosphatase）、二磷酸核苷酸激酶（nucleotide-diphosphatase kinase）。其中，翻译终止因子、用于能源再生的酶，可以根据需要而添加。为了进行从模板DNA的转录，有时还添加T7RNA聚合酶，但是事先向翻译系统加入转录的mRNA时，无需添加RNA聚合酶。

除此以外，可以与现有的系统同样地适宜使用：适宜的缓冲溶液、作为翻译反应的能源的NTP、磷酸肌酸（creatine phosphate）、用于活化核糖体、稳定RNA、稳定蛋白质的必要因子等。并且，在通常的翻译反应中，由于起始密码子AUG通过起始tRNA而决定N-甲酰甲硫氨酸（N-formyl-methionine），因此必须要有如10-甲酰-5,6,7,8-四氢叶酸（10-formyl-5,6,7,8-tetrahydroforlic acid）（Baggott等,1995）等甲酰供体（formyl donor），但是本发明中，通过特殊氨基酸开始翻译反应时，甲酰供体并不是必需的。根据同样的理由，甲硫氨酰-tRNA甲酰转移酶（methionyl-tRNA formyltransferase，MTF），也不是必需的。

在本发明所利用的翻译系统中，对于天然的蛋白氨基酸，可以与现有的系统一样地利用对应的天然tRNA以及ARS。作为天然tRNA的例子，举出集聚大肠杆菌进行破碎并且从破碎的大肠杆菌纯化tRNA分子（tRNA fraction）的混合物，也能购买到商业化产品。天然tRNA中的特定的A、U、C、G通过酶而被化学修饰。或者也可以使用具有试管内转录的天然序列的tRNA。

另一方面，对于特殊氨基酸，优选地利用不是天然tRNA的、作为正交tRNA（orthogonal tRNA）的tRNA转录产物的人工tRNA。人工tRNA可以通过以DNA为模板利用适宜的RNA聚合酶的体外（in vitro）转录反应而制备。这种人工tRNA中完全不存在化学修饰。

为了向翻译产物的肽导入特殊氨基酸，向翻译系统加入事先被特殊氨基酸酰化的正交tRNA。优选的方式中，被特殊氨基酸酰化的tRNA通过以下方法制备：在其他tRNA或ARS不存在的条件下，使用结合弹性酶（flexizyme），将特殊氨基酸结合于纯化的正交tRNA的3'末端。或者，也可以使用通过化学反应或酶反应，将特殊氨基酸结合于tRNA的tRNA。

肽库

在本说明书中，肽库是指包含2种以上的、导入有上述的交联结构的肽，换言之包含序列不同的2种以上的肽的文库。构成肽库的各个肽中，除了侧链具有硫烷基的氨基酸和用式（I）表示的特殊氨基酸以外的氨基酸，可以为任意氨基酸。因此，例如对于由25氨基酸残基构成的肽来说，仅包含一组具有硫烷基的氨基酸和由式（I）表示的特殊氨基酸时，即使只使用20种天然氨基酸，理论上也会存在20²³种，对于文库来说构成足够的大小。

本发明的肽库，由于通过交联而稳定二级结构，因此细胞膜通透性也优越，利用该肽库进行筛选，则可以获得对靶标具有高亲和性的肽或抑制靶蛋白的功能的肽等具有生理活性的肽、等有用的肽。

并且，作为一种肽库的方式，各个肽可以与编码其的mRNA连接。据此，成为表现型（肽的氨基酸序列）展示成遗传型（核酸序列）的肽库，能够应用in vitro展示。换言之，从遗传信息通过其翻译产物的肽而显示（展示）的展示库，选择肽。据此，导致文库中的各随机肽分子上添加有可通过生物学方法扩增以及读取的标签。

in vitro展示，是指利用无细胞翻译系统（又称为in vitro翻译系统）而合成的肽与遗传信息对应起来而展示的方法，公知的包括核糖体展示、mRNA展示、DNA展示等。并且，也可以利用RAPID展示（未公开）。无论哪一种展示法，都具有以下的机制：通过将记录在mRNA或DNA上的遗传信息与根据其遗传信息编码的肽连接，由此作为[遗传信息]-[翻译产物]的复合物而对应起来。在核糖体展示中，mRNA-核糖体-肽，这三者形成复合物。在mRNA展示以及RAPID展示中，形成mRNA-肽的复合物。在DNA展示中，形成DNA-肽的复合物。本发明中，可以利用任意的in vitro展示库。

肽库的制造方法

虽然对于具有随机序列的肽的文库的制造方法，没有特别限定，但是例如可以在无细胞翻译系统中，根据在编码肽的区域具有随机序列的模板核酸（mRNA或对应的DNA）进行翻译合成而获得。

因此，肽库的制造方法的一种方式，包括以下工序：

（i）制造mRNA文库，该mRNA文库在编码随机氨基酸序列的RNA中具有决定侧链具有硫烷基的氨基酸的密码子以及决定由式（I）表示的特殊氨基酸的密码子的组，在各组中，间隔2、3、6或10氨基酸单位而配置决定侧链具有硫烷基的氨基酸的密码子以及决定由式（I）表示的特殊氨基酸的密码子的位置；

（ii）利用包含连接了所述特殊氨基酸的tRNA的无细胞翻译系统翻译mRNA，获得在随机序列中配置有所述特殊氨基酸的肽的集合体；以及

（iii）在各肽中，将硫烷基与式（I）的特殊氨基酸的侧链键合而形成交联结构。

为了构建具有随机序列的交联肽库，在mRNA序列中的编码肽的区域中，配置由多个三联体重复构成的随机序列以及决定成为交联前体的氨基酸的密码子。例如，如图5所示，向侧链具有炔丙基氯结构的特殊氨基酸分配一个延伸密码子，从那里仅隔开适宜的氨基酸单位（如上所述，例如2、3、6或10氨基酸单位）的随机序列的密码子碱基的位置上导入半胱氨酸。

进一步地，构建除了被分配了这两个氨基酸的各密码子以及起始密码子以外配置了任意长度的随机序列的密码子碱基的模板mRNA。通过翻译该mRNA，通过位于半胱氨酸侧链的硫烷基的、与炔丙基氯的亲核取代反应而构建硫醚键，可以构建具有随机序列的交联肽库。

为了构建具有随机序列的文库，通常，为了使20种所有的蛋白氨基酸随机出现，将NNK（N表示从G、A、C或U中选择的任意碱基，K表示U或G）作为成为其模板的mRNA的密码子序列。但是，当将成为用于形成交联结构的亲电子试剂的式（I）的特殊氨基酸适用一个延伸密码子，例如AUG（AUG能够作为起始密码子以及延伸密码子这两种使用）时，用NNK文库构建肽库，则由于作为由NNK表示的密码子的一种、AUG会随机出现，因此肽库中会纳入有多个上述的特殊氨基酸。

因此，将AUG作为决定式（I）的特殊氨基酸的密码子时，当使用由NNC或者NNU（N表示A、U、G、C中任意一种碱基）构成的三联体重复，作为随机序列时，可以使AUG不会出现在随机序列中，能够只在随机序列中指定的位置上导入式（I）的特殊氨基酸。

使用NNU或者NNC随机序列的碱基的文库时，不会出现5种氨基酸（Met、Trp、Gln、Lys、Glu）。使这些氨基酸出现时的有利之处超过本特殊氨基酸配置在期望的位置以外时的不利之处时，在NNU、NNC基础上，也可以进一步使用NNK。

并且，将与使用NNU或者NNC时不会出现的氨基酸对应的密码子，还可以利用于将用于形成交联结构的其他特殊氨基酸、或者具有其他附加功能的特殊氨基酸导入到指定的位置。例如，在AUG基础上，还可以进一步利用UGG、CAG、AAG、GAG这四种密码子，将上述特殊氨基酸导入到指定的位置。

对于含NNU、NNC、NNK的mRNA而言，例如可以通过各种DNA合成装置而合成含NNT、NNC、NNK的DNA，转录该DNA而获得。

上述的示例性的一种方式中，式（I）的特殊氨基酸通过延伸用tRNA在肽链延伸反应中被导入。在此，起始tRNA与翻译开始位置的AUG密码子配对而将连接的氨基酸导入到肽的N-末端，但是除此以外的位置的AUG密码子与具有CAU密码子的延伸用tRNA配对。因此，AUG密码子通过两种tRNA而与两种氨基酸对应。本说明书中，与起始tRNA配对的AUG密码子称为起始AUG，而与延伸用tRNA配对的AUG密码子仅称作AUG。

本发明中，由根据目的而最优选的成分构成的无细胞翻译系统中，进一步利用与成为翻译模板的碱基序列对应的DNA或RNA分子。核酸序列中，与利用活细胞的蛋白表达系统相同地，在编码目的氨基酸序列的区域的基础上，可以根据使用的翻译系统而追加包含对翻译有利的碱基序列。例如，当使用利用大肠杆菌来源的核糖体的系统时，通过使起始密码子的上游包含Shine-Dalgarno(SD)序列或Epsilon序列等，提高翻译反应的效率。

在编码肽的区域的N末端上，配置起始密码子。起始密码子通常是三联体序列AUG。但是，在通过in vitro转录反应而合成的起始tRNA中，通过将任意序列作为反密码子序列，可以重编程起始密码子，从而在AUG密码子基础上，还可以利用其它碱基序列作为起始密码子。

为了in vitro展示，C末端侧包含用于将核酸分子与作为其翻译产物的肽连接的序列。例如，当利用使用了嘌呤霉素连接子（puromycin linker）的mRNA展示法时，可以将mRNA库中事先连接了嘌呤霉素连接子的mRNA加入到翻译系统中，由此形成mRNA-肽的复合物文库。为了使嘌呤霉素有效地结合到核糖体的A位点上，通常mRNA的3'末端侧与嘌呤霉素之间插入有连接子。

嘌呤霉素在核糖体上作为转肽反应的底物（substrate）（氨基酰tRNA类似物）起作用，通过结合于延伸肽的C末端，将mRNA与肽连接。mRNA展示法是一种通过in vitro翻译系统将mRNA与肽介由适当的连接子而连接，由此将基因型与表现型成一体的技术，只要能够达到这种目的，还可代替嘌呤霉素而利用包含其他的具有同样功能的物质的连接子，这属于本领域技术人员所知晓的范围。

并且，作为其他方法，还可利用不使用事先连接了连接子的mRNA，而通过in vitro翻译系统内的连接子和mRNA的杂交，形成mRNA-肽的复合物文库的方法。例如，通过将利用结合弹性酶而制备的苯丙氨酸连接子（Phenylalanine linker）（3'-苯丙氨酸-ACCA-PEG-[与mRNA库的3'末端区域互补的碱基序列]-5'）与mRNA库组成互补链，形成mRNA-肽的复合物文库（记载于未公开的申请PCT/JP2010/68549的“RAPID展示法”）。此时，编码mRNA的肽的区域的下游（3'末端区域）包含用于与连接子杂交的碱基序列。

在后述的具体实施例中，在肽的N末端配置起始AUG密码子，途中隔开相当于几个氨基酸残基的随机序列之后配置编码式（I）的特殊氨基酸的延伸AUG密码子（或者编码Cys的密码子UGC），进一步地继续配置适宜的氨基酸单位的随机序列之后配置编码Cys的密码子UGC（或者编码式（I）的特殊氨基酸的前述密码子），进一步地将随机序列继续配置到C末端。请参照图2以及图5。之后紧接着继续配置编码成为连接子的GlySerGlySerGlySer的密码子。

基于结合弹性酶的氨基酰化反应

结合弹性酶（flexizyme）是具有将具有期望的结构的氨基酸底物酰化到任意的tRNA的功能的RNA酶（ARS核酶）。结合弹性酶与天然的ARS蛋白酶不同，对各氨基酸以及各tRNA不具有特异性，可以实现使用原本应当连接的氨基酸以外的任意氨基酸的氨基酰化。具体而言，由于氨基酸的识别部位不具有α位的取代基，因此不限于L氨基酸，而羟基酸（α位为羟基）、α-N-甲氨基酸、α-N-酰基氨基酸、D-氨基酸等，也可作为底物。并且，如ε-N-乙酰赖氨酸或ε-N-甲基赖氨酸等翻译后被修饰的氨基酸，也可以作为底物。详细内容除了前述的关于结合弹性酶的文献外，还记载于Y.Goto,H.Suga(2009)"Translation initiation with initiator tRNA charged with exotic peptides"Journal of the American Chemical Society,Vol.131,No.14,5040-5041；WO2008/059823“N末端具有非天然骨架的多肽的翻译合成及其应用”；Goto等,ACS Chem.Biol.,2008,3,120-129；T.J.Kang,等,Chem.Biol.,2008,15,1166-1174"Expression of histone H3tails with combinatorial lysine modifications under the reprogrammed genetic code for the investigation on epigenetic markers"；WO2008/117833“环状肽化合物的合成方法”等。

本发明中，将使用结合弹性酶而用特殊氨基酸酰化的正交（Orthogonal）tRNA添加到无细胞翻译系统中，由此向肽序列导入特殊氨基酸。

正交tRNA，是指由于不能被翻译系统中内源性的天然由来的ARS（例如，来源于大肠杆菌的ARS蛋白酶）识别，因此在翻译系统内不会被氨基酰化，但是在核糖体上的肽合成反应中能有效地表达与mRNA的密码子配对而被决定的氨基酸的tRNA。作为正交tRNA，例如，可以使用来源于不同种的天然校正tRNA（suppressor tRNA）、或者人工构建的tRNA。如上所述，本发明中，为了导入特殊氨基酸，可优选使用的是人工转录产物的正交tRNA。

结合弹性酶具有将活化氨基酸酯为底物，识别氨基酸的反应位点的羰基以及氨基酸侧链或脱离基的芳香环、以及存在于tRNA3'末端的5'-RCC-3'序列部分（R为A或G），酰化到3'末端的腺苷的酶功能。结合弹性酶对tRNA的反密码子部分不具有特异性。即，无论将tRNA的反密码子部分改为任何序列，也不会影响氨基酰化效率。通过结合弹性酶，能够将任意的特殊氨基酸连接到具有任意的反密码子序列的tRNA上，因此能够将任意的特殊氨基酸与任意的密码子对应起来。从而，能够制备导入有任意的特殊氨基酸的文库。

以下，示出公知的结合弹性酶的结构（RNA序列）。

原型结合弹性酶（original flexizyme）Fx

[GGAUCGAAAGAUUUCCGCAGGCCCGAAAGGGUAUUGGCGUUAGGU-3',45nt]

二硝基苄结合弹性酶（dinitrobenzyl flexizyme）dFx

[5'-GGAUCGAAAGAUUUCCGCAUCCCCGAAAGGGUACAUGGCGUUAGGU-3',46nt]

增强型结合弹性酶（enhanced flexizyme）eFx

[5'-GGAUCGAAAGAUUUCCGCGGCCCCGAAAGGGGAUUAGCGUUAGGU-3',45nt]

氨基结合弹性酶（aminoflexizyme）aFx

[5'-GGAUCGAAAGAUUUCCGCACCCCCGAAAGGGGUAAGUGGCGUUAGGU-3',47nt]

结合弹性酶与天然的ARS蛋白酶不同，跳过作为氨基酰化反应的第一步骤的、生成高能中间体（氨基酰AMP）的过程，仅催化氨基酸底物的向tRNA的结合过程，因此作为氨基酸底物，需要使用事先被弱活化的氨基酸。即，跳过氨基酸的腺苷酰化，因此代替该过程而使用在进行酰化的羰基中具有弱活化的酯键的氨基酸衍生物。通常，酰基的活化通过具有吸电子基团的酯键实现，但是具有过强的吸电子基团的酯，不仅在水中发生水解，还同时引起向随机RNA的酰化。因此，作为氨基酸底物，需要使用弱活化的氨基酸，以在没有酶的状态下这些副反应难以发生。这种弱活化，例如可以使用AMP、氰甲基酯（cyanomethyl ester）、硫酯、或者具有硝基或氟等其他吸电子官能基团的苄基酯等而进行。

并且，氨基酸底物需要在氨基酸侧链或脱离基内具有芳香环，以被结合弹性酶识别。活化氨基酸酯，是具有如天然的氨基酰化反应中的氨基酰AMP那样的被弱活化的酯键，并且在氨基酸侧链或脱离基内具有芳香环的氨基酸底物。作为适宜的活化氨基酸酯的例子，可以举出，氨基酰-氰甲基酯（CME：cyanomethyl ester）、氨基酰-二硝基苄酯（DNB：3,5-dinitrobenzyl ester）或者氨基酰-4-氯苄基硫酯（CBT：p-chloro-benzyl thioester）等，但是不限于这些。

例如，在后述的实施例中，将Nα-乙酰基-L-苯丙氨酸（Ac-F）连接到人工构建的起始tRNA，进行向肽N末端的导入，同时，将侧链具有炔丙基氯的(s)-2-氨基-6-氯己-4-炔酸（(s)-2-amino-6-chlorohexy-4-ynoic acid）、(s)-2-氨基-7-氯庚-5-炔酸（(s)-2-amino-7-chlorohepto-5-ynoic acid）、(s)-2-氨基-8-氯庚-6-炔酸（(s)-2-amino-8-chlorohepto-6-ynoic acid）的三种氨基酸（请参照实施例中的表1下的结构式）分别连接到人工构建的延伸tRNA。对于这三种化合物，分别将(s)-2-氨基-6-氯己-4-炔酸DNB、(s)-2-氨基-7-氯庚-5-炔酸DNB、(s)-2-氨基-8-氯庚-6-炔酸DNB作为底物使用，混合dFx和tRNA，能够制备与这些化合物结合的tRNA。另一方面，对于Nα-乙酰基-L-苯丙氨酸，通过将Nα-乙酰基-L-苯丙氨酸CME作为底物使用，混合eFx和tRNA，能够制备Nα-乙酰基-L-苯丙氨酸结合tRNA。

[表3]

基于结合弹性酶的酰化反应，可以在溶液中进行，也可以利用使用固定在载体上的ARS核酶的柱（column）而进行反应。例如，如果翻译的反应规模（scale）在100μl以下的少量，则在溶液中进行基于结合弹性酶的tRNA的酰化，将对反应溶液进行乙醇沉淀的沉淀物(pellet)溶解于适宜的缓冲液（例如，1mM的醋酸钾、p

具有稳定的二级结构的肽和肽库以及它们的制造方法专利购买费用说明

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