专利摘要
本发明提供了一种新的万古霉素类化合物及其制备抗生素药物的应用。本发明提供的化合物为N-甲基无糖万古霉素。本发明提供的N-甲基无糖万古霉素为一种新的万古霉素类抗生素，虽然其抑菌能力略低于万古霉素，但在强酸性条件下，其水溶液不仅远较万古霉素稳定，而且能保持高稳定性，因此，可用于制备口服型抗生素药物。
说明书
技术领域技术领域
本发明属于糖肽类化合物领域，具体地说，涉及一种万古霉素类化合物。
技术背景背景技术
万古霉素(Vancomycin)是抗革兰氏阳性菌的一种糖肽类抗生素，由McCormick于1956年从东方拟无枝酸菌Amycolatopsis orientalis发酵液中分离得到，是目前临床上用于治疗甲氧西林耐金葡菌(MRSA)引起的严重感染疾病的首选药物，被国际抗生素专家誉为“人类对付顽固性耐药菌株的最后一道防线”和“王牌抗生素”。
然而万古霉素在酸性条件，特别是强酸性条件下不稳定，因此无法制备成口服药物使用，从而影响了万古霉素的应用，这使得开发新的、在酸性条件下，特别是胃部酸性条件下，稳定的万古霉素类抗生素化合物具有重要意义。
2000年，O’Brien等克隆了chloroeremomycin的N端甲基转移酶，并以去甲万古霉素，去甲无糖万古霉素七肽骨架等为底物进行催化反应，并在以去甲无糖万古霉素七肽骨架为底物的催化反应中，得到了单甲基化的无糖万古霉素七肽骨架，但未继续进行研究。
发明内容发明内容
本发明的目的在于，提供一种新的万古霉素类化合物，以便于用于制备更稳定的抗生素药物，特别是口服型抗生素药物。
本发明提供的万古霉素类化合物为N-甲基无糖万古霉素，该N-甲基无糖万古霉素结构如式(I)所示：
本发明还有一个目的在于，提供N-甲基无糖万古霉素用于制备抗生素药物的应用。
根据本发明的一个优选实施例，制备的药物为口服药物。
本发明提供的N-甲基无糖万古霉素为一种新的万古霉素类抗生素，虽然其抑菌能力略低于万古霉素，但在酸性条件下，其水溶液远较万古霉素稳定，且在pH为1时，仍能保持高稳定性，因此，可用于制备口服型抗生素药物。
附图说明附图说明
图1A为万古霉素标准品的HPLC图谱。
图1B为来自E.coli BL21(DE3)/pLYLH13的粗酶液催化无糖万古霉素的反应液HPLC图谱。
图2为实施例中制备的N-甲基无糖万古霉素的质谱图谱，其中2a为N-甲基无糖万古霉素的TOF MS ES+图谱，2b为N-甲基无糖万古霉素的高分辨质谱图谱。
图3a为实施例中制备的N-甲基无糖万古霉素的H1NMR图谱。
图3b为实施例中制备的N-甲基无糖万古霉素的C13NMR图谱。
图3c为实施例中制备的N-甲基无糖万古霉素的COSY图谱。
图3d为实施例中制备的N-甲基无糖万古霉素的DEPT图谱。
图3e为实施例中制备的N-甲基无糖万古霉素的HMBC图谱。
图3f为实施例中制备的N-甲基无糖万古霉素的HSQC图谱。
图3g为实施例中制备的N-甲基无糖万古霉素的NOESY图谱。
图4为N-甲基无糖万古霉素的结构图。
图5为温度变化对N-甲基无糖万古霉素和万古霉素水溶液稳定性的影响比较示意图。
图6为pH1时N-甲基无糖万古霉素和万古霉素水溶液的稳定性随时间的变化的比较示意图。
具体实施方式具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
在本发明的下述实施例中，使用的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)为ATCC11174、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)为ATCC9763、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)为ATCC43300、甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌(MSSA)为ATCC29213；使用的大肠埃希菌E.coli BL21(DE3)/pLYLH13通过以下方法构建：
PCR反应克隆得到万古霉素生物合成基因簇中的N端甲基转移酶基因vcm12，然后将vcm12基因片段连接到pET30a(+)载体中，获得vcm12表达载体pLYLH13。然后将pLYLH13转入E.coli BL21(DE3)中，获得目的表达菌株E.coli BL21(DE3)/pLYLH13，具体构建方法见申请号为200810201905.X的中国发明专利申请。
在本发明的下述实施例中，用于培养大肠埃希菌的培养基为LB培养基，其配方为：胰蛋白胨10g/L，酵母抽提物10g/L，NaCl 5g/L，pH 7.4；在LB培养基加入20g/L的琼脂粉，即可获得LB固体培养基；检定培养基为MH(Mueller-Hinton)培养基(购自青岛海博生物技术有限公司)。
在本发明的下述实施例中，使用的缓冲溶液C的配制方法如下：以H3PO4调节0.02mol/L的NaH2PO4的pH至4.0后，再与MeOH按体积比2∶3混合。
在本发明的下述实施例中，使用的万古霉素为Lilly公司的注射用盐酸万古霉素(稳可信)，无糖万古霉素参考文献K.C.Nicolaou et al.Total Synthesis ofVancomycin Aglycon[J].J.Am.Chem.Soc.1998，120：2622～2714中的方法制备，其余试剂均为市售分析纯或HPLC纯。
本发明主要是利用基因工程菌诱导表达N-甲基转移酶，然后用粗酶液对无糖万古霉素进行催化，并将酶反应液经大孔树脂吸附、中压反相制备分离纯化，获得一化合物，将该化合物经光谱分析和结构解析，确定为N-甲基无糖万古霉素，经检索，为一种新的化合物；对该新化合物进行抑菌活性和稳定性检测，确定其抑菌活性略低于万古霉素，但在酸性条件，特别是在强酸性条件下，其稳定性较万古霉素好，适合用作口服型抗生素药物。
实施例1、N-甲基转移酶的诱导表达
挑新鲜的表达菌株E.coli BL21(DE3)/pLYLH13的单克隆到添加有50μg/ml卡那霉素的LB培养基中，37℃过夜培养。取1ml菌液加入到含50μg/ml卡那霉素的100ml LB中，培养到OD600为0.6～0.8后，加入终浓度为1mmol/L的IPTG，于30℃诱导6h。离心收集菌体，超声破碎后，离心收集上清，获得粗酶液。
实施例2、粗酶液转化无糖万古霉素
使用实施例1获得的粗酶液，于25℃催化无糖万古霉素溶液反应24hrs，其反应条件如下：
反应体系为(1ml)：腺苷甲硫氨酸(SAM)2mmol/L 100μl；无糖万古霉素0.5mg/ml 300μl；粗酶液100μl，500μl 50mmol/L pH 7.5的Tris/HCl。
将反应获得的溶液，以HPLC检测，具体如下：
流动相配制：用0.2％的三乙胺溶液，磷酸调pH至3.2作为缓冲液。缓冲液与乙腈和四氢呋喃按92∶7∶1的体积比混合，摇匀，作为A液；缓冲液与乙腈和四氢呋喃按39∶60∶1的体积比混合，摇匀，作为B液，超声波脱气20min，备用。洗脱过程中，A液和B液的比例如表1所示。
色谱条件：色谱柱：DiamonsilTMC18，ODS，ID 4.6*200mm
柱温：30℃
检测器：DAD(HP1100)检测器
检测波长：240nm
流速：1ml/min
进样量：5μl
洗脱方法：梯度洗脱。
表1、洗脱过程中，A液和B液的比例
结果如图1所示，根据图1的结果，反应溶液中除了11.799min处的峰(即未反应完的无糖万古霉素)外，还在12.171min处出现了一个峰。
实施例3、反应液纯化
取实施例2中获得的反应液离心并收集上清，然后将离心上清使用大孔吸附树脂Amberlite XAD-1600柱吸附，并分别用水和不同浓度的乙醇水溶液梯度洗脱，并分部收集各梯度流出液，HPLC检测，合并目的组分，将合并的流出液减压浓缩和冷冻干燥，获得纯化粗品。
然后，将得到的粗品200mg溶于20ml缓冲溶液C中，然后上样至用缓冲溶液C预先平衡好的C18反相中压制备柱(流速：5ml/min)中，再用缓冲溶液C洗脱，并收集洗脱液，流出液通过254nm紫外吸收检测仪检测，分部收集有紫外吸收部分的流出液，HPLC进行检测，合并收集峰纯度大于94％的部分，将合并获得的收集溶液减压浓缩，XAD-1600树脂柱脱盐，获得纯度大于94％的白色样品80mg，经检测，该白色样品微溶于水，易溶于DMSO。
将纯化获得的样品用Q-TOF micro质谱仪(Waters公司)和Bruker AVANCE II400MHz核磁共振波谱仪检测，结果分别如图2-图3g所示，其中，ESI-MSm/z1157.3[M+H]+，HRESI-MS m/z 1157.3094[M+H]+(计算值C54H54C12N8O17，1157.3062)，然后通过对该化合物的DEPT、COSY、HSQC和HMBC谱分析，对其1H-NMR和13C-NMR信号峰进行了归属，获得1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)和13C-NMR(100MHz，DMSO-d6)数据，结果如表2所示。
表2、1H-NMR和13C-NMR数据
注：其中的qC为季碳。
根据上述检测结果，确定所获得的白色样品的结构如图4所示，该化合物为N-甲基无糖万古霉素。经检索，该化合物在现有技术中未见有报道，是一种新的化合物。
实施例4、最小抑菌浓度测定
在美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)准则下，使用常量稀释液体培养法(macrondilution broth procedure)测定N-甲基无糖万古霉素对于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)和甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌(MSSA)的最小抑菌浓度(MIC)，并以万古霉素作为平行对照。具体过程如下：
将化合物样品连续稀释在15×100mm无菌玻璃试管中的Mueller-Hinton培养液内，然后，接种每管含5×105CFU/ml的菌悬液，将试管置于37℃培养过夜。次日通过目测确定MIC，结果如表3所示。
表3、N-甲基无糖万古霉素对若干菌株的MIC
根据表3的结果，本发明的N-甲基无糖万古霉素的抗菌活性略低于万古霉素。
实施例5、抗生素稳定性试验
5.1、抗生素热稳定性测定
分别取抗生素(万古霉素和N-甲基无糖万古霉素)水溶液5ml，分成5份，分别在20、35、50、65、80℃下水浴保温1h后，将温度调节至25℃，HPLC进行检测(检测条件：缓冲液与乙睛和四氢呋喃按70∶29∶1的体积比混合，摇匀，作为B液，其它条件同实施例2)，以未经处理的相应的抗生素水溶液(25℃保温1h)为对照，并观察目的组分峰面积百分比(Area％)的变化，结果如图5所示，其中：
根据图5的结果，万古霉素水溶液和甲基无糖万古霉素水溶液在温度低于50℃时均较稳定，在温度高于50℃时均不太稳定，两者基本一致。
5.2、抗生素酸碱稳定性测定
将中性无离子水配制0.5mg/ml的抗生素溶液(万古霉素溶液和N-甲基无糖万古霉素溶液)，然后，用1mol/LHCl溶液调成pH为1.0的溶液，室温下静置0、2、4、6、8、24h后，再用1mol/L NaOH溶液慢慢调至抗生素溶液pH为7.0，HPLC进行检测，观察静置不同时刻时目的组分峰面积Area的变化，结果如图6所示。
图6的结果显示，0.5mg/ml的万古霉素水溶液(pH＝1)在室温放置时，目的组分逐渐变少，24h后目的组分从起初的峰面积2335.4急剧下降到43.4，几乎完全水解；而甲基无糖万古霉素水溶液目的组分变化幅度不大。
根据图6的结果，说明在强酸性条件下，甲基无糖万古霉素水溶液较万古霉素水溶液稳定。
根据上述结果，本发明提供的N-甲基无糖万古霉素为一种新的万古霉素类抗生素，虽然其抑菌能力略低于万古霉素，但在强酸性条件下，其水溶液不仅远较万古霉素稳定，而且能保持高稳定性，因此可以在人体或动物体的胃部酸性环境中保持其稳定性，适合用于制备口服型抗生素药物。
一种万古霉素类化合物专利购买费用说明
Q：办理专利转让的流程及所需资料
A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。
1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。
2：按规定缴纳著录项目变更手续费。
3：同时提交相关证明文件原件。
4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。
Q:专利著录项目变更费用如何缴交
A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式
Q：专利转让变更，多久能出结果
A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。
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